體外誘導B型肝炎病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞的方法
2023-05-22 12:44:31 1
專利名稱：體外誘導B型肝炎病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞的方法
技術領域：
本發明屬生物技術的細胞生物學和免疫學等領域，涉及以HBV細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)表位肽包被人工抗原提呈細胞(artificial antigen-presentingcells，aAPC)在體外誘導HBV特異性CTL，用於殺傷表達HBV抗原的細胞。
背景技術：
慢性B型肝炎病毒感染的治療仍然是醫學界面臨的重大難題，目前抗HBV治療的藥物還不能徹底清除病毒，如何有效清除HBV依然是B型肝炎治療研究的熱點。(I)HBV特異性細胞毒T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)是機體清除 HBV的重要因素。研究多克隆、多特異性、強應答的特異性CTL的製備方法，對慢性B型肝炎的治療具有重要意義。已有研究表明，HBV特異性CTL是機體清除HBV的重要因素急性B型肝炎患者清除HBV主要由⑶8+CTL介導，CTL可通過致肝細胞溶解和/或非溶解兩條途徑清除肝細胞內的HBV(尤其是HBV cccDNA)，發揮抗病毒效應。急性B型肝炎患者體內的CTL常為多克隆、多特異性、強應答及高IFN-Y分泌的。相反慢性B型肝炎患者的HBV持續感染與宿主T細胞免疫應答不足相關。研究發現，慢性B型肝炎患者體內抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)的抗原提呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信息傳遞給機體的免疫系統，因此慢性B型肝炎患者體內的特異性CTL常表現為寡特異性、弱應答。由此可見，過繼輸入足夠量的多克隆、多特異性、強應答的特異性CTL來清除病毒，可與目前抗病毒治療相互補充，解決不能徹底清除肝細胞內病毒的問題。(2) aAPC是用人工的方法模擬APC)的功能——T淋巴細胞活化信號，可在體外活化特異性T淋巴細胞。目前常用的方法是在磁珠表面交聯抗CD^單克隆抗體(mAb)和MHC I-Ig 抗原肽複合物，該磁珠可以誘導活化抗原肽特異性的CTL。由於aAPC具有較高的可操控性，可人為控制MHC抗原肽複合物，從而實現對CD8+T淋巴細胞活化的調控，並有活化條件較均一，質量易控制，T細胞活化增殖周期短等優點。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種體外誘導HBV特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，採用該方法可以用於擴增抗HBV的T淋巴細胞。為了解決上述技術問題，本發明提供一種體外誘導B型肝炎病毒特異性細胞毒性 T淋巴細胞的方法，其特徵是包括以下步驟1)、製備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC 採用MHC I-Ig和抗OT^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗CD28 mAb 包被在磁珠上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；2)、表位肽負載aAPC
MHC I-Ig和抗⑶觀mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配製成濃度為20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌後的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC ；負載的表位肽的序列為以下任意一個 FLPSDFFPSV ；②ILCWGgLMTL;③QLLWFHISCL;④TLATWYGVNL;⑤YLVSFGVWIR;⑥SWLSLLVPFV;⑦FLLSLGIHLN;⑧FLLTRILTIP ；(9) ILSTLPETTV ；⑩NLEDPASRDL ；3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL 分離HLA_A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞；將 ⑶8+T細胞與負載抗原肽的aAPC在培養基中37°C，5% C02培養刺激3 4周，所述培養基 % OpTmizer T-Cell Expansion SFM serum free, 2% heated inactivated humanserum, 100-200IU IL-2 ；再以磁鐵吸附分離抗原特異性CTL ；對所獲得的抗原特異性CTL採用Tetramer染色法測定其數量螢光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽複合物結合形成四聚體 (Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合後，通過流式細胞儀進行檢測。採用本發明的方法可以用於擴增抗HBV的T淋巴細胞。
具體實施例方式1)製備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC 採用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗⑶觀mAb 包被在磁珠(Dynabeads M-450，購自invitrogen)上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；具體方法滅菌的0. IM硼酸鹽緩衝液洗滌磁珠兩次，使磁珠與1 1混合的 HLA-A2-Ig和anti-CD28 mAb9. 3 (抗⑶沘的單克隆抗體，購買)在旋轉器上4°C孵育Mh。 用洗磁珠緩衝液洗滌兩次，再在含有洗磁珠緩衝液中孵育Mh，然後其去洗液，加入新鮮的緩衝液。製備的aAPC最後每個磁珠含有0. 9\105分子的!11^42-化和1. 9 X IO5 anti-OT^ mAb 9. 3分子。製備好的磁珠4°C可保存3個月。包被後的磁珠即為aAPC。2)、表位肽負載aAPC MHC I-Ig和抗⑶觀mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配製成濃度為20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌後的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC ；
負載的表位肽的序列可選用以下任意一條①FLPSDEFPSV，即PheLeu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val (SEQ ID NO :1)；②ILCWGgLMTL ；③QLLWFfll SCL ；④TLATWYGVNL ；⑤YLVSFGVWIR ；⑥SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRILTIP;⑨ILSTL￡ETTV ；⑩NLEDPASRDL。在本實施例中選用的是第①條。3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL 分離HLA_A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞(德國milteny公司產品「CD8+T Cell Isolation Kit」，按試劑盒說明書操作)；將 ⑶8+T細胞與負載抗原肽的aAPC在培養基中37°C，5% C02培養刺激3 4周，所述培養基為 0pTmizer T-Cell Expansion SFM serum free (Gibco),2 % heated inactivated humanserum(Gibco)，100-200IU IL-2 ；再以磁鐵(DynaMag-2，Dynabeads)吸附分離抗原特異性CTL(按使用說明書操作)。對所獲得的抗原特異性CTL採用Tetramer染色法測定其數量螢光素標記的鏈親和素(購買)與4個生物素標記的MHC-肽複合物(委託商業公司合成)結合形成四聚體(Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性 CTL上的TCR結合後，通過流式細胞儀進行檢測。抗原特異性CTL比例在10%以上，較對照組提高30%以上。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.體外誘導B型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，其特徵是包括以下步驟1)、製備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC採用MHC I-Ig和抗CD^mAb包被磁珠用直接包被法將MHC I-Ig和抗CD^mAb包被在磁珠上，構建成可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC ；2)、表位肽負載aAPCMHC I-Ig和抗CD^mAb包被的aAPC經PBS洗滌，以PBS將表位肽分別配製成濃度為 20 40 μ g/ml多肽溶液，再將洗滌後的aAPC以4 8X 108/ml濃度重懸到所述多肽溶液中，得負載抗原肽的aAPC;負載的表位肽的序列為以下任意一個 ① FLPSDFFPSV ； (2) ILCffGELMTL ； ③ QLLffFHISCL ； @ TLATWYGVNL ； YLVSFGVWIR ； SWLSLLVPFV ；⑦FLLSLGIHLN ；⑧FLLTRILTIP ； @ ILSTL￡ETTV ； ⑩ NLEDPASRDL ；3)、負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL分離HLA-A*0201正常人外周血PBMC細胞，以MACS技術分選獲得⑶8+T細胞；將⑶8+T 細胞與負載抗原肽的aAPC在培養基中37°C，5% C02培養刺激3 4周，所述培養基為 OpTmiζer T-Cell Expansion SFM serum free, 2% heated inactivated humanserum, 100-200IU IL-2 ；再以磁鐵吸附分離抗原特異性CTL ；對所獲得的抗原特異性CTL採用Tetramer染色法測定其數量 螢光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽複合物結合形成四聚體 (Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合後，通過流式細胞儀進行檢測。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導B型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，包括以下步驟1)製備可負載任意多肽的人工抗原提呈細胞aAPC；2)表位肽負載aAPC；3)負載抗原肽的aAPC體外誘導HBV抗原特異性CTL；對所獲得的抗原特異性CTL採用Tetramer染色法測定其數量螢光素標記的鏈親和素與4個生物素標記的MHC-肽複合物結合形成四聚體(Tetramer)，得MHC-肽四聚體；MHC-肽四聚體與抗原特異性CTL上的TCR結合後，通過流式細胞儀進行檢測。採用該方法可以用於擴增抗HBV的T淋巴細胞。
文檔編號C12N5/0783GK102168066SQ20111003332
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月31日 優先權日2011年1月31日
發明者朱海紅 申請人:浙江大學