具有抗腫瘤和抗毒活性的提取物的製作方法

2023-05-22 18:51:21 2

專利名稱：具有抗腫瘤和抗毒活性的提取物的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域。本發明的第一方面涉及從植物白花牛角瓜(Calotropisprocera)中提取的具有藥理活性的、特別是具有抗腫瘤活性和/或抗毒活性的提取物以及從中分離的活性化合物。本發明的第二方面涉及獲得所述提取物的方法。本發明的第三方面還涉及用於癌症治療的藥物組合物，該組合物包含有效量的所述提取物或其活性化合物。本發明的第四方面涉及所述提取物或其活性化合物作為藥物的應用以及所述提取物或其活性化合物在製備抗癌藥中的應用。
背景技術：
當某些組織發生基因組突變幹擾了細胞周期動力學使細胞增殖過度或細胞死亡減少時就會產生腫瘤。這種幹擾可導致發生基因組突變的細胞群出現無限制地生長。這種突變細胞群中的某些細胞可轉化成具有血管形成表型的細胞，這些細胞可作為健康組織內內皮細胞的補充，導致惡性腫瘤組織持續生長。隨後，某些細胞從惡性腫瘤組織內遷移出來並增殖成新的組織，其遷移的途徑主要依靠血管或淋巴管。這一過程也被稱為轉移過程。
目前在醫院中用於治療癌症病人的大多數藥物對癌細胞動力學特性，即對細胞增殖的直接靶向性或高或低。這種抗腫瘤藥物的作用機制基本上都是通過作用於細胞動力學來破壞腫瘤細胞的增殖。這些藥物包括烷化劑、嵌入劑、抗代謝藥物等，其中大多數是靶向於DNA或調節DNA複製和延伸過程的酶。這些藥物可攻擊DNA。
這些藥物的一個主要缺點是沒有選擇性，即這些藥物不能區分正常細胞和惡性細胞。其作用原理基於這樣一個事實快速增殖的細胞如癌細胞與增殖速度慢的細胞如正常細胞相比，其DNA對這類藥物更敏感。但是，快速生長的腫瘤並不總是具有高水平細胞增殖的腫瘤。快速生長的腫瘤也可能包括細胞增殖水平比其來源的正常細胞群增殖水平還低的腫瘤，對於這些類型的快速生長的腫瘤來說，上述藥物是無效的。
另外，通過改變細胞動力學方式治療腫瘤的絕大多數藥物都具有毒性，甚至毒性還很高，即對正常細胞、組織和器官有許多有害的副作用，這就使其用於臨床時給每個患者使用的劑量相對較低。另外，為了達到顯著的抗癌療效就需要聯合使用幾種這樣的化合物進行聯合化療。顯然，這種抗癌藥聯合化療會增加治療的毒性效應，也限制了其使用的範圍。
現在發現某些天然來源的抗癌藥，如微管蛋白抑制劑化合物，其作用機制不是作用於細胞動力學。這些藥物的目的在於阻止癌細胞的遷移，這些癌細胞從原發腫瘤中逃逸出來首先侵入到臨近組織形成轉移瘤。但是，到目前為止，已知這種類型的化合物也具有很大的毒副作用，因此也限制了其用於長期治療。
因此，在本領域中急需找到至少能克服上述藥物的某些缺點的抗癌藥。因此，本發明的一個主要目的就是提供這樣的抗癌藥。具體來說，本發明的目的就在於提供副作用很低的抗癌藥。
發明概述本發明的一個實施方案是白花牛角瓜植物的提取物，其特徵在於，所述提取物具有藥理活性，特別是抗毒活性。
本發明的另外一個實施方案是利用提取方法獲得上述提取物，該方法包括如下步驟a)在脂肪族醇中提取所述白花牛角瓜植物的起始原料，所述起始原料選自果實、地上部分、地下部分或其混合物，利用所述醇溶解起始原料獲得所述原料的脂肪族醇懸液，攪拌所述懸液，用多孔玻璃過濾所述懸液從而得到第一濾液和第一固體組分；b)用脂肪族醇提取所述第一固體組分從而得到第二濾液和第二固體組分；c)混合所述第一濾液和第二濾液得到混合濾液，在真空下蒸發所述混合濾液從而得到所述提取物。
本發明的另外一個實施方案是利用提取方法獲得上述提取物，該方法包括如下步驟a)研磨白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物。
本發明的另外一個實施方案是利用提取方法獲得上述提取物，該方法包括如下步驟
a)研磨白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，以及g)收集第一組分，蒸發所述組分得到含有生物活性組分的膠狀物。
本發明的另外一個實施方案是利用提取方法獲得上述提取物，該方法包括如下步驟a)研磨白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，g)收集含有生物活性組分的第一組分，h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的濃縮組分得到兩個組分，以及i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到含有生物活性成分的第三組分。
本發明的另外一個實施方案是一種組合物，其中包含-上述白花牛角瓜提取物，和-至少一種治療性化合物和/或物理療法，其中的化合物和/或物理療法對正常的非癌細胞、組織或器官的具有一定毒副作用。
本發明的另外一個實施方案是一種產品，其中包含-上述白花牛角瓜提取物，和-至少一種治療性化合物和/或物理療法的產品，其中的化合物和/或物理療法對正常的非癌細胞、組織或器官具有一定毒副作用，
組合物二者可同時、分別或依次給予患者。
本發明的另外一個實施方案是上述的組合物或上述的產品，其中，所述提取物含有至少兩種選自如下一組的活性化合物馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。
本發明的另外一個實施方案是上述的組合物或上述的產品，其中，所述提取物至少還含有表1中所列的一種化合物。
本發明的另外一個實施方案是上述的組合物或上述的產品，其中的提取物治療性化合物的重量比為0.001∶1-1000∶1。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品作為藥物的應用。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品作為腫瘤治療藥物的應用。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述腫瘤選自乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、血癌。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中還包含一種或多種其他的治療性化合物。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物是抗癌藥。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物選自阿黴素、愛克蘭(alkeran)、阿糖胞嘧啶、博來黴素、biCNU、白消安、CCNU、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、癌得星(cytoxan)、柔紅黴素、DTIC、5-FU、氟達拉濱、吉西他濱(注射用鹽酸吉西他濱)、赫賽汀(herceptin)、六甲密胺、羥脲、伊達比星、異環磷醯胺、依立替康(鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑，CPT-11)、克拉立平、氨甲蝶呤、光輝黴素、絲裂黴素、二羥基蒽酮、武活龍、諾維本、氮芥、奧沙利鉑、美羅華(rituxan)、STI-571、鏈脲菌素、紫杉醇、泰索帝、託泊替康(鹽酸託泊替康針劑)、硫酸長春鹼、長春新鹼、VP-16、希羅達(卡培他濱)或zevelin。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物選自阿黴酮(adriamycine)、長春新鹼、喜樹鹼和奧沙利鉑。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性抗體或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性激素或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性肽或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物，該組合物還包含藥學上可接受的載體，或者上述產品，其中，組合物和/或治療性化合物還包含藥學上可接受的載體。
本發明的另外一個實施方案是上述白花牛角瓜提取物在製備減輕一種或多種治療性化合物的副作用的藥物中的應用。
本發明的另外一個實施方案是上述白花牛角瓜提取物在製備增加一種或多種治療性化合物使用劑量的藥物中的應用。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物具有抗癌活性。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物選自阿黴素、愛克蘭、阿糖胞嘧啶、博來黴素、biCNU、白消安、CCNU、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、癌得星、柔紅黴素、DTIC、5-FU、氟達拉濱、吉西他濱(注射用鹽酸吉西他濱)、赫賽汀、六甲密胺、羥脲、伊達比星、異環磷醯胺、依立替康(鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑，CPT-11)、克拉立平、氨甲蝶呤、光輝黴素、絲裂黴素、二羥基蒽酮、武活龍、諾維本、氮芥、奧沙利鉑、美羅華、STI-571、鏈脲菌素、紫杉醇、泰索帝、託泊替康(鹽酸託泊替康針劑)、硫酸長春鹼、長春新鹼、VP-16、希羅達(卡培他濱)或zevelin。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物選自阿黴酮、長春新鹼、喜樹鹼和奧沙利鉑。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物是細胞毒性抗體或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物是細胞毒性激素或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物是細胞毒性肽或其片段。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述治療性化合物是治療性輻射。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述提取物含有至少兩種選自如下一組的活性化合物馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述提取物至少還含有表1中所列的一種化合物。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述提取物在給予所述治療性化合物前給藥。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述提取物在給予所述治療性化合物後給藥。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中，所述提取物在給予所述治療性化合物的同時給藥。
本發明的另外一個實施方案是上述提取物的用途，其中的提取物治療性化合物的重量比為0.001∶1-1000∶1。
本發明的另外一個實施方案是獲得含有生物活性成分的提取物的提取方法，該方法包括如下步驟a)在脂肪族醇中提取所述白花牛角瓜植物的起始原料，所述起始原料選自果實、地上部分、地下部分或其混合物，利用所述醇溶解起始原料獲得所述原料的脂肪族醇懸液，攪拌所述懸液；用多孔玻璃過濾所述懸液從而得到第一濾液和第一固體組分；b)用脂肪族醇提取所述第一固體組分從而得到第二濾液和第二固體組分；c)混合所述第一濾液和第二濾液得到混合濾液；以及d)在真空下蒸發所述混合濾液從而得到所述提取物。
本發明的另外一個實施方案是獲得含有生物活性成分的提取物的提取方法，其中的活性成分存在於白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根內，該方法包括如下步驟a)研磨起始原料白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，該方法還包括如下步驟d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，
e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，以及g)收集含有生物活性成分的第一組分，蒸發洗脫液得到所述提取物。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，該方法還包括如下步驟h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的組分得到兩個組分，i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到含有生物活性成分的第三組分。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟b)在20-80℃下進行。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，所述步驟b)重複1-5次。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟b)的持續時間為4-48小時。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟d)的固相是矽膠。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟d)的洗脫液是二元洗脫液，洗脫液中兩種組分的比例在100∶0到0∶100之間。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，所述二元洗脫液的組分包含一種醇溶劑和一種非極性溶劑。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟e)在20-50℃下進行。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟f)的固相是矽膠。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟f)的洗脫液是二元洗脫液，洗脫液中兩種組分的比例在100∶0到0∶100之間。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，所述二元洗脫液的組分包含一種醇溶劑和一種非極性溶劑。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中二元洗脫液兩種組分-非極性組分∶極性組分之比為50∶50到100∶0。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟h)的溶劑是甲醇。
本發明的另外一個實施方案是上面所述的提取方法，其中，步驟e)在20-50℃下進行。
本發明的另外一個實施方案是通過上述提取方法所分離的活性提取物。
本發明的另外一個實施方案是上述活性提取物作為藥物的應用。
本發明的另外一個實施方案是上述活性提取物作為腫瘤治療藥物的應用。
本發明的另外一個實施方案是一種治療腫瘤的方法，該方法包括給予需要這種治療的患者以上面所述的藥物組合物或上面所述的產品。
本發明的另外一個實施方案是上述的方法，其中，所述腫瘤選自乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、血癌。
本發明的另外一個實施方案是上述組合物或上述產品，其中，所述治療性化合物是輻射。
本發明的另外一個實施方案是試劑盒，該試劑盒包括上述白花牛角瓜提取物以及裝有治療性化合物的容器。
發明詳述本發明涉及白花牛角瓜植物的提取物。在第一實施方案中，本發明涉及植物白花牛角瓜的具有藥理活性的提取物，特別是具有抗腫瘤活性和/或抗毒活性的提取物。令人驚喜的是，本發明的提取物中至少有一個既有抗腫瘤活性，又有抗毒活性。
本發明所用的術語「抗腫瘤活性」是指至少一種提取物或從提取物中分離的化合物所具有的體外及體內抗腫瘤效應。抗腫瘤效應主要包括而不限於細胞生長的急劇下降及促凋亡效應。更重要的是，本發明的提取物對多種類型的腫瘤都具有抗腫瘤活性，如乳腺癌、黑色素瘤或淋巴瘤以及其他腫瘤。
本發明的提取物的另外一個特徵是其抗毒活性。術語「抗毒活性」是指本發明的提取物或從提取物中分離的化合物所具有的減弱或反轉治療性化合物或治療方案的效應的能力。本文所用的術語「治療性化合物」是指對正常的(即非癌)細胞、組織或器官能產生一定毒副作用的化合物。因此術語治療性化合物也包括用於治療特定疾病但是具有一定毒副作用的化合物、藥物、物理療法或治療方案。這種副作用是本領域技術人員所熟知的，包括而不限於疲倦、噁心、嘔吐、褥瘡、口瘡、乾性皮膚、皮膚過敏、脫髮、紅細胞和白細胞數降低。這種治療性化合物包括而不限於化療藥、輻射、抗體和激素。
本發明可用的治療性化合物包括用於化療的或具有細胞毒性的那些化合物，其中包括而不限於阿黴素、愛克蘭、阿糖胞嘧啶、博來黴素、biCNU、白消安、CCNU、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、癌得星、柔紅黴素、DTIC、5-FU、氟達拉濱、吉西他濱(注射用鹽酸吉西他濱)、赫賽汀、六甲密胺、羥脲、伊達比星、異環磷醯胺、依立替康(鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑，CPT-11)、克拉立平、氨甲蝶呤、光輝黴素、絲裂黴素、二羥基蒽酮、武活龍、諾維本、氮芥、奧沙利鉑、美羅華、STI-571、鏈脲菌素、紫杉醇、泰索帝、託泊替康(鹽酸託泊替康針劑)、硫酸長春鹼、長春新鹼、VP-16、希羅達(卡培他濱)或zevelin。
在本發明的另外一個方面，治療性藥物包含一種或多種來源於本發明的提取物的抗癌藥。本發明中具有潛在抗癌活性的化合物是指從白花牛角瓜中提取的任何化合物，如馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。
在本發明的另外一個實施方案中，抗癌化合物是指從白花牛角瓜中提取的任何化合物，如表2中所示的2″oxo-voruscharin及其衍生物。
在本發明的另外一個方面，治療性藥物是本發明的提取物。所述提取物可能是與具有抗毒活性的提取物一樣的提取物。另外，所述提取物可能是與具有抗毒活性的提取物一樣的提取物，但是每種提取物中都不包含一種或多種活性化合物。另外，所述提取物可能是與具有抗毒活性的提取物一樣的提取物，但是每種提取物中都包含一種或多種活性化合物。另外，所述提取物可能是與具有抗毒活性的提取物一樣的提取物，但是每種提取物中的一種或多種活性化合物的濃度不同。
在本發明的另外一個方面，治療性化合物是物理治療，如輻射。所述輻射是指任何可用於治療的輻射。例如，輻射可以是用於抑制腫瘤生長、作為骨髓移植手術一部分的全身輻射等。輻射也可以是用於診斷的輻射，如X射線或放射性標記物。
在本發明的另外一個方面，治療性化合物是抗體或其片段。所述抗體具有細胞毒活性。治療性抗體的例子包括而不限於赫賽汀R(HerceptinR)、Prostascint、利妥昔單抗(Rituximab)和曲妥單抗(Trastuzumab)。
在本發明的另外一個方面，治療性化合物是激素或其片段。所述激素具有細胞毒活性。治療性激素的例子包括而不限於布舍瑞林、氟羥甲基睪丸素、氟他胺、福美斯坦、諾乙雄龍、炔諾酮、氫化潑尼松、潑尼松和tamoxifene。
在本發明的另外一個方面，治療性化合物是肽或其片段。所述肽具有細胞毒活性。
抗體、激素或肽的片段是指包含抗體、激素或肽的一部分並且能識別完整抗體、激素或肽的靶位的肽。片段還能識別完整抗體、激素或肽的靶位。這一部分可以包括不改變該部分的靶位識別能力的胺基酸替代、缺失或插入。替代、缺失或插入的胺基酸數目可以是少於2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400或500。
在本發明的另外一個方面，由於提取物的抗毒活性使治療性化合物可以較高的劑量給藥。通過給予較高劑量的治療性化合物可以使腫瘤得到更快速有效地治療。接受較高劑量治療性化合物和本發明提取物的患者可得益於治療性化合物毒副作用的降低。
在本發明的另外一個方面，由於提取物的抗毒活性使治療性化合物可以聯合給藥。聯合治療可同時針對腫瘤的不同方面，從而使治療更有效。通過與本發明的提取物聯合，患者發生副作用的程度將降低，從而得益於聯合治療的效果。
在另外一個實施方案中，本發明涉及從提取物中分離的活性化合物。術語提取物的「活性化合物」或「活性成分」用於本文中意義相同，是指存在於提取物中的、與提取物上述活性的至少一個活性一樣的化合物。
在另外一個實施方案中，本發明涉及獲得植物白花牛角瓜提取物的方法。
由於本發明中至少有一個提取物具有抗腫瘤活性，因此本發明的提取物特別適用於治療如腫瘤一樣的疾病。因此，在另一方面，本發明涉及含有上述的一種提取物或提取物中的至少一種活性化合物的藥物組合物。
此外，由於本發明的提取物還具有抗毒活性，因此，本發明的提取物也特別適用於和其他具有一定毒副作用的治療性化合物如其他藥物聯合使用。因而在另外一個實施方案中本發明涉及含有上述的一種提取物或提取物中的至少一種活性化合物以及第二種具有一定毒副作用的藥理活性化合物的藥物組合物。
此外，本發明涉及一種所述提取物和/或提取物中的至少一種活性化合物作為藥物的應用。本發明還涉及一種所述提取物和/或提取物中的至少一種活性化合物在製備疾病治療藥物、特別是腫瘤治療藥物中的應用。
在另外一個實施方案中，本發明還涉及治療腫瘤的方法。
通過說明書的詳細描述並參考附圖可以很清楚地理解本發明的其他目的及優點。
附1描述的是本發明不同濃度的提取物對不同類型的腫瘤總體生長狀況的影響。
圖2-11顯示的是本發明的提取物在體外對不同類型的人源癌細胞系的影響。圖2顯示的是乳腺癌細胞系，圖3顯示的是肉瘤細胞系，圖4顯示的是胰腺癌細胞系，圖5顯示的是黑色素瘤細胞系，圖6顯示的是結腸癌細胞系，圖7顯示的是膠質瘤細胞系，圖8顯示的是肺癌細胞系，圖9顯示的是膀胱癌細胞系，

圖10顯示的是前列腺癌細胞系，圖11顯示的是頭頸癌細胞系。
圖12-16描述的是本發明的提取物在體外對5種不同的人源細胞系，HCT-15(圖12)、RPMI(圖13)、A172(圖14)、J82(圖15)和Hs683(圖16)細胞周期動力學的影響。圖的上部顯示的是加入不同劑量的提取物時細胞的總體生長狀況，以活的癌細胞對對照細胞的百分數表示。圖的中間部分和下部顯示的是不同濃度的所述提取物在加入24和72小時後對細胞周期動力學的影響。用斯氏測驗分析統計學差異，其中*表示p≤0.05；**表示p≤0.01；***表示p≤0.001。
圖17-20顯示的是本發明的提取物對四種不同人源細胞系，HCT-15(圖17)、A172(圖18)、J82(圖19)和Hs683(圖20)細胞的體外凋亡誘導效應和壞死誘導效應。圖的上半部分顯示的是不同劑量的所述提取物在加入24小時後所產生的凋亡誘導效應和壞死誘導效應，圖的下半部分顯示的是加入72小時後的效應。
圖21顯示的是本發明的提取物對體內淋巴瘤模型的效應。所述提取物通過腹腔內注射，注射給P388淋巴瘤荷瘤小鼠的提取物的劑量分別為2.5mg/kg；5mg/kg和10mg/kg。圖21A顯示的是所述提取物對對照鼠(未處理)和治療鼠體重的影響。圖21B顯示的是所述提取物對對照鼠和治療鼠體內腫瘤生長的影響。
圖22顯示的是本發明的提取物對體內淋巴瘤模型的效應。所述提取物通過腹腔內注射，注射給P388淋巴瘤荷瘤小鼠的提取物的劑量分別為0.63mg/kg；1.25mg/kg和2.5mg/kg。圖22A顯示的是所述提取物對對照鼠(未處理)和治療鼠體重的影響。圖22B顯示的是所述提取物對對照鼠和治療鼠體內腫瘤生長的影響。
圖23顯示的是本發明的提取物對體內黑色素瘤模型的效應。所述提取物通過腹腔內注射，注射給B16黑色素瘤荷瘤小鼠的提取物的劑量分別為2.5mg/kg；1.25mg/kg和0.63mg/kg。圖23A顯示的是所述提取物對對照鼠(未處理)和治療鼠體重的影響。圖23B顯示的是所述提取物對對照鼠和治療鼠體內腫瘤生長的影響。
圖24顯示的是本發明的提取物對體內黑色素瘤模型的效應。所述提取物通過口服給藥，給予B16黑色素瘤荷瘤小鼠的提取物的劑量分別為0.63mg/kg；1.255mg/kg和2.5mg/kg。圖24A顯示的是所述提取物對對照鼠(未處理)和治療鼠體重的影響。圖24B顯示的是所述提取物對對照鼠和治療鼠體內腫瘤生長的影響。
圖25顯示的是本發明的提取物對體內乳腺癌模型的效應。所述提取物通過腹腔內注射，注射給MXT-HI乳腺癌荷瘤小鼠的提取物的劑量分別為2.5mg/kg；5mg/kg和10mg/kg。圖25A顯示的是所述提取物對對照鼠(未處理)和治療鼠體重的影響。圖25B顯示的是所述提取物對對照鼠和治療鼠體內腫瘤生長的影響。
圖26顯示的是試驗組小鼠(腹腔分別注射2.5mg/kg；5mg/kg和10mg/kg的提取物)和對照組小鼠存活率的統計圖(Kaplan-Meier統計學分析)。
圖27顯示的是給小鼠腹腔注射5mg/kg和1.25mg/kg本發明的提取物後3天與對照組相比對白細胞數、紅細胞數、血紅蛋白濃度和血球比容值的影響(在圖中「白柱」表示的提取物劑量為1.25mg/kg)圖28-35顯示的本發明的提取物與抗腫瘤化合物阿黴酮、長春新鹼、喜樹鹼或奧沙利鉑聯合使用時的抗毒性效應。
提取物的特性白花牛角瓜屬蘿摩科植物，是一種生長在非洲和亞洲的植物。這種植物被用於傳統醫藥中，經研究發現還有多種用途，如解熱、抗瘧、止瀉(anti-diarroeal)、止痛、治療胃炎、保護黏膜以及殺蟲、鎮咳、抗菌、癒合創傷、鬆弛肌肉。已知白花牛角瓜的莖、花和葉都含有某種被稱為強心甾的化合物。最近，實驗證明這些強心甾具有心臟毒性，已被開發成治療人心功能不全的藥物。
出乎意料的是，本發明至少提供了一種具有另一類活性、特別是「抗腫瘤活性」的白花牛角瓜提取物。另外，還證明本發明的提取物中至少有一種在體外和體內都具有抗腫瘤活性。本發明的所述提取物可誘導腫瘤生長的顯著抑制，具有促凋亡活性。這些特性在實施例3和4中進行了進一步的說明。另外，發明者通過體內實驗證明本發明的所述提取物中至少有一種提取物對幾種類型的腫瘤都有較高的抑制活性。如下面實施例中所描述的，本發明的所述提取物在幾種腫瘤實驗模型中都產生了顯著的抗腫瘤效應，這些模型代表了一個較寬組織學類型的腫瘤，其中包括乳腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。這些模型是與臨床相關的，因為它們模擬了人腫瘤的特殊臨床階段。
令人吃驚的是，本發明所述的提取物在相對低的劑量時也具有較高的活性。所述提取物在0.4到2.2mg/kg的低劑量時也具有抗腫瘤活性，優選的劑量範圍是0.5到2mg/kg。低劑量也有較高的抗腫瘤活性說明所述提取物活性很高。當閱讀下面的實施例時可以驚奇地發現，本發明所述的提取物在進行長期低劑量，即0.6mg/kg到1.25mg/kg治療時所達到的抗腫瘤效應比進行高劑量，即5mg/kg到10mg/kg治療時所達到的效果還要好。本發明所述的提取物的最大耐受劑量(MTD)指數是20mg/kg，這個指數是指一次可以給予健康動物的所述提取物的最大劑量。這個數值說明本發明所述的提取物具有較寬的治療窗口。
術語「毒性」或「毒性效應」是指化合物對正常細胞、組織或器官可能的有害效應。本發明的提取物的其他重要特性包括其毒性水平較低。試驗證明所述提取物在體內不會導致血液學指標的改變和體重的下降，對不同類型的器官和組織的副作用都很小。事實上，本發明所述提取物的毒性水平是非常低的。本發明所述提取物結合了如下一些基本特徵較高的抗腫瘤活性、較低的毒性以及很少產生毒副作用。
另外，本發明的植物白花牛角瓜提取物還具有「抗毒活性」。如上所述，術語「抗毒活性」用在本文中是指本發明的提取物降低或反轉化合物毒副作用的能力。發明者吃驚地發現本發明的提取物與具有一定毒副作用的化合物聯合使用可使治療性化合物的副作用降低。例如，實施例8說明本發明的提取物與大家所熟知的抗癌藥如長春新鹼、阿黴酮、喜樹鹼或奧沙利鉑聯合使用可降低這些抗癌藥由於對正常細胞的毒性而產生的某些副作用。
當本發明的至少一種提取物在給予治療性化合物前給藥時，即化合物與提取物先後給藥時可觀察到其具有抗毒活性。在給予治療性化合物前任意時間點給予提取物是本發明的一個方面。本發明的其他方面涉及在給予治療性化合物前不超過336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1或0.5小時給予提取物。
當本發明的至少一種提取物在給予治療性化合物的同時，即化合物與提取物作為一種組合物或者同時單獨給藥時也可以觀察到其具有抗毒活性。
當本發明的至少一種提取物在給予治療性化合物後給藥時，即提取物與化合物先後給藥時也可以觀察到其具有抗毒活性。在給予治療性化合物後任意時間點給予提取物是本發明的一個方面。本發明的其他方面涉及在給予治療性化合物後0.5、1、2、4、8、12、16、20、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312或366小時內給予提取物。
在先後給藥時，所述組合物可在給予治療性化合物前和/或後以各種劑量給藥一次或多次。先後給藥還可以結合同時給藥或先後給藥。
提取物的組合物本發明的提取物包含一種或幾種活性化合物，即存在於本發明提取物中的、具有與本發明提取物上述的至少一種活性一樣活性的化合物。至少一種提取物的主要活性是抗腫瘤活性和抗毒活性。本領域的技術人員可以理解存在於所述提取物中的活性化合物可以只具有這些特性中的一種，或者兩種。
在另外一個實施方案中，本發明的至少一種提取物含有至少兩種選自如下一組的活性化合物馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin、2″oxo voruscharin。
還可以理解的是，本發明的提取物還可以含有一種或多種不屬於強心甾類的活性化合物及其他化合物。在另外一個實施方案中，提取物至少含有表1中的一種化合物。
表1 包含在本發明的至少一種提取物中的某些化合物
在另外的實施方案中，本發明涉及從本發明的提取物中分離出的活性化合物。
在本發明的另外一個實施方案中提取物中的活性化合物是2″oxo-voruscharin。本發明的一個方面是表2中所列的所述化合物(化合物A)及其衍生物(化合物B到H)的抗癌活性和/或抗毒活性。
表22″oxo-voruscharin(化合物A)及其衍生物(化合物B到H)的化學結構 *是指式I的含氮雜環的N原子和C原子之間的雙鍵。
提取方法根據另外一個實施方案，本發明的提取物可通過醇提取、特別是甲醇提取獲得。
在另一個實施方案中，本發明涉及提取本發明的提取物的方法，該方法包括a)在脂肪族醇中提取所述白花牛角瓜植物的起始原料，所述起始原料選自果實、地上部分、地下部分或其混合物，利用所述醇溶解起始原料獲得所述原料的脂肪族醇懸液，攪拌所述懸液；用多孔玻璃過濾所述懸液從而得到第一濾液和第一固體組分；b)用脂肪族醇提取所述第一固體組分從而得到第二濾液和第二固體組分；c)混合所述第一濾液和第二濾液得到混合濾液；以及d)在真空下蒸發所述混合濾液從而得到油性殘留物。
在一個優選實施方案中，所述白花牛角瓜植物的起始原料取自植物的地下部分，特別是植物的根。
在另一個實施方案中，用於提取本發明的起始原料的脂肪族醇是乙醇。在另外一個實施方案中，提取過程中獲得的殘留物用溶劑收集，特別是藥用溶劑。
在另一個實施方案中，本發明涉及提取本發明的提取物的方法，該方法包括
a)研磨白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，g)收集含有生物活性組分的第一組分，h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的濃縮組分得到兩個組分，以及i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到含有生物活性成分的第三組分。
本發明的提取物包括從步驟c)、g)和i)中獲得的那些提取物。
本發明的一個方面是以利於保持提取物中生物活性化合物完整性的方式進行的提取方法。這些需要注意的地方是本領域技術人員所熟知的。
提取物的應用由於本文所述的提取物中至少有一種提取物具有一些優越的特性，特別是其抗腫瘤活性、抗毒活性、低毒性和/或其在低劑量時也具有高活性的特徵，因此本發明的提取物或提取物中的活性化合物特別適用於作為治療疾病，尤其是治療腫瘤的藥物。
在另一個實施方案中，本發明涉及本發明的提取物或其中的活性化合物作為藥物的應用。
在另外一個實施方案中，本發明還涉及至少一種本發明的提取物或其中的活性化合物在製備腫瘤治療藥物中的應用。更具體地說，本發明所述提取物或其中的活性化合物可用於製備腫瘤治療藥物。可用本發明的提取物治療的腫瘤包括而不限於乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、血癌。
如上所述，本發明的提取物還具有抗毒活性。發明者已經發現本發明的提取物或其中的活性化合物與具有一定毒副作用的第二化合物聯合使用可使第二化合物的毒性降低，但是其治療活性卻沒有減弱。因此，本發明的白花牛角瓜提取物還可以與其他化合物、特別是其他抗腫瘤化合物聯合使用。
包含提取物的藥物組合物在另一個實施方案中，本發明涉及治療腫瘤的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的本發明的白花牛角瓜提取物或其中的活性化合物以及藥學上可接受的載體。
在另外一個實施方案中，本發明涉及治療腫瘤的藥物組合物，該組合物包含-治療有效量的本發明的白花牛角瓜提取物或其中的活性化合物，-治療有效量的治療性化合物，以及-藥學上可接受的載體。
本文所用的術語「治療有效量」是指研究者、獸醫、醫生或其他臨床醫師認為至少有一種提取物或其中的活性化合物、或藥物的量能夠在組織、系統、動物或人體內激發生物反應或醫學反應，其中包括被治療疾病症狀的緩解。
藥物組合物可以本領域技術人員熟知的方法製備。為此，本發明的提取物和/或其中的任何活性化合物、一種或多種固體或液體藥學上可接受的載體以及其他藥理活性化合物要被製成適宜的給藥形式或劑型，作為藥物用於治療人或動物的疾病。
藥物組合物的特定形式可以是溶液、懸液、乳化液、乳膏、片劑、膠囊、鼻噴劑、脂質體或微儲裝置(micro-reservoir)，尤其是口服可吸收的組合物或無菌注射劑，如無菌注射水懸液或油懸液，或者栓劑。本發明優選的劑型是乾燥固體形式，其中包括膠囊、顆粒、片劑、丸劑、藥團和粉末。固體載體可包含一種或多種載體，乳糖、填料、分散劑、粘合劑，如纖維素、羧甲基纖維素、澱粉或防止片劑粘附到壓片機上的抗粘劑，如硬脂酸鎂。片劑、丸劑和藥團的形式可以使藥物快速分解，或者使活性成分緩慢釋放。
另外，由於本發明的提取物或其中的活性化合物具有抗毒活性，因此也特別適於和具有一定毒副作用的其他藥理活性化合物聯合使用，如具有一定毒副作用的其他藥物。
「具有一定毒副作用的藥理活性化合物」包括任何用於治療疾病但是又能誘導一些不需要的毒性效應的化合物。這種化合物優選用於治療腫瘤的化合物。例如，本發明的提取物或其中的活性化合物可與具有抗腫瘤活性的一種或多種其他化合物聯合使用。由於兩種或多種具有抗腫瘤活性的化合物聯合使用，因此其抗腫瘤效應可以得到提高。另外，這種聯合用藥可以降低一種或幾種抗腫瘤化合物所誘導的毒副作用。
本發明的提取物或其中的活性化合物與其他治療性化合物聯合用藥方案包括所述提取物或其中的活性化合物與其他治療性化合物分別用藥。特別是在給予其他治療性化合物前(預處理)、同時或之後(治療後)給予本發明的提取物或其中的活性化合物。
另外，提取物或其中的活性化合物與其他治療性化合物聯合用藥方案還可以包括兩種藥物的混合物。因此，在一個優選實施方案中，本發明涉及包含第一組分和第二組分的藥物組合物，其中，所述第一組分是上面所述的提取物或其中的至少一種活性化合物，所述第二組分包含具有一定毒副作用的藥理活性化合物。
產品本發明的一個方面是含有白花牛角瓜提取物和治療性化合物的產品，其中提取物與治療性化合物同時、分別或依次給予患者。可用於本發明的產品是本發明的一個方面。
同時給藥是指兩種組分同時給予患者。例如，兩種組分的混合物。其中包括而不限於靜脈注射的溶液、片劑、液體、局部用的乳膏等，其中每種劑型都包含兩種組分。
分別給藥是指兩種組分同時或者在同一個時間內先後給予患者，但是兩種組分分別存在於獨立的製劑中。例如，兩種組分分別存在於兩種片劑中。片劑可同時服用，或者先後服用。
先後給藥是指分別存在於兩種獨立的製劑中的兩種組分先後給予患者。兩次服藥之間可有一段間隔時間。例如，一種組分可在服用另一種組分後336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1或0.5小時服用。
先後用藥時提取物可在給予治療性化合物前和/或後以各種劑量給予一次或多次。先後給藥可結合同時給藥或先後給藥。
試劑盒本發明的另一個方面是試劑盒，其中包括裝有白花牛角瓜提取物的容器和裝有治療性化合物的容器。本發明的提取物和治療性化合物見上面的描述。
在提及由裝白花牛角瓜提取物的容器和裝治療性化合物的容器組成的試劑盒時，應當清楚試劑盒可以包含單次劑量或多次劑量，這些藥物可以裝在兩個單獨的容器裡，每個容器內都裝有多次劑量的藥物，試劑盒內還可以包括多個容器，每個容器裝有一種單次劑量的藥物。還應當清楚試劑盒也可以包含不止一種治療性化合物，每種化合物都用單獨的容器盛裝，或者將治療性化合物的混合物裝在一個容器內。
容器可以是醫學領域所熟知的任何容器，如小玻璃瓶、發泡包裝、注射器、可再封的瓶子、配藥瓶、吸氣器、滴瓶、膏藥、塗藥器、栓劑。
將提取物和治療性化合物分別包裝便於這兩種藥物同時、分別或依次給藥。
治療方法由於本發明至少有一種提取物具有優越的抗腫瘤活性，因此所述提取物特別適用於治療腫瘤患者。在另一個實施方案中，本發明還涉及治療腫瘤的方法，該方法是給予需要治療的患者以本發明的藥物組合物。由於所述提取物的毒性和副作用都很小，因此利用包含一種所述提取物的藥物組合物治療腫瘤時所產生的副作用是很小的。因此，本發明的提取物可用於腫瘤的長期治療。
在一個優選實施方案中，本發明特別提供了一種治療腫瘤的方法，其中的腫瘤選自乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌和血癌。
為了達到治療的目的，本發明的藥物組合物可以口服給藥、胃腸外途徑給藥，其中包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、動脈內注射或融合技術，或者通過鼻內噴霧或直腸內給藥，單位劑量的劑型內含有常規的非毒性藥學上可接受的載體、佐劑或運載體。
根據本發明的方法，所述藥物組合物可在治療過程中在不同的時間分別給藥，或者以分開的劑型或混合劑型同時給藥。因此，本發明可以被理解為包括了所有的同時給藥方案或替代治療方案，術語「給藥」因而得以被闡釋。
治療實體瘤的主要方法包括手術、放療和化療，這些方法可單獨使用，也可以聯合使用。本發明的提取物適於與這些治療方法聯合使用。本發明的提取物可用於提高腫瘤細胞對放療時輻射的敏感性，也可用於提高化療藥對腫瘤的滲透或殺傷活性。本發明的提取物還可用於致敏多藥耐藥腫瘤細胞。本發明的提取物與其他DNA損傷性治療性化合物聯合使用時是一種有效的治療性化合物，例如在與放療聯合使用時可增強放療的療效。應當清楚的是，本發明的藥物組合物可以特定的劑量、特定的給藥頻率用於人體內，劑量大小及給藥頻率的選擇要根據病人的具體情況而定，其中包括患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥途徑及給藥時間、排洩速率、聯合用藥、患者疾病的嚴重程度。
下面的實施例是用於說明本發明。這些實施例不應該被理解為限制本發明的範圍。第一個實施例說明了從植物白花牛角瓜中提取本發明的提取物的方法。實施例2-4描述了本發明的提取物在體外的抗腫瘤活性特徵。實施例5到7描述了本發明的提取物在體內的抗腫瘤活性特徵。實施例8描述的是本發明的提取物的抗毒性效應。
實施例實施例1從植物白花牛角瓜中提取本發明的提取物的方法本發明的提取物(提取物A)是用甲醇從白花牛角瓜植物(蘿摩科)的根中提取的。所述提取物還被稱為提取物A(編號)。將10克植物放入含150ml甲醇的三角燒瓶中，用磁力攪拌12小時，然後用多孔玻璃過濾。固體殘留物用甲醇再提取2小時。將兩次的濾液混合，然後用旋轉蒸發器在真空下蒸發。含甲醇提取物的殘留物被命名為提取物A。
通過分析提取物A發現其中含有幾種類型的化合物。在所述提取物A中有一組特殊的化合物是由強心甾類化合物組成的，如馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。另外，提取物A中包含的其他化合物包括而不限於3-O-乙醯-牛角瓜苷，α-香樹精、α-香樹精-苯甲酸鹽、α-牛角瓜醇、α-山萵苣醇、α-山萵苣醯-乙酸鹽、α-山萵苣醯-異戊酸鹽、阿拉伯糖、ASH、苯甲醯異厚果酮、苯甲醯厚果酮、β-香樹精、β-香樹精-苯甲酸鹽、β-牛角瓜醇、β-谷固醇、彈性橡皮、粉綠小冠花苷元、副冠毒苷元、D-氨基葡萄糖、弗如糖苷、GIGANTEOL、大曲茵素、葡萄糖、組胺、ISOGIGANTEOL、異山萵苣醇、異厚果酮、月桂烷厚果酮、月桂酸、亞油酸、蜂醇、牛角瓜皮苦素、油酸、軟脂酸、高牛角瓜苷、偽牛角瓜苷元、鼠李糖豆固醇、西裡奧苷元蒲公英甾醇、蒲公英甾醇苯甲酸鹽、胰蛋白酶。
本發明的其他提取物是通過如下方法提取的，該方法包括a)研磨白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，
d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，g)收集含有生物活性組分的第一組分，h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的濃縮組分得到兩個組分，以及i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到第三組分。
在步驟c)中所分離的提取物在下文中被稱為提取物B。在步驟g)中所分離的提取物在下文中被稱為提取物C。在步驟i)中所分離的提取物在下文中被稱為提取物D。
實施例2本發明的提取物對細胞系細胞整體生長狀況的影響本實施例說明了本發明的提取物A對不同類型腫瘤的抗腫瘤活性。為了確定提取物A的體外活性特徵，進行了提取物A的MTT試驗。MTT試驗是本領域所熟知的間接檢測方法，可以快速地、即在5天內測定給定產品對細胞系整體生長狀況的影響。該試驗可檢測具有代謝活性的活細胞數，因為活細胞可通過線粒體還原反應將黃色的MTT產品(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5二苯基四唑嗅化物)轉化成藍色的產品甲，這種轉化只有活細胞才可以產生。試驗結束時甲形成的量通過分光光度計測定，其數值與活細胞數成正比。
表2所述的48株人源腫瘤細胞系用提取物A處理。這些細胞系涵蓋了10個組織學類型，分別是胰腺癌、肉瘤、乳腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌和頭頸癌。細胞在平底96孔培養板中培養，每孔100μl細胞懸液，根據細胞類型的不同細胞數在每孔3000到5000之間。每株細胞都用其特定的培養基培養，見表2。
表2MTT試驗中所用的人源癌細胞系及其所用的培養基
其中AA代表「胺基酸」細胞在37℃孵育24小時後，用100μl新鮮培養基換液，培養基中含有不同濃度的提取物A，濃度分別為0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml。每個試驗條件設6個復孔。
與含藥物的培養基(試驗條件)或不含藥物的培養基(對照)孵育72小時後用100μl含1mg/ml MTT的RPMI培養基換液。將微孔板置於37℃孵育3小時後400g離心10分鐘。然後去掉MTT，形成的甲結晶用100μl DMSO溶解。震蕩微孔板5分鐘，然後用分光光度計測定吸光度值，使用兩種波長，其中一個為甲的最大吸收波長570nm，另一個是背景噪聲波長630nm。
計算每種試驗條件下所測得的6個孔的平均吸光度值及其標準誤差(SEM)。計算剩餘活細胞與對照組相比所佔的百分率。試驗結果見圖1-11。
圖1顯示的是10種不同組織類型的細胞的總體結果。如圖所示，提取物A對所檢測的所有組織類型的細胞都具有抗腫瘤活性。膀胱組織來源的人腫瘤細胞系對提取物A的敏感性比其他9種類型的細胞系低。測定了能殺死細胞總數的50％時所需要的植物提取物的量，這個數值被稱為IC50。提取物A對乳腺組織來源的細胞系和胰腺癌細胞系的IC50在0.5μg/ml到1μg/ml之間。提取物A對肉瘤、黑色素瘤、膠質瘤、肺癌、頭頸癌和結腸癌細胞系的抗腫瘤活性更強，其IC50在0.5-0.1μg/ml之間。PC3前列腺癌細胞系的敏感性最顯著，其IC50在0.01-0.05μg/ml之間。
如圖1所示，5種乳腺癌細胞系的IC50在0.5μg/ml到1μg/ml之間。在圖2中進一步描述了T-47D、MDA-MB-231、ZR-75-1、MCF-7和Hs578T這5種乳腺癌細胞系的整體生長情況。其中T-47D、MDA-MB-231、ZR-75-1和Hs578T對提取物A的敏感性一致，而MCF-7細胞整體生長狀況下降的速度比其他4種乳腺癌細胞都要快。
如圖1所述，7種肉瘤細胞系(見表2)的IC50在0.5μg/ml到0.1μg/ml之間。在圖3中進一步描述了各個細胞系的整體生長情況。提取物A對A204細胞系的抗腫瘤活性最高，其IC50在0.1μg/ml到0.05μg/ml之間。Hs729細胞系被認為是7株肉瘤細胞系中最不敏感的，因為其IC50在1μg/ml到5μg/ml之間。
如圖1所述，7株胰腺癌細胞系(見表2)的平均IC50在0.5μg/ml到0.1μg/ml之間。進一步觀察了7株胰腺癌細胞系中6株胰腺癌細胞系的整體生長狀況(圖4)。在這7株細胞系中，Panc-1對提取物A的敏感性最高，Hs766T的敏感性最低。這兩株細胞系的IC50分別為0.1μg/ml-0.5μg/ml和1μg/ml-5μg/ml。
如圖1所述，5株黑色素瘤癌細胞系(見表2)的平均IC50在0.5μg/ml到0.1μg/ml之間。在大於或等於5μg/ml的濃度時，本發明的提取物對所有黑色素瘤細胞系總體生長水平的抑制超過60％。所有的黑色素瘤細胞系的總體生長狀況相似，其IC50在0.1μg/ml到0.5μg/ml之間。
如圖1所述，7株結腸癌細胞系(見表2)的平均IC50在0.5μg/ml到0.1μg/ml之間。在所有被檢測的結腸癌細胞系中(圖6)，LoVo細胞系的IC50約為0.1μg/ml，被認為是最敏感的結腸癌細胞系。SW948腫瘤細胞系被認為是最不敏感的，其IC50在0.5μg/ml到1μg/ml之間。
如圖1所述，7株膠質瘤癌細胞系(見表2)的平均IC50在0.5μg/ml到0.1μg/ml之間。Hs683是對提取物最敏感的細胞系，其IC50接近0.05μg/ml。即使是0.01μg/ml到10μg/ml的提取物A對A172細胞的生長也沒有影響，其IC50在10μg/ml到50μg/ml之間。
如圖1所述，2株人非小細胞肺癌細胞系(NSCLC)的平均IC50在0.1μg/ml到0.5μg/ml之間。圖8表明兩株細胞系對提取物A都敏感。
如圖1所述，2株人膀胱癌細胞系(見表2)的平均IC50在50μg/ml到100μg/ml之間。這兩株細胞系對提取物A的敏感性明顯不同(圖9)。事實上，5μg/ml的提取物A就可以使T24細胞系的總體生長水平下降80％以上，而100μg/ml的提取物A也只能使J82細胞系的總體生長水平下降32％。J82細胞系對提取物A的敏感性極低。
1株前列腺癌細胞系(PC3細胞系)用提取物A處理後通過MTT試驗分析其總體生長狀況。0.5μg/ml-100μg/ml的提取物A可使該細胞系的總體生長水平被抑制約90％，其IC50約為0.1μg/ml(圖10)。
如圖1所述，5株頭頸癌細胞系的平均IC50在0.1μg/ml到0.5μg/ml之間。5株頭頸癌細胞系中有4株的總體生長水平相似(圖11)。在所有的5株細胞系中，SCC9好像是最不敏感的，其對提取物A的IC50約為5μg/ml。
總之，本發明的提取物A對上述試驗所分析的48株人源癌細胞系中的46株都是具有較高的抗腫瘤活性的。這種抗腫瘤活性表現為可使這些人源腫瘤模型的總體生長水平顯著下降，這些人源腫瘤模型所代表的組織學類型的範圍很寬。
實施例3本發明的提取物對細胞動力學的影響本實施例說明了本發明的提取物A的細胞增殖抑制效應。從實施例2所述的MTT比色分析結果中可以清楚的看到提取物A可明顯抑制MTT試驗所分析的48株人源癌細胞系中大部分細胞系的總體生長水平。在下面的實施例中要分析提取物對細胞生長的抑制效應是由於細胞周期動力學的改變引起的(實施例3)，還是由於誘導凋亡引起的(實施例4)，還是兩種因素都存在。
細胞周期一般分為以下幾個期G0/G1、S和G2/M期。調控細胞增殖和/或細胞死亡的蛋白所發生的改變是提取物A中的活性化合物的靶位。細胞周期動力學的改變可用不同的螢光物質通過流式細胞術測定，如碘化丙啶、吖啶橙和溴乙啶等。流式細胞術可以確定每個癌細胞所處的細胞周期(可測定數千個細胞)。因此可通過DNA直方圖模式的變化確定各種治療性化合物的作用機制。用圖或數學模型處理流式細胞術所得到的數據以估計處於G1、S和G2/M期的細胞比例。大多數的數學計算都是根據某個模型和假設。
將細胞接種到含7ml培養基的培養瓶(面積為25cm2)內。37℃孵育48小時後用含提取物A的新鮮培養基換液，提取物A的濃度分別為可以殺死50％(IC50)、30％(IC30)和10％(IC10)細胞的濃度。加入提取物後24或72小時收穫懸液中的細胞，用4℃的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，然後用70％的乙醇(4℃)固定，置於-20℃過夜。細胞用PBS洗滌後用碘化丙啶溶液(80μg/ml)在37℃孵育30分鐘，然後置於4℃過夜。加入核糖核酸酶A(3％V/V)以使雙鏈DNA斷裂。繪製每個樣品的細胞周期圖。用流式細胞儀內的特殊軟體確定處於不同細胞周期的準確細胞百分率。每個細胞周期相以峰面積表示，計算百分率。整個細胞周期的表面積為100％。每個試驗進行3次。計算每個相的平均百分率及其標準差。給定條件下的每個細胞周期所佔有的百分數與對照細胞、即未處理細胞中每個細胞周期所佔的百分數進行比較。
提取物A具有很高的抗人源腫瘤細胞活性。流式細胞術試驗中所選擇的濃度參考了MTT試驗的結果(實施例2)。一共檢測了Hs683(膠質瘤)、J82(膀胱癌)、A172(膠質瘤)、RPMI(頭頸癌)和HCT-15(結腸癌)這5株人源細胞系，確定了殺死10％、30％和50％的這些細胞所需要的提取物A的劑量(表3)，以分析濃度不斷增加的提取物A是否可以在處理24或72小時後促進處於某一細胞周期相的細胞積聚。
表3在5株細胞系內本發明的提取物A殺死10％、30％和50％的細胞所需要的劑量
HCT-15細胞周期分析(圖12)結果表明所有濃度的提取物A處理後24小時處於不同細胞周期的細胞分布情況與對照組都一樣。但是用0.25μg/ml的提取物處理72小時後處於S期的細胞群明顯增多。對照組處於S期的細胞佔21％，而0.25μg/ml提取物處理72小時後的細胞處於S期的佔59％。在S期細胞數增加的同時G0/G1期的細胞數減少。處於G0/G1期的細胞從71％下降到29％。
RPMI細胞周期分析(圖13)結果表明0.05μg/ml的提取物A處理後24小時處於不同細胞周期的細胞分布情況與對照組一樣，而0.1μg/ml和0.25μg/ml組在處理後24小時處於S期的細胞數略微升高。但是，當RPMI細胞與3種濃度的提取物A共孵育72小時後處於S期的細胞數明顯增多。0.05μg/ml、0.1μg/ml和0.25μg/ml組處於S期的細胞百分數分別為71％、69％和62％。相應的，處於G0/G1期的細胞百分數明顯下降，處於G2/M期的細胞百分數輕微升高，達到細胞總數的29％。
A172細胞用10μg/ml和25μg/ml的提取物A處理，這兩個濃度分別等於IC10和IC50。結果(圖14)表明兩種濃度的提取物A都可以在處理後24小時使處於G0/G1期的細胞數增加。對照組處於G0/G1期的細胞數佔39％，而提取物A處理組處於G0/G1期的細胞數達到60％。隨著處於G0/G1期的細胞增多，最大濃度組處於G2/M期的細胞也有輕微增多。處理後24小時所觀察到的結果在處理後72小時消失。處於不同細胞周期的細胞百分數確實沒有明顯的改變。
J82細胞對提取物基本不敏感(cfr.MTT試驗)。流式細胞術所用的濃度相當於IC10和IC30(圖15)。在兩種檢測濃度下，處理24小時後處於G0/G1的細胞出現輕微積聚。但是用50μg/ml和100μg/ml的提取物A處理細胞72小時後處於S期的細胞分別佔到30％和47％，而對照組只有18％。100μg/ml時也可以觀察到G2/M期細胞的積聚。
用0.05μg/ml的提取物A處理Hs683細胞後24小時可觀察到處於G0/G1期細胞的積聚，約佔細胞總數的70％，而對照組為58％(圖16)。相應的，處於S期的細胞數減少。同樣，在兩種濃度下，處理72小時後大多數細胞處於G0/G1期。有60％以上的細胞處於這一周期，而對照組處於這一周期的細胞佔細胞總數的46％。
總之，提取物A主要誘導G0/G1期細胞的積聚，說明提取物A具有細胞增殖抑制效應。
實施例4本發明提取物的促凋亡效應本實施例說明了本發明提取物的促凋亡效應。
細胞死亡以兩種途徑發生，一種是意外發生的，一種是受遺傳程序控制的。細胞的意外死亡也被稱為壞死，這是物理損傷或生物損傷的結果。凋亡是指遺傳程序控制的細胞死亡，正常生理條件下就會發生。凋亡被誘導以後，細胞內會發生一系列事件，如細胞死亡受體的活化、一系列細胞溶解蛋白酶的活化、凋亡小體的形成、DNA的片段化。
用4株人源細胞系檢測提取物A對凋亡通路的影響Hs683(膠質瘤)、J82(膀胱癌)、A172(膠質瘤)和HCT-15(結腸癌)。
將細胞接種到含7ml培養基的培養瓶(面積為25cm2)內。37℃孵育48小時後用含提取物A的新鮮培養基換液，提取物A的濃度分別為可以殺死50％細胞和30％細胞的濃度。加入提取物後24或72小時收穫懸液中的細胞並計數。4℃、1700rpm離心10分鐘收穫250,000個細胞。沉澱下來的細胞團用4℃的PBS洗滌，然後在黑暗處與4℃的膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶溶液孵育15分鐘。每個樣品計數約10,000個細胞，所得到的數值用對數值記錄。用流式細胞儀附帶的軟體精確分析發生凋亡和/或壞死的細胞所佔的百分數以及正常細胞所佔的百分數。每個試驗重複兩次，計算發生凋亡及壞死的細胞百分數的平均值及其標準差。每個處理組都與對照組，即未處理的細胞相比較。
與對照細胞相比，用0.25μg/ml的提取物A處理24小時後，發生凋亡的HCT-15細胞增加40倍(圖17)。用25μg/ml的提取物A處理24小時後，A172細胞系也會發生凋亡和壞死(圖18)。這種趨勢可以維持到處理後72小時。提取物A可以濃度依賴的方式誘導J82細胞的凋亡，在處理後72小時特別明顯(圖19)。兩種濃度的藥物處理72小時後可以觀察到壞死細胞所佔的百分數也有提高。用0.025μg/ml的提取物A處理24小時後，發生凋亡的Hs683細胞所佔百分數增加2.5倍(圖20)。處理後72小時凋亡細胞百分數是以劑量依賴的方式增加的。
總之，提取物A主要是使凋亡細胞所佔的比例增加。在某些條件下可以觀察到提取物A對壞死通路的影響。
實施例5本發明提取物的最大耐受劑量在本實施例中確定了本發明提取物A的MTD指數。某種藥物的最大耐受劑量(MTD)被定義為所能給健康動物，如未移植腫瘤的動物，腹腔、靜脈、皮下注射或口服一次藥物的最大劑量。
確定提取物A的MTD指數所需要的試驗條件如下。記錄未移植腫瘤小鼠的存活期到注射後14天。用6種不同劑量的提取物A確定其MTD指數。給予荷瘤小鼠的最大劑量為160mg/kg。其他劑量有5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg。每個確定MTD指數的試驗組包括兩隻小鼠。下面的表4給出了計算提取物A的MTD指數所需要的數據。
表4 確定本發明提取物A的MTD指數
其中「x」代表一隻死亡小鼠，「--」代表小鼠全部存活根據上面的定義，提取物A給小鼠單次注射的MTD指數是20mg/kg。因此，提取物A的最大耐受劑量(MTD)，即所能給健康動物注射的最大劑量，為20mg/kg提取物。這個數值說明提取物A的治療窗口很大。
實施例6在3種腫瘤模型內評價本發明提取物的體內效應本實施例說明了本發明的提取物A在3種腫瘤模型內的體內效應。
在移植了不同類型腫瘤的小鼠體內研究提取物A的體內效應，這些腫瘤包括淋巴瘤、黑色素瘤和乳腺癌。用3類參數來評價體內效應-累積毒性，通過記錄荷瘤小鼠在治療期間體重的變化來評價-對腫瘤生長的實際影響水平，通過用卡鉗每周3次測定腫瘤的大小來評價。腫瘤的實際生長水平用兩個最大垂直直徑相乘所得到的面積(mm2)來表示。
-處理小鼠的存活時間，用T/C指數來計算。這個指數是指處理組小鼠平均存活時間(T)與對照組小鼠平均存活時間(C)的比值。如果T/C值在130％以上，則提取物被認為是有活性的(P＜0.05)；如果T/C值在150％以上，則認為提取物的活性很高(P＜0.01)，如果T/C值在70％以下，則提取物被認為是有毒性的。
提取物A對淋巴瘤模型的體內效應用攻擊性P388淋巴瘤模型評價提取物A。第一次試驗設3個劑量組，10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg，分別與對照組比較。在D0天時小鼠皮下接種106P388細胞，在隨後的3周內共治療9次，分別在移植後的D5天、D7天、D9天、D12天、D14天、D16天、D19天、D21天和D23天。每個試驗組包括9隻小鼠。
圖21A說明提取物A對小鼠的體重沒有影響。圖21B說明提取物A可明顯抑制P388淋巴瘤的生長。7×10mg/kg注射方案所得到的T/C為111％，6×5mg/kg注射方案所得到的T/C為100％，8×2.5mg/kg注射方案所得到的T/C為121％。總之，這些結果說明給予提取物A可抑制P388淋巴瘤的生長，但是各試驗濃度的提取物A都不能明顯延長PW88淋巴瘤荷瘤小鼠的生存期。
在第二組試驗中，給藥的次數從9次增加到16次，但是每次給藥的劑量相應減少。皮下注射給藥的劑量分別為2.5mg/kg、1.25mg/kg和0.63mg/kg。每日注射提取物A，每周注射5天，連續注射5周(5×5＝25)。
圖22說明0.63mg/kg和1.25mg/kg的活性提取物A對小鼠的毒性效應很小，因為P388淋巴瘤荷瘤小鼠在治療期間體重沒有減輕。圖22A說明0.63mg/kg和1.25mg/kg的提取物A可明顯抑制P33淋巴瘤的生長。另外，15×2.5mg/kg注射方案所得到的T/C為137％，15×1.25mg/kg注射方案所得到的T/C為137％，13×0.63mg/kg注射方案所得到的T/C為116％。因此，注射15次2.5mg/kg的提取物A及注射15次1.25mg/kg的提取物A可以使P388淋巴瘤荷瘤小鼠的生存期延長37％。說明用2.5mg/kg和1.25mg/kg的提取物A治療可延長P388淋巴瘤荷瘤小鼠的生存期。
總之，本發明的提取物A對攻擊性的P388淋巴瘤模型具有明顯的抗腫瘤效應，並且不會導致被處理動物體重的下降。另外，意外地發現，本發明的提取物A用長期低劑量、即約1.25到0.63mg/kg，比用高劑量，即10到5mg/kg治療具有更高的抗腫瘤活性。
提取物A對黑色素瘤模型的體內效應用攻擊性B16黑色素瘤模型評價提取物A。提取物A皮下注射給小鼠，劑量分別為10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg。每日注射提取物A，每周注射5天，連續5周。
圖23A說明該劑量的提取物A對小鼠的毒性效應很小，因為B16黑色素瘤荷瘤小鼠在治療期間體重沒有減輕。圖23B說明2.5mg/kg或和1.25mg/kg的提取物A都可以明顯抑制B16黑色素瘤的生長。另外，20×2.5mg/kg注射方案所得到的T/C為117％，20×1.25mg/kg注射方案所得到的T/C為117％，25×0.63mg/kg注射方案所得到的T/C為140％。因此，提取物A可抑制B16黑色素瘤的生長，顯著延長B16黑色素瘤荷瘤小鼠的生存期，特別是注射提取物A 25×0.63mg/kg時，所達到的水平具有統計學差異。
在第二組試驗中，提取物A通過口服(per os)給藥。
圖24A說明該劑量的提取物A對小鼠的毒性效應很小，因為B16黑色素瘤荷瘤小鼠在治療期間體重沒有減輕。圖24B說明口服2.5或1.25mg/kg的提取物A可明顯抑制B16黑色素瘤的生長，抑制效應可持續到移植後25天。另外，19×2.5mg/kg給藥方案所得到的T/C為114％，15×1.25mg/kg給藥方案所得到的T/C為100％，16×0.63mg/kg給藥方案所得到的T/C為104％。因此，2.5mg/kg的提取物A可抑制B16黑色素瘤的生長，稍微延長B16黑色素瘤荷瘤小鼠的生存期。
總之，兩組試驗的結果說明本發明的提取物A不論採取何種給藥途徑對B16黑色素瘤都具有明顯的抗腫瘤效應。
提取物A對乳腺癌的體內效應在MXT-HI乳腺癌模型上評價提取物A的效應，該模型是對激素不敏感的乳腺癌突變株。MXT-HI模型相當於具有肝臟高轉移能力的未分化癌，因此相當於人的晚期乳腺癌。MXT-HI代表了一種高攻擊性的腫瘤模型。
B6D2F1小鼠腹部皮下注射MXT腫瘤碎塊在小鼠體內誘導MXT-HI乳腺癌模型。如果不加以治療，接種後4到7周小鼠就會死亡。提取物A的給藥劑量為10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg，給藥9次，即每周3次，連續3周。
圖25A說明試驗中所用的各種劑量的提取物A對小鼠都沒有產生大的毒性效應，因為MXT-HI荷瘤小鼠沒有出現體重的顯著下降。圖25B說明2.5mg/kg的提取物A給藥9次可顯著抑制MXT-HI腫瘤的生長。9×10mg/kg給藥方案所得到的T/C為103％，9×5mg/kg給藥方案所得到的T/C為103％，9×2.5mg/kg給藥方案所得到的T/C為119％。因此，2.5mg/kg的提取物A可以延長MXT-HI荷瘤小鼠的生存期。
圖26給出了對照組(未處理組)和試驗組(用提取物處理)內MXT-HI乳腺癌荷瘤小鼠在試驗期間死亡的數目。用Kaplan-Meier統計學分析計算每組中9隻小鼠的死亡率。統計數值表明了試驗組小鼠和對照組小鼠存活率的一般情況。
總之，上述試驗的結果表明提取物A對MXT-HI乳腺癌具有明顯的抗腫瘤效應。
實施例6的結論本發明的提取物A對各種試驗腫瘤模型都具有明顯的抗腫瘤效應。這些模型代表了多個組織學類型的腫瘤，其中包括乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤。這些模型是與臨床相關的，因為它們模擬了人腫瘤的特殊臨床階段。除此之外，它們還具有生物攻擊性和浸潤性，因為其中的兩個模型可以快速地轉移到肝臟。
雖然本發明的提取物A具有很高的抗腫瘤活性，但是其毒性很小，因為在治療期間荷瘤小鼠的體重都沒有明顯下降。因此，半純化的提取物除了包含具有本文所述的各種抗腫瘤活性的抗腫瘤化合物以外，還包含「解毒劑」。
令人驚喜的是，本發明的提取物A用長期低劑量、即約1.25到0.63mg/kg，比用高劑量，即10到5mg/kg治療具有更高的抗腫瘤活性。
實施例7本發明提取物的體內毒理學效應本實施例說明了本發明提取物A的體內毒理學效應，特別是其在體內的血液毒性和一般毒性。
血液毒性通過檢測每個動物樣品的造血系統指標來評價提取物的血液毒性。特別需要注意的是血小板、紅細胞和白細胞的數量。通過給小鼠的腹腔內注射5mg/kg和1.25mg/kg的提取物A來評價其毒性效應。給藥方案是每周5次，連續5周，共注射25次。最後一次注射後3天處死動物。每組10隻動物。
與對照組相比，用提取物A處理後造血系統指標沒有出現具有統計學意義的變化(圖27)。紅細胞的平均細胞體積、血球血紅蛋白的平均體積、血球血紅蛋白的平均濃度以及血小板的數量在治療後沒有出現明顯變化。
一般毒性通過小鼠的組織學檢測來評價提取物A的一般毒性，製作不同類型的器官和組織的組織學切片，HE染色後進行常規的組織病理學分析。小鼠腹腔注射5mg/kg和1.25mg/kg的提取物A。給藥方案是每周5次，連續5周，共注射25次。最後一次注射後3天處死動物。收集動物的腦、心、肝臟、胰腺、胃、小腸和卵巢。每組10隻動物。
通過檢測所收集的器官發現對照組(未處理組)小鼠的器官未出現任何特殊的變化。處理組小鼠的腦、心臟、肝臟、胰腺、胃、小腸和卵巢也未受5mg/kg或1.25mg/kg提取物A處理的影響，說明提取物A不產生一般毒性效應。
實施例8本發明提取物的抗毒性效應本實施例說明了本發明提取物的抗毒性效應。給4到5周齡的雌性小鼠注射2倍或4倍最大耐受劑量的兩種臨床上常用的抗腫瘤藥物阿黴酮(MTD×4)和長春新鹼(MTD×2)。在第0天，給小鼠腹腔單次注射40mg/kg的阿黴酮或20mg/kg的長春新鹼。圖28中的Lot 1代表了注射MTD×2長春新鹼或MTD×4阿黴酮的小鼠的存活曲線。
在注射抗腫瘤藥物前給小鼠腹腔注射10mg/kg的本發明的提取物A。給藥方案如下-在注射治療性化合物阿黴酮或長春新鹼的同一天(即第0天)但是是在注射前4小時注射提取物A。這種治療方案所得到的結果由圖28的lot 2代表。
-在注射治療性化合物阿黴酮或長春新鹼前注射提取物A，每天注射一次，共注射8天。這種治療方案所得到的結果由圖28的lot 3代表。
-在注射治療性化合物阿黴酮或長春新鹼前注射提取物A，每天注射一次，共注射8天，然後再於注射抗腫瘤藥物後注射提取物A，每天注射一次，共注射7天。這種治療方案所得到的結果由圖28的lot 4代表。
如圖28所示，提取物A與治療性化合物聯合用藥的所有方案與只注射治療性化合物的給藥方案相比都可以顯著延長小鼠的生存期。
第二個例子說明了提取物A用其他給藥方法時的抗毒性效應。在第0天時給小鼠腹腔單次注射20mg/kg的長春新鹼。圖29中的Lot 1代表了注射長春新鹼的小鼠的存活曲線。
在注射抗腫瘤藥物前或同時給小鼠腹腔注射10mg/kg的本發明的提取物A。給藥方案如下-在注射治療性化合物長春新鹼的同一天(即第0天)但是是在注射前6小時注射提取物A。這種治療方案所得到的結果由圖29的lot 2代表。
-在注射治療性化合物長春新鹼的同一天(即第0天)但是是在注射前4小時注射提取物A。這種治療方案所得到的結果由圖29的lot 3代表。
-在注射治療性化合物長春新鹼的同一天(即第0天)但是是在注射前2小時注射提取物A。這種治療方案所得到的結果由圖29的lot 4代表。
-在注射治療性化合物長春新鹼的同一天(即第0天)並且是同時注射提取物A。這種治療方案所得到的結果由圖29的lot 5代表。
確定提取物A對抗腫瘤藥物的毒性效應的保護作用，即抗毒性效應的參數是「生存期的延長時間」。用Kaplan-Meier統計學方法進行統計學分析。顯著差異的水平定義為p＜0.05。
如圖29所示，與只注射治療性化合物的給藥方案相比，注射長春新鹼前3小時注射提取物A的給藥方案(lot 3)可顯著延長小鼠的生存期。
因此可以得出結論提取物A能夠明顯保護小鼠不受一些致死劑量的常用抗腫瘤藥物如阿黴酮或長春新鹼的毒性效應的影響。因此本發明的提取物A具有抗毒性效應，通過其抗毒性效應可以降低已知的抗腫瘤化合物的毒性效應。
第三個例子說明了提取物B的抗毒性效應。給4到5周齡的雌性小鼠注射四種臨床上常用的抗腫瘤化合物阿黴酮、長春新鹼、奧沙利鉑和喜樹鹼。在第0天時，給小鼠腹腔單次注射20mg/kg的阿黴酮、20mg/kgd的長春新鹼、40mg/kg的奧沙利鉑或20mg/kg的喜樹鹼。
圖30、31、32、33中的lot 1代表了注射阿黴酮、長春新鹼、奧沙利鉑或喜樹鹼的小鼠的存活曲線。
圖30到33中的lot 2代表了注射10mg/kg提取物B的小鼠的「存活時間點」。
圖30到33中的lot 3代表了在注射治療性化合物的同一天(即第0天)但是是在注射前4小時注射10mg/kg提取物B的小鼠的存活曲線。從圖30到33中可以看出，與只注射治療性化合物相比，提取物B與治療性化合物聯合使用可顯著延長小鼠的生存期。用Kaplan-Meier統計學方法進行統計學分析。每一組提取物B和治療性化合物聯合用藥的統計學差異水平都是p＜0.05。
因此可以得出結論提取物B能夠明顯保護小鼠不受一些致死劑量的常用抗腫瘤藥物的毒性效應的影響。因此本發明的提取物B具有抗毒性效應，通過其抗毒性效應可以降低已知的抗腫瘤藥物的毒性效應。與提取物A一樣，提取物B也具有抗毒活性。
第四個例子說明了提取物C的抗毒性效應。提取物C與20mg/kg的阿黴酮聯合使用。
圖34中的lot 1代表了注射20mg/kg阿黴酮的小鼠的存活曲線。
圖34中的lot 2代表了在注射治療性化合物的同一天(即第0天)但是是在注射前4小時注射10mg/kg提取物C的小鼠的存活曲線。
從圖34中可以看出，與只注射治療性化合物相比，注射提取物C可明顯延長小鼠的生存期。因此可以得出結論提取物C與上述的提取物B一樣具有抗毒活性。
第五個例子說明了提取物D的抗毒性效應。給4到5周齡的雌性小鼠注射阿黴酮。在第0天給小鼠腹腔單次注射20mg/kg的阿黴酮(圖35中的Lot 1)。圖35中的Lot 2代表了在注射治療性化合物阿黴酮的同一天(即第0天)但是是在注射前4小時注射5mg/kg提取物D的小鼠的存活曲線。
如圖35所示，與只注射治療性化合物相比，注射提取物D可明顯延長小鼠的生存期。因此可以得出結論提取物D與上述的提取物C一樣具有抗毒活性。
總之，這些試驗說明了與只注射治療性化合物相比，本發明的純化提取物可顯著延長小鼠的生存期。提取物D是最純的提取物，對抗腫瘤藥物的毒性效應具有抗毒活性。
權利要求
1.一種白花牛角瓜植物的提取物，其特徵在於，所述提取物具有藥理活性，尤其是具有抗毒活性。
2.如權利要求1所述的提取物，該提取物是通過包括以下步驟的提取過程獲得的a)在脂肪族醇中提取所述白花牛角瓜植物的起始原料，所述起始原料選自果實、地上部分、地下部分或其混合物，將所述起始原料溶於所述醇從而獲得所述原料的所述醇懸液，攪拌所述懸液，用多孔玻璃過濾所述懸液從而得到第一濾液和第一固體組分；b)用脂肪族醇提取所述第一固體組分從而得到第二濾液和第二固體組分；c)混合所述第一濾液和第二濾液得到混合濾液，在真空下蒸發所述混合濾液從而得到所述提取物。
3.如權利要求1所述的提取物，該提取物是通過包括如下步驟的提取過程獲得的a)研磨起始原料白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物。
4.如權利要求1所述的提取物，該提取物是通過包括如下步驟的提取過程獲得的a)研磨起始原料白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，以及g)收集第一組分，蒸發所述組分得到含有生物活性組分的膠狀物。
5.如權利要求1所述的提取物，該提取物是通過包括如下步驟的提取過程獲得的a)研磨起始原料白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，g)收集含有生物活性組分的第一組分，h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的濃縮組分得到兩個組分，以及i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到含有生物活性成分的第三組分。
6.一種含有如下組分的組合物-如權利要求1-5中任一項所述的白花牛角瓜提取物，以及-至少一種對正常的非癌細胞、組織或器官具有一定毒副作用的治療性化合物和/或物理療法。
7.一種含有如下組分的產品-如權利要求1-5中任一項所述的白花牛角瓜提取物，以及-至少一種對正常的非癌細胞、組織或器官具有一定毒副作用的治療性化合物和/或物理療法，上述兩種組分聯合使用，同時、分別或依次給予患者。
8.如權利要求6所述的組合物或如權利要求7所述的產品，其中，所述提取物之一含有至少兩種選自如下一組的活性化合物馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。
9.如權利要求6和8所述的組合物或如權利要求7和8所述的產品，其中，所述提取物之一含有至少一種表1中所列的化合物。
10.如權利要求6、8和9中任一項所述的組合物或如權利要求7-9中任一項所述的產品，其中，提取物∶治療性化合物的重量比為0.001∶1-1000∶1。
11.如權利要求6、8-10中任一項所述的組合物或如權利要求7-10中任一項所述的產品作為藥物的應用。
12.如權利要求6、8-10中任一項所述的組合物或如權利要求7-11中任一項所述的產品作為腫瘤治療藥物的應用。
13.如權利要求12所述的組合物，其中，所述腫瘤選自乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、血癌。
14.如權利要求6、8-13中任一項所述的組合物或如權利要求7-13中任一項所述的產品，其中還包含一種或多種其他治療性化合物。
15.如權利要求6、8-14中任一項所述的組合物或如權利要求7-14中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物是抗癌藥。
16.如權利要求6、8-15中任一項所述的組合物或如權利要求7-14中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物選自阿黴素、愛克蘭、阿糖胞嘧啶、博來黴素、biCNU、白消安、CCNU、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、癌得星、柔紅黴素、DTIC、5-FU、氟達拉濱、吉西他濱(注射用鹽酸吉西他濱)、赫賽汀、六甲密胺、羥脲、伊達比星、異環磷醯胺、依立替康(鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑，CPT-11)、克拉立平、氨甲蝶呤、光輝黴素、絲裂黴素、二羥基蒽酮、武活龍、諾維本、氮芥、奧沙利鉑、美羅華、STI-571、鏈脲菌素、紫杉醇、泰索帝、託泊替康(鹽酸託泊替康針劑)、硫酸長春鹼、長春新鹼、VP-16、希羅達(卡培他濱)或zevelin。
17.如權利要求6、8-16中任一項所述的組合物或如權利要求7-16中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物選自阿黴酮、長春新鹼、喜樹鹼和奧沙利鉑。
18.如權利要求6、8-17中任一項所述的組合物或如權利要求7-17中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性抗體或其片段。
19.如權利要求6、8-18中任一項所述的組合物或如權利要求7-18中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性激素或其片段。
20.如權利要求6、8-19中任一項所述的組合物或如權利要求7-19中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物是細胞毒性肽或其片段。
21.如權利要求6、8-20中任一項所述的組合物或如權利要求7-20中任一項所述的產品，該組合物或產品還包含藥學上可接受的載體。
22.如權利要求1-5所述的白花牛角瓜提取物在製備用於減輕一種或多種治療性化合物的副作用的藥物中的應用。
23.如權利要求1-5所述的白花牛角瓜提取物在製備用於增加一種或多種治療性化合物給患者的給藥劑量的藥物中的應用。
24.如權利要求22和23所述的提取物，其中，所述治療性化合物具有抗癌活性。
25.如權利要求22-24中任一項所述的提取物，其中，所述治療性化合物選自阿黴素、愛克蘭、阿糖胞嘧啶、博來黴素、biCNU、白消安、CCNU、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、癌得星、柔紅黴素、DTIC、5-FU、氟達拉濱、吉西他濱(注射用鹽酸吉西他濱)、赫賽汀、六甲密胺、羥脲、伊達比星、異環磷醯胺、依立替康(鹽酸伊立替康和山梨醇注射劑，CPT-11)、克拉立平、氨甲蝶呤、光輝黴素、絲裂黴素、二羥基蒽酮、武活龍、諾維本、氮芥、奧沙利鉑、美羅華、STI-571、鏈脲菌素、紫杉醇、泰索帝、託泊替康(鹽酸託泊替康針劑)、硫酸長春鹼、長春新鹼、VP-16、希羅達(卡培他濱)或zevelin。
26.如權利要求22和25所述的提取物的應用，其中，所述治療性化合物選自阿黴酮、長春新鹼、喜樹鹼和奧沙利鉑。
27.如權利要求22-26中任一項所述的提取物的應用，其中，所述治療性化合物是細胞毒性抗體或其片段。
28.如權利要求22-27中任一項所述的提取物的應用，其中，所述治療性化合物是細胞毒性激素或其片段。
29.如權利要求22-28中任一項所述的提取物的應用，其中，所述治療性化合物是細胞毒性肽或其片段。
30.如權利要求22-29中任一項所述的提取物的應用，其中，所述治療性化合物是治療性輻射。
31.如權利要求22-30中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物包含至少兩種選自如下一組的活性化合物馬利筋苷、calactin、vorusharin、牛角瓜苷、牛角瓜苷元、烏沙苷元、calotoxin、usharin和usharidin。
32.如權利要求22-31中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物還包含至少一種表1中所列的化合物。
33.如權利要求22-32中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物在所述治療性化合物之前給藥。
34.如權利要求22-33中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物在所述治療性化合物之後給藥。
35.如權利要求22-34中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物與所述治療性化合物同時給藥。
36.如權利要求22-35中任一項所述的提取物的應用，其中，所述提取物∶治療性化合物重量比為0.001∶1-1000∶1。
37.一種獲得包含生物活性成分的提取物的提取方法，其特徵在於，所述方法包括a)在脂肪族醇中提取所述白花牛角瓜植物的起始原料，所述起始原料選自果實、地上部分、地下部分或其混合物，利用所述醇溶解起始原料獲得所述原料的脂肪族醇懸液，攪拌所述懸液；用多孔玻璃過濾所述懸液從而得到第一濾液和第一固體組分；b)用脂肪族醇提取所述第一固體組分從而得到第二濾液和第二固體組分；c)混合所述第一濾液和第二濾液得到混合濾液；以及d)在真空下蒸發所述混合濾液從而得到所述提取物。
38.一種獲得包含生物活性成分的多種提取物的提取方法，其中，所述生物活性成分存在於白花牛角瓜的葉片、徑、皮和根中，該方法包括以下步驟a)研磨起始原料白花牛角瓜的葉片、莖、皮和根獲得植物精粉，b)在索氏抽提器中用二氯甲烷提取步驟a)的粉末至少6、12、18小時，優選24小時，以及c)傾析步驟b)的二氯甲烷，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物。
39.如權利要求38所述的提取方法，該方法還包括如下步驟d)在索氏抽提器中用甲醇提取步驟c)的殘留物至少6、12、18小時，優選24小時，e)傾析步驟d)的甲醇，過濾後蒸發濾液，得到膠狀物，f)以二氯甲烷-甲醇為溶劑利用快速矽膠柱層析處理步驟e)的膠狀物，以及g)收集含有生物活性成分的第一組分，蒸發洗脫液得到所述提取物。
40.如權利要求38和39所述的提取方法，該方法還包括如下步驟h)以己烷-丙酮為溶劑用快速矽膠柱層析處理步驟g)的組分得到兩個組分，i)步驟h)後用甲醇洗滌層析柱以得到含有生物活性成分的第三組分。
41.如權利要求38-40中任一項所述的提取方法，其中，步驟b)在20-80℃下進行。
42.如權利要求38-41中任一項所述的提取方法，其中，步驟b)被重複1-5次。
43.如權利要求38-40中任一項所述的提取方法，其中，步驟b)的持續時間為4-48小時。
44.如權利要求38-43中任一項所述的提取方法，其中，步驟d)的固相是矽膠。
45.如權利要求38-44中任一項所述的提取方法，其中，步驟d)的洗脫液是二元洗脫液，洗脫液中兩種組分的比例在100∶0到0∶100之間。
46.如權利要求45所述的提取方法，其中，所述二元洗脫液的組分包含一種醇溶劑和一種非極性溶劑。
47.如權利要求39-46中任一項所述的提取方法，其中，步驟e)在20-50℃下進行。
48.如權利要求39-45中任一項所述的提取方法，其中，步驟f)的固相是矽膠。
49.如權利要求39-45中任一項所述的提取方法，其中，步驟f)的洗脫液是二元洗脫液，洗脫液中兩種組分的比例在100∶0到0∶100之間。
50.如權利要求49所述提取方法，其中，所述二元洗脫液的組分包含一種醇溶劑和一種非極性溶劑。
51.如權利要求50所述提取方法，其中，所述二元洗脫液兩種組分非極性組分和極性組分的比例為50∶50到100∶0。
52.如權利要求40-49中任一項所述的提取方法，其中，步驟h)的溶劑是甲醇。
53.如權利要求39-52中任一項所述的提取方法，其中，步驟e)在20-50℃下進行。
54.利用權利要求37-53中任一項所述的方法分離的活性提取物。
55.如權利要求54所述的活性提取物作為藥物的應用。
56.如權利要求54所述的活性提取物在製備癌症治療藥中的應用。
57.一種治療癌症的方法，其特徵在於，所述方法包括給予需要此種治療的患者如權利要求6、8-21中任一項所述的藥物組合物或如權利要求7-21中任一項所述的產品。
58.如權利要求57所述的方法，其中，所述腫瘤選自乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤、胰腺癌、黑色素瘤、結腸癌、膠質瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、皮膚癌、骨癌、卵巢癌、CNS癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、前列腺癌、肝癌、血癌。
59.如權利要求6、8-21中任一項所述的組合物或如權利要求7-21中任一項所述的產品，其中，所述治療性化合物是輻射。
60.一種試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括一個裝有如權利要求1-5中任一項所述的白花牛角瓜提取物的容器和一個裝有治療性化合物的容器。
全文摘要
本發明涉及從植物白花牛角瓜中提取的具有藥理活性、特別是具有抗毒活性的提取物以及從中分離的活性化合物。另外，本發明還涉及獲得所述提取物的方法。本發明還涉及用於腫瘤治療的藥物組合物或產品，該組合物或產品含有有效量的所述提取物或其活性化合物、治療性化合物，還可以選擇添加藥學上可接受的載體。
文檔編號A61P35/00GK1711099SQ200380103117
公開日2005年12月21日 申請日期2003年10月9日 優先權日2002年10月9日
發明者F·達羅, J·-C·布拉克曼, P·古索, O·G·納科爾馬, M·艾爾雅茲迪, J·德維勒, R·范金克爾, 達默 M·范, R·基斯 申請人:優尼拜爾斯金股份有限公司