個體化用藥基因型檢測試劑盒及其應用方法
2023-05-22 12:38:01 2
專利名稱：個體化用藥基因型檢測試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發明屬於基因技術領域，涉及一種個體化用藥基因型檢測試劑盒及其應用方法。
背景技術：
藥物療效和不良反應的個體差異是目前藥物治療過程中的普遍現象。遺傳藥理學和藥物基因組學的研究進展表明藥物代謝酶、轉運體和受體(藥物作用靶點)的遺傳變異是造成個體藥物反應差異的主要原因。如細胞色素氧化酶CYP2D6發生基因突變，在相同劑量條件下，其所介導代謝的β受體阻滯劑在突變型純合子中的血藥濃度比野生型純合子高2-3倍，如不根據基因型調整劑量，突變型純合子患者可能發生嚴重的毒副反應；相反，如果β受體發生功能性突變，在突變型純合子個體中依然使用β受體阻滯藥，往往會導致治療失敗，這不僅延誤治療，而且導致了醫療資源的浪費。因此，根據個體與藥物治療相關的代謝酶、轉運體和受體的遺傳變異制定不同的治療方案，實現藥物治療個體化不僅是當今遺傳藥理學和臨床藥物治療學的發展方向，而且具有十分重要的社會意義和經濟意義。
要實現根據病患者基因型來指導對個體化用藥，就必須首先測試病患者的基因變異情況。目前有多種方法可用於檢測基因型，如測序、基因晶片、螢光PCR等。這些方法各有其優缺點。國內外用於實驗室的基因分型技術多為測序、螢光PCR、基因晶片等，這些檢測方法分別有價格昂貴、檢測速度慢、技術穩定性和結果可靠性較差、操作複雜等缺點，不易推廣到臨床應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對臨床上藥物治療的個體差異十分普遍，而個體化的藥物治療方案難以確定的狀況及現有技術中的不足之處，提供一種檢測個體藥物代謝與效應相關基因的基因型的個體化用藥基因型檢測試劑盒及其應用方法。
解決本發明技術問題所採用的技術方案是該個體化用藥基因型檢測試劑盒含有1、DNA抽提試劑，推薦使用Takara公司的DNA抽提試劑盒，2、PCR試劑，其中包括的引物有正向引物和反向引物，PCR試劑中的正向引物和反向引物能使PCR的擴增產物含有藥物代謝及效應相關基因突變位點的基因片斷，這些突變位點是在人群中的發生頻率較高，與臨床上針對某些疾病的藥物的個體差異關係密切，且對這些藥物的藥代動力學或藥效有明顯影響、有應用價值的突變位點(下向和反向引物擴增含有藥物代謝及效應相關的基因突變位點的DNA序列，根據藥物基因組學的研究結果，這些突變位點在人群中的發生率較高，且對某些疾病的臨床常用藥的藥代動力學或藥效有明顯影響，基因突變位點的確定是根據臨床上對某些疾病的常用藥查找與其藥效的個體差異關係密切，發生頻率比較高、有應用價值的突變位點)，還包括雙蒸水(ddH2O)、Taq酶、Taq酶附帶的PCR緩衝液、dNTP、MgCl2溶液；3、酶切試劑，包括內切酶、酶切緩衝液；4、電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩衝液5、標準品，包括野生型質粒DNA、突變型質粒DNA。
本試劑盒採用的是PCR-RFLP(聚合酶鏈式反應與限制性酶切片段長度多態性)方法。採用本試劑盒的實驗技術檢測基因型具有穩定、可靠、價格便宜、較快速的優點。適於推廣到臨床使用。
應用本發明個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進行PCR擴增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑進行凝膠電泳分析，之後判讀基因型，提供個體化用藥指導意見。
利用本發明試劑盒和檢測患者基因型的方法能根據所檢測的各種疾病患者基因型指導臨床個體化用藥，降低藥物不良反應發生率，減少患者調整用藥方案的次數，從而大大減輕患者的痛苦和經濟負擔。
圖1為使用本發明個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法流程圖具體實施方式
下面以潰瘍病個體化藥物治療基因型檢測試劑盒為實施例對本發明作進一步的詳細描述。
消化性潰瘍是一種常見病，多發生在胃或十二指腸球部，統稱為「潰瘍病」。潰瘍病多見於青壯年，或者生活節奏緊張，飲食不規律的人，約百分之八十的患者發病年齡在40歲以下，而這個年齡正處於精力充沛的階段，因此，潰瘍病的防治對於人們和社會都有重要的意義。根據大量統計數字，潰瘍病是引起上消化道出血最常見的疾病。中國人群中潰瘍病患病率為5～10％(男女患病率比例為3.6∶1)。潰瘍病的發病率呈上升趨勢。保守估計，我國潰瘍病患者人數超過了6千萬。減少胃酸分泌和抗幽門螺旋桿菌感染是目前和今後相當長時間內治療潰瘍病的主要途徑。拉唑類藥物具有強大的抑制胃酸分泌作用，在治療潰瘍病的藥物中佔有重要的位置。據統計，奧美拉唑可使90％的難治性潰瘍(病程經12周尚未治癒)癒合。然而，因代謝拉唑類藥物的CYP2C19酶存在基因變異，對於CYP2C19酶為弱代謝者的個體，在使用臨床常用劑量的條件下，其血藥濃度較高，治療效果明顯優於強代謝者。但是，又不能因此提高臨床藥物使用劑量，否則，會導致部分弱代謝者體內血藥濃度過高，發生嚴重的不良反應。因此，按照潰瘍病患者的基因型，給予合適的藥物劑量，是改善拉唑類藥物的療效，減少不良反應的有效手段，並最終達到提高潰瘍病患者治癒率的目的。
根據臨床上對潰瘍病人的常用藥查找與其代謝及藥效的個體差異關係密切的基因突變位點，並選擇在中國人中發生頻率比較高、有應用價值的2個基因突變位點CYP2C19*2和CYP2C19*3，製做檢測這2個突變位點的基因型檢測試劑盒。
潰瘍病個體化藥物治療基因型檢測試劑盒用途體外檢測個體細胞色素P450酶2C19的基因型。本試劑盒採用PCR技術體外擴增待測個體的DNA，對PCR產物進行限制性酶切片段長度多態性分析，從而得出待測個體CYP2C19的基因型。
檢測患者基因型測定原理PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)是利用兩條與DNA鏈互補並位於靶DNA兩側的寡核苷酸引物，和DNA聚合酶經酶促反應體外擴增特異性DNA片段的技術。它包括三個基本步驟(1)變性(Denature)目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈成單鏈DNA，以提供複製的模板；(2)退火(Anneal)加入的寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的靶序列通過氫鍵配對；(3)延伸(Extension)DNA模板-引物結合物在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理進行合成。由這三個基本步驟組成一輪循環，理論上每一輪循環後靶DNA的拷貝數增加一倍，這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環的模板，通常經30-35輪循環就可合成足夠量靶DNA。PCR產物可用於進一步分析。
人類基因組中存在許多限制性內切酶位點，用某種限制性內切酶對某一段基因消化時，會產生大小不同的特定片段即限制性片段。核苷酸缺失，重排或置換可使DNA分子中原有的某種限制性內切酶的識別位點發生改變，導致原有的酶切位點消失或形成新的內切位點。因此用相應的酶進行酶切後形成的DNA片段長度或數目多態性可以反映基因的變異情況。
本試劑盒通過對CYP2C19基因進行PCR擴增，然後用特異性的內切酶進行消化，得到與基因型相對應的不同長度DNA片段。再利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段長度多態性，從而得出個體的CYP2C19基因型。
潰瘍病個體化藥物治療基因型檢測試劑盒中試劑的組成和配製1.基因組DNA抽提試劑推薦採用寶生物的DNA提取試劑盒。
2.PCR反應體系CYP2C19*2擴增體系見表1PCR反應程序94℃預變性5分鐘，然後按94℃變性20秒鐘、53℃退火20秒鐘、72℃延伸20秒鐘循環35輪，最後一輪循環結束後，於72℃下延伸5分鐘，使反應產物擴增充分。所用的引物序列見表3中的P1(正向引物)、P2(反向引物)；CYP2C19*3擴增體系見表2PCR反應程序94℃預變性5分鐘，然後按94℃變性20秒鐘、53℃退火20秒鐘、72℃延伸20秒鐘循環35輪，最後一輪循環結束後，於72℃下延伸5分鐘，使反應產物擴增充分。
所用的引物序列見表3中的P3(正向引物)、P4(反向引物)；3.酶切體系2C19*2SmaI1μl，10×A Buffer2μl，0.1％BSA(小牛血清白蛋白)2μl，ddH2O5μl，DNA擴增產物10μl2C19*3BamHI1μl，10×B Buffer2μl，ddH2O7μl，DNA擴增產物10μl緩衝液(Buffer)成分見表4；4、電泳試劑(需自備試劑)3％瓊脂糖凝膠，電泳緩衝液(0.5×TBE)，溴化乙錠(100ug/ml)5μl，加樣緩衝液50μl；
5、標準品CYP2C19*2野生型質粒DNA 6μl(含有經引物P1、P2擴增的CYP2C19*2野生型PCR產物序列)CYP2C19*2突變型質粒DNA 6μl(含有經引物P1、P2擴增的CYP2C19*2突變型PCR產物序列)CYP2C19*3野生型質粒DNA 6μl(含有經引物P3、P4擴增的CYP2C19*3野生型PCR產物序列)CYP2C19*3突變型質粒DNA 6μl(含有經引物P3、P4擴增的CYP2C19*3突變型PCR產物序列)使用儀器微量移液槍及tip頭(槍頭)，DNA擴增儀(Thermo Hybaid)，電泳儀，電泳槽，臺式高速冷凍離心機，恆溫水浴鍋。
標本採集和處理a.靜脈血1ml；EDTA抗凝(7.2mg/5ml全血)，最好不用肝素抗凝；；b.如當日不進行DNA提取，保存於4℃條件下，有效期4天；保存於-80℃條件下，可保存兩個月。
使用本發明試劑盒檢測潰瘍病個體化藥物治療基因型方法(檢測步驟)如下1.基因組DNA提取以採用寶生物公司DNA提取試劑盒處理100μl的EDTA抗凝全血為例，準備1.5ml離心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均勻的100μl血液，加入到上述離心管中，立即振蕩幾秒鐘；室溫放置10分鐘以上，然後室溫(離心溫度低會對收量和純度有影響，請於20℃以上離心)條件下12,000rpm以上離心5分鐘，離心時，注意離心管在離心機裡的擺放方向統一；用移液槍小心地除去混合物，注意槍頭不要碰到離心管外側的內壁，插至離心管內側的底部，將混合物吸取乾淨；加入1ml的GenTLE Solution II，沿離心管內側的內壁加入；輕柔地上下顛倒離心管數次，室溫12,000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清；向離心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，輕微振蕩10秒鐘充分混合；室溫12,000rpm離心5分鐘，把上清移入另一個新的離心管中；加入等體積(500μl)的異丙醇，上下輕柔顛倒數次，直至看見白色絲狀DNA；4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉澱，4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；簡單幹燥沉澱；以10-50μl適當的緩衝液如TE緩衝液溶解沉澱。
2.PCR反應PCR各組分濃度A管CYP2C19*2基因擴增 B管CYP2C19*3基因擴增ddH2O 13.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μl10×PCRBuffer2.5μldNTP2μl dNTP2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μlgDNA1μl gDNA1μlC管空白對照 D管陰性對照ddH2O 14.8μlddH2O 13.8μl10×PCRBuffer 2.5μl 10×PCRBuffer 2.5μldNTP2μl dNTP 2μlP1 0.25μlP1 0.25μlP2 0.25μlP2 0.25μlTaq 0.2μl Taq 0.2μlMgCl25μl MgCl25μl陰性對照DNA 1μlE管陽性對照ddH2O 13.8μl10×PCRBuffer2.5μldNTP 2μlP1 0.25μlP2 0.25μlTaq0.2μlMgCl25μl陽性對照DNA 1μlPCR反應體系為25μl，在0.2ml離心管中進行，依次加入下列試劑ddH2O13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P2 0.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最後加酶和DNA；混勻後稍離心，按PCR反應程序開始擴增94℃預變性5分鐘，然後94℃變性20秒鐘，53℃退火20秒鐘，72℃延伸20秒鐘，循環35輪，最後一輪循環結束後，於72℃下延伸5分鐘，使反應產物擴增充分。
3.酶切分析A管將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應的限制性內切酶反應10×A緩衝液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O5μl使總體積為19μl，將管內溶液混勻後加入1μl SmaI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵，要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
混勻反應體系後，將eppendorf管置於適當的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時，使酶切反應完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應，置於冰箱中保存備用。
B管將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應的限制性內切酶反應10×B緩衝液2μl，再加入ddH2O7μl使總體積為19μl，將管內溶液混勻後加入1μl BamHI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
混勻反應體系後，將eppendorf管置於適當的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時，使酶切反應完全。
每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應，置於冰箱中保存備用。
4.瓊脂糖凝膠的製備及電泳a、取5×TBE緩衝液20ml加水至200ml，配製成0.5×TBE稀釋緩衝液，待用。
b、膠液的製備稱取2.5g瓊脂糖，置於200ml錐形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀釋緩衝液，放入微波爐裡(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為2.5％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附於瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發。
c、膠板的製備將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置於水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液5μl。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固後將剩餘的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現氣泡。待膠完全凝固後撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然後向槽內加入0.5×TBE稀釋緩衝液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起，阻礙緩衝液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應注滿緩衝液。
d、加樣取9μl酶解液與1μl 10×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相汙染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
e、電泳加完樣後，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在100V，時間30分鐘後停止電泳。
f、觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色後的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶。經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片後將相機固定於照相架上，採用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒(根據螢光條帶的深淺選擇)。
5.根據基因型檢測結果，提出潰瘍病個體化用藥方案，見表8。
質量控制設置陰陽性對照。正常操作條件下，陰性對照無電泳條帶，陽性對照則可顯示基因型特異的電泳條帶。
結果判斷方法用SmaI內切酶消化後，電泳結果與基因型關係見表5；用BamHI內切酶消化DNA後，電泳結果與基因型關係見表6試劑盒保存條件和效期保存條件如不打算立即試驗，上述體系請保存於4℃冰箱中注意事項a.PCR操作各階段應在不同的實驗室中進行，合理分隔實驗室將樣品的處理，配製PCR反應液，PCR循環擴增及PCR產物的鑑定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑑定應與其他步驟嚴格分開，最好能劃分標本處理區，PCR反應液製備區，PCR循環擴增區，PCR產物鑑定區。其實驗用品及吸樣槍應專用。
b.PCR操作每個階段使用專用的儀器和設備；c.PCR實驗中注意事項加樣時請注意先加容量最大的溶液，最後加酶及DNA；在加樣時，注意不要將tip頭過度的深入液面以下，以防tip頭帶出少量液體導致各種反應體系不準確。吸樣時則要慢，儘量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉汙染。
完成加樣後，請蓋緊eppendorf管蓋，以手指彈勻，在離心機上快速離心數秒，保證體系的穩定。
所用的酶在常溫下具有活性，在進行上述操作步驟時請在冰上進行。
所有的PCR試劑都應小量分裝，或預先配製好PCR反應液，然後小量分裝。可以將多組體系相同的溶液加入一個管中，混勻後再分別加入到各自管中。如要做10管PCR，則可按表7配製反應體系待混勻，分裝到10個管中(每管24μl)後，再分別加入gDNA 1μl。
d.使用自卸管(滴頭)移液器(加樣器)或填塞性滴管(滴頭)；e.在試劑和標本準備階段使用負壓超淨工作檯；f.穿工作服和一次性手套；g.在每批檢測中設置陰陽性對照實驗；h.具有專門經驗和培訓過的人員進行操作；i.使用一次性用品，並用10％次氯酸或70％酒精或紫外線燈處理工作檯和加樣器；j.EB是強誘變劑並有中等毒性，配製和使用時都應戴手套，並且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾汙了EB的容器或物品必須經專門處理後才能清洗或丟棄。
標準品使用說明標準品為經過提純的質粒DNA，濃度為0.02μg/μl。可按照上述PCR、酶切、電泳條件分析。
實驗室結果經過小批量樣本的驗證，PCR-RFLP檢測vs測序符合率為100％。見表9。
表1
表2
表3引物序列
4緩衝液成分
表5
表6
表7
表8
表9潰瘍病個體化藥物治療試劑盒驗證結果
權利要求
1.一種個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有(1)、DNA抽提試劑，(2)、PCR試劑，其中包括正向引物、反向引物、Taq酶、Taq酶附帶的PCR緩衝液、dNTP、MgCl2溶液、雙蒸水(ddH2O)，(3)、酶切試劑，包括內切酶、酶切緩衝液，(4)、電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩衝液，(5)、標準品，包括野生型質粒DNA、突變型質粒DNA。
2.根據權利要求1所述的個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於PCR試劑中的正向引物和反向引物能使PCR的擴增產物含有藥物代謝及效應相關基因突變位點的基因片斷，這些突變位點是在人群中的發生頻率較高，與臨床上針對某些疾病的藥物的個體差異關係密切，且對這些藥物的藥代動力學或藥效有明顯影響、有應用價值的突變位點。
3.根據權利要求1或2所述的個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於用於檢測潰瘍病個體基因中CYP2C19*2的PCR試劑中的正向引物(P1)為5』-CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3』反向引物(P2)為5』-GTAAACACACAACTAGTCAAT-3』
4.根據權利要求1或2所述的個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於用於檢測潰瘍病個體基因中CYP2C19*3的PCR試劑中的正向引物(P3)為5』-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3』反向引物(P4)為5』-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3』
5.根據權利要求1或2或3所述的個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於酶切試劑中的內切酶為SmaI內切酶、BamHI內切酶；酶切緩衝液為
6.一種應用個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進行PCR擴增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑，製備瓊脂糖凝膠，進行凝膠電泳分析，之後判讀基因型，提供個體化用藥指導意見。
7.根據權利要求6所述的應用個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是檢測潰瘍病個體化藥物治療基因型步驟中DNA提取採用寶生物公司DNA提取試劑盒處理100μl的EDTA抗凝全血準備1.5ml離心管，加入GenTLE Solution I 500μl；把混合均勻的100μl血液，加入到上述離心管中，立即振蕩幾秒鐘；室溫放置10分鐘以上，然後室溫(離心溫度低會對收量和純度有影響，請於20℃以上離心)條件下12,000rpm以上離心5分鐘，離心時，注意離心管在離心機裡的擺放方向統一；用移液槍小心地除去混合物，注意槍頭不要碰到離心管外側的內壁，插至離心管內側的底部，將混合物吸取乾淨；加入1ml的GenTLE Solution II，沿離心管內側的內壁加入；輕柔地上下顛倒離心管數次，室溫12,000rpm以上離心2分鐘，用移液槍小心地除去上清；向離心管中加入GenTLE SolutionIII 500μl，輕微振蕩10秒鐘充分混合；室溫12,000rpm離心5分鐘，把上清移入另一個新的離心管中；加入等體積(500μl)的異丙醇，上下輕柔顛倒數次，直至看見白色絲狀DNA；4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；加入1ml的70％乙醇清洗沉澱，4℃，12,000rpm離心5分鐘，小心除去上清；簡單幹燥沉澱；以10-50μl適當的緩衝液如TE緩衝液溶解沉澱。
8.根據權利要求7所述的應用個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是PCR反應體系為25μl，在0.2ml離心管中進行，依次加入下列試劑ddH2O 13.8μl，MgCl25μl，Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，P1 0.25μl，P20.25μl，Taq 0.2μl，gDNA 1μl，最後加酶和DNA；混勻後稍離心，按PCR反應程序開始擴增94℃預變性5分鐘，然後94℃變性20秒鐘，53℃退火20秒鐘，72℃延伸20秒鐘，循環35輪，最後一輪循環結束後，於72℃下延伸5分鐘，使反應產物擴增充分。
9.根據權利要求8所述的應用個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是酶切分析A管將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應的限制性內切酶反應10×T緩衝液2μl，0.1％BSA2μl，再加入ddH2O 5μl使總體積為19μl，將管內溶液混勻後加入1μl SmaI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關鍵，要防止錯加，漏加，使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低，混勻反應體系後，將eppendorf管置於適當的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時，使酶切反應完全，每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應，置於冰箱中保存備用；B管將清潔乾燥並經滅菌的eppendorf管(最好0.2ml)編號，用微量移液槍分別加入DNA 10μl和相應的限制性內切酶反應10×K緩衝液2μl，再加入ddH2O7μl使總體積為19μl，將管內溶液混勻後加入1μl BamHI酶液，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機甩一下，使溶液集中在管底。要防止錯加，漏加。使用限制性內切酶時應儘量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低，混勻反應體系後，將eppendorf管置於適當的支持物上(如插在泡沫塑料板上)，30℃水浴保溫4小時，使酶切反應完全，每管加入2μl0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混勻，以停止反應，置於冰箱中保存備用。
10.根據權利要求9所述的應用個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是瓊脂糖凝膠的製備及電泳為a、取5×TBE緩衝液20ml加水至200ml，配製成0.5×TBE稀釋緩衝液，待用，b、膠液的製備稱取2.5g瓊脂糖，置於200ml錐形瓶中，加入100ml0.5×TBE稀釋緩衝液，放入微波爐裡或電爐上加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為2.5％瓊脂糖凝膠液，加熱過程中要不時搖動，使附於瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液，加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發，c、膠板的製備將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏，寬約1cm，緊密封住，將封好的膠槽置於水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液5μl，用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固後將剩餘的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現氣泡，待膠完全凝固後撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然後向槽內加入0.5×TBE稀釋緩衝液至液面恰好沒過膠板上表面，因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起，阻礙緩衝液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應注滿緩衝液，d、加樣取9μl酶解液與1μl 10×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量，每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相汙染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿，e、電泳加完樣後，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在100V，時間30分鐘後停止電泳，f、觀察和拍照在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色後的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶，經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片後將相機固定於照相架上，採用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒，根據螢光條帶的深淺選擇。
全文摘要
本發明屬於基因技術領域，涉及一種個體化用藥基因型檢測試劑盒及其應用方法。個體化用藥基因型檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有(1)DNA抽提試劑，(2)PCR試劑，其中包括正向引物、反向引物，正向引物和反向引物能使PCR的擴增產物為含有藥物代謝及效應相關基因突變位點的基因片斷。(3)酶切試劑，包括內切酶、酶切緩衝液，(4)電泳試劑，包括瓊脂糖、溴乙錠、加樣緩衝液，(5)標準品，包括野生型質粒DNA、突變型質粒DNA。應用本發明個體化用藥基因型檢測試劑盒檢測患者基因型的方法，其特徵是取患者外周血1～2ml，使用試劑盒中的DNA抽提試劑提取DNA，用試劑盒中的PCR試劑進行PCR擴增，用試劑盒中的酶切試劑作限制性內切酶消化，再用試劑盒中的電泳試劑，製備瓊脂糖凝膠，進行凝膠電泳分析，之後判讀基因型，提供個體化用藥指導意見。
文檔編號G01N27/447GK1690702SQ200410023138
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月23日 優先權日2004年4月23日
發明者周宏灝, 趙震宇 申請人:周宏灝, 趙震宇