利用晚期胚胎發生豐富蛋白及其編碼基因培育抗旱轉基因棉花的製作方法

2023-05-23 02:23:06

專利名稱：利用晚期胚胎發生豐富蛋白及其編碼基因培育抗旱轉基因棉花的製作方法
技術領域：
本發明屬農作物的生物工程育種領域，具體說，涉及晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因在培育抗旱轉基因棉花中的應用。
背景技術：
水資源短缺是目前公認的全球性環境焦 點問題之一。據1950-1999年統計，我國平均每年受旱面積達2173. 33萬hm2，成災面積893. 33萬hm2，直接減收糧食100億kg以上，約佔各種自然災害造成糧食損失的60 %。乾旱不僅造成農業的重大損失，還加劇了生態環境的惡化及土地沙漠化和水土流失。面對我國人口不斷增長、耕地和水肥資源日益減少、環境狀況急劇惡化、糧食供需矛盾日益尖銳的嚴峻現實，如何通過提高作物的抗旱能力和水分利用效率來增加糧食產量、節約資源和改善環境，已成為我國農業持續高效發展的重大需求。基因工程的迅速發展與完善，為人類進一步改良作物的抗逆性、提高資源利用效率提供了新的策略和強有力的工具。近年來，該領域的研究已引起國內外學者廣泛的興趣和重視，在擬南芥、水稻、小麥等許多植物克隆了乾旱脅迫應答基因，對其表達調控和編碼蛋白的功能進行了研究，並通過基因工程技術分子改良水稻、玉米、馬鈴薯等農作物而取得顯著進展。很多水分脅迫誘導的基因產物具有保護細胞結構免受失水造成傷害的功能(Bray, 1993) 0這種推測的依據是蛋白質的胺基酸序列及其基因表達的特性。其中，晚期胚胎發生豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein, LEA)基因是第一個鑑定的在種子成熟和發育階段表達的基因，這些基因也在因受到乾旱、低溫和鹽潰等環境脅迫而脫水的營養組織中表達。目前，至少發現了 6組這樣的基因，稱為LEA基因。推測LEA蛋白可能有以下三方面的作用①作為脫水保護劑。由於LEA蛋白在結構上富含不帶電荷的親水胺基酸，它們既能像脯氨酸那樣，通過與細胞內的其它蛋白發生相互作用，使其結構保持穩定，又可能給細胞內的束縛水提供了一個結合的襯質，從而使細胞結構在脫水中不致遭受更大的破壞；②作為一種調節蛋白而參與植物滲透調節；③通過與核酸結合而調節細胞內其它基因的表達。LEA基因及其表達產物在植物耐乾旱、耐鹽脅迫方面具有可觀的應用前景。Xu (1996)將來自大麥的LEA基因HVAl導入水稻，在水稻啟動子Actl基因的調控下，大麥HVAl基因得到高水平的表達，在脅迫條件下轉基因水稻與非轉基因水稻相比，明顯具有較高的生長速率。這個研究表明，在水分虧缺和鹽分脅迫下，LEA蛋白在植物保護中發揮重要作用。Jai等(2002)將大麥的HAVl基因轉移入水稻，結果轉基因的水稻葉片中積累高水平的LEA3蛋白，從而顯著提高轉基因品系乾旱和鹽脅迫耐受性。Byong等(2005)第一次將來自油菜LEA基因轉移入中國捲心菜，轉基因捲心菜在受脅迫時損傷症狀顯著延遲，而且鹽脅迫和乾旱脅迫條件下轉基因植株具有增強的生長能力，表明轉LEA基因增強了植物對鹽和乾旱的耐受性。Wang等(2006)從紫杆檉柳中克隆到一個新的LEA基因(DQ663481)，轉基因菸草實驗表明其丙二醛(MDA)含量和相對電導率在乾旱脅迫條件下顯著地更低，推測該基因通過保護細胞膜免受損傷從而提高了植物對乾旱脅迫耐受性。棉花是我國重要的經濟作物。在棉花主栽區，乾旱和土壤鹽潰化是影響棉花產量的主要因素。在嚴重乾旱情況下，棉花會出現生長緩慢以及落蕾落鈴等現象，從而嚴重影響棉花的生產。隨著我國淡水資源的逐年匱乏和氣候變暖，採用轉基因技術培育耐旱棉花具有重要的戰略意義。目前，棉花的轉基因工作主要集中在抗鱗翅目昆蟲方面，抗蟲棉已在國內外大面積推廣。而採用轉基因技術創製耐旱棉花的工作在國內外尚處起步階段。迄今 國內外僅見幾例獲得耐旱性提高轉基因棉花的報導，包括「New protein, being a proteincomposed of amino acid sequences, useful for culturing a plant with improvedanti-drought capability」(專利申請號CN101481410_A) ,Generation of plant withimproved drought tolerance」(專利申請號US7968768B2)一種利用聚合抗逆基因提高棉花耐鹽抗旱性的方法」(專利申請號CN 101624604A)等，其實用價值尚有待考證；但利用晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因培育抗旱轉基因棉花尚未見報導。

發明內容
本發明的目的在於提供晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)及其編碼基因在培育抗旱轉基因棉花中的應用。所述晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)的胺基酸序列如Genebank號ABG54481所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示；將LEA基因重組到一個植物表達載體中，轉化入棉花細胞並讓其表達，獲得轉基因植株，從轉基因植株及其後代中篩選出穩定遺傳的T3代植株，培育出棉花抗旱育種新種質，進而創建出棉花抗旱育種新材料，以用於棉花的常規品種或雜交品種培育。本發明所述的一種利用晚期胚胎發生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉基因棉花中的應用，其特徵在於按下列步驟進行a、將晚期胚胎發生豐富蛋白基因通過常規分子生物學方法插入到植物轉基因表達載體中，並通過花粉管通道法導入到棉花受體材料中，獲得轉基因植株；b、通過大田卡那黴素檢測和室內分子檢測，經過繼代培養並每代進行嚴格的陽性植株篩選，直至獲得穩定遺傳的T3代轉基因植株；C、轉基因抗旱材料的抗逆性鑑定和利用，根據目的基因過表達的生理作用，進行相應的生理生化指標檢測，並通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉基因育種材料，獲得的優異材料用於棉花育種或生產實踐。所述晚期胚胎發生豐富蛋白的胺基酸序列如Genebank號ABG54481所示。所述晚期胚胎發生豐富蛋白編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所
/Jn o所述用於遺傳轉化的棉花品種為早熟棉新陸早18號。本發明對轉基因植株進行篩選，從抗性植株及其後代中篩選出轉基因T3代植株的方法是通過對3-4葉期轉基因棉花葉片塗抹卡那黴素(5g/L)檢測轉基因植株，對篩選出的陽性植株利用常規的分子檢測技術進行進一步驗證，獲得穩定轉化的轉基因植株T1代；次年，將收穫的T1代種子進行大田種植，重複上述步驟，直至獲得穩定轉化的T3代轉基因植株。
所述獲得的轉基因T3代植株耐旱性鑑定方法是採用生理生化指標和盆栽鑑定相結合的策略，篩選出耐旱能力明顯提高的株系，從中選擇優異材料培育棉花耐旱新種質。本發明所述獲得的轉基因棉花為轉LEA基因陸地棉新陸早18號棉花T3代轉基因植株。本發明的實驗證明與野生型和轉空載體植株相比，轉LEA基因棉花的抗旱性得至IJ增強。本發明獲得的轉基因植株可直接應用於棉花的常規品種或雜交品種培育。本發明的基本思路是依據植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新進展，利用從本土抗逆植物紫杆檉柳中克隆的、與抗逆性密切相關的晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)基因，採用轉基因技術，將能夠顯著提高植物細胞中抗旱特性的LEA基因導入棉花品種中，實現該基因的過表達，從而大幅度提高植株的耐旱性。轉基因棉花採用花粉管通道法，轉基因植株用PCR檢測、RT-PCR驗證；外源基因表達研究採用實時螢光定量PCR方法。植株抗逆 性採用植物生理學和作物栽培學方法，其中轉基因植株抗旱性測定採用水培試驗-生理指標測定，同時結合盆栽試驗進行驗證。在棉花的遺傳轉化中，以我國新疆地區主載的陸地棉品種新陸早18號為受體材料，採用花粉管通道法進行轉化。採用夏季在新疆育種，冬季到海南加代的方法，一年可繼代育種2次，直至獲得穩定遺傳的轉基因T3代植株。轉基因遺傳穩定性測定採用經典的遺傳學方法，結合於PCR檢測。本發明實施的具體步驟為將LEA基因通過常規分子生物學方法插入到植物轉基因表達載體中，並通過花粉管通道法導入到棉花受體材料中，獲得轉基因植株。通過大田卡那黴素檢測和室內分子檢測，經過繼代培養並每代進行嚴格的陽性植株篩選，直至獲得穩定遺傳的T3代轉基因植株。轉基因抗旱材料的抗逆性鑑定和利用，根據目的基因過表達的生理作用，進行相應的生理生化指標檢測，並通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉基因育種材料，獲得的優異材料用於棉花育種或生產實踐。


圖I為本發明pROKII-LEA植物表達載體構建示意圖。圖2 為本發明 pROKII-LEA 質粒 PCR 電泳圖。其中 M DNA marker ；Lanel,2 pROKII-Lea質粒；A為LEA基因特異引物PCR電泳圖，B為載體引物PCR電泳圖。圖3為本發明轉基因棉花的RT-PCR電泳圖。其中Lane M DL2000marker ；Lane2,4，6，7 :轉基因棉花陽性植株；Lane 3,5 :轉基因棉花陰性植株；Lane8 :pR0KII-Lea質粒。圖4為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後LEA基因實時螢光定量PCR圖。WT :轉空載體樣品，即對照；L1，L2，L3 :轉基因植株乾旱處理前樣品；dLl，dL2，dL3 :轉基因植株乾旱處理12小時後樣品。圖5為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後棉花生長圖。從左至右分別為WT，LI，L2，L3.圖6為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後棉花葉片丙二醛(MDA)含量。
圖7為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後棉花葉片游離脯氨酸含量。圖8為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後棉花葉片可溶性糖含量。圖9為本發明12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後棉花葉片可溶性蛋白含量。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例(抗旱轉基因棉花創製)I、植物表達載體的構建LEA基因克隆自紫杆檉柳(Tamarix androssowii),由東北林業大學王玉成博士饋贈。紫杆檉柳LEA基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示，基因序列為lgcacgaggcc tcgtgccgaa ttcggcacga ggattcattc ttcaaagaaagtgggaatca6lgagagagaaa gagagagcgg tagtccaccc tatctgtgct cctgtattgccgacgaacag121aacctcggtt cagaaattaa ctttggaaaa ggagaaaatg gctcgctgctcttactctaa181tgctaagctc gtctctaccc tcgtcgtcga caatctctcc cttgctctctccaggaggag241ttacgcgcaa ggcatggtga tgtccaactc cagcaacgtc atgcgaagagcaggcggtag301taataatgct acatctacca ccccaaacga tgagaattca tgggtgccggatcctgttac361cggttactac aggccggcta atcatgccga tgacgtcgac gtcgctgagcttcgtgagat421gcttctgact accagcaatg cgaacaagtt caatcgatcc tctcactgaatgatttgaat481tttgattttg aggcggtggg aaaccatggc tgattgggtt ttgttccatatgtgatgccg541cgtgtttcgc cgcctcgtga tttattgctg ttgttgttgt tgttcggatttcggaagttt601tgtacccttg ctagcccggt cctttaattt catgcggttt gcgtgtatttttatcagatt661caacttcgag ttgaagaaaa aaaaa其中，158至469鹼基序列為開放閱讀框ORF ；由該基因編碼的紫杆檉柳晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)胺基酸如Genebank號ABG54481所示，其胺基酸序列為MARCSYSNAKLVSTLVVDNLSLALSRRSYAQGMVMSNSSNVMRRAGGSNNATSTTPNDENSWVPDPVTGY YRPANHADDVDVAELREMLLTTSNANKFNRSSHo將上述LEA基因插入含有35S啟動子的pROKII植物表達載體中，構建pROKII-LEA植物表達載體，Lea基因的酶切位點Sma I和Sac I。植物表達載體構建過程參見圖I。將上述構建的pROKII-LEA表達載體轉化大腸桿菌DH5 a，為了驗證載體和質粒的可靠性，用了兩對引物進行PCR檢測及酶切驗證。兩對引物分別為LEA 基因特異引物(Lea-fj, ccggaatggctcgctgctcttactc-3 1 , Lea~r 5 1 -cccttgttcgcattgctggtagtca-3 ');載體弓丨物(prl 5 ' -gttgcagcaagcggtcc-3 ' , pr2 5' -cgcacatcccactatcc-3'),其中，載體引物跨越35S啟動子及Nos終止區域序列,包含載體918bp片段部分；兩種引物PCR結果一致(圖2A，B)，表明Lea基因確實構建至pROKII載體上，測序表明基因準確連接並成功轉化大腸桿菌。2、轉基因棉花T3代植株獲得用改進的鹼裂解法大量提取pROKII-LEA質粒。棉花首次於2009年I月在海南三亞中國農科院棉花基地利用花粉管通道法進行遺傳轉化，導入量為每朵花0. I i! g質粒DNA，轉化的棉花品種為新陸早18號。收穫的Ttl代種子於2009年5月在新疆農科院庫爾勒棉花實驗基地播種，至3片葉期時經田間卡那黴素檢測和室內PCR檢測的陽性株於2009年10月收穫種子，得到T1代種子。同樣方法重複冬季在海南加代繁殖(T2代)、夏季在新疆繼代繁殖(T3代)，並每代經田間卡那黴素檢驗，直至收穫T3代種子，並於2011年5月在新疆庫爾勒棉花實驗基地播種，種植至2 3片葉期時，將40株卡那黴素檢測陽性的T3代棉花幼苗從庫爾勒棉花基地轉移至烏魯木齊中國科學院新疆生態與地理研究所植物逆境生物 學實驗室，進行陽性植株檢測。首先用5g/L的卡那黴素溶液塗抹葉片同一部位連續塗抹3天以進一步驗證大田卡檢結果，結果40株中有31株為卡那黴素檢測陽性植株。7天後對31株陽性株進行室內分子檢測。室內利用改良的CTAB法提取棉花基因組DNA，通過PCR法確定陽性株系。最終獲得5株轉化陽性苗(見圖3)，然後進行Southern和Northern分析，最終選擇T3代LEA基因能夠轉錄表達、並單拷貝插入基因組的3個株系，31號、56號、63號，並選擇陰性株36號做對照。將棉花重新編號，36號是轉pROKII空表達載體的T3代棉花植株，用WT表示；31號、56號、63號植株分別被編號為LI、L2、L3。3、轉基因植株的抗旱性檢測將上述T3RLl, L2，L3轉基因棉花及WT的棉花幼苗小心地從花盆土中挖出，挖取時用細水衝洗細根保證所有細根從土中剝離，使細根不受損傷，然後將從土中取出的棉花幼苗放入直徑15cm高30cm的圓柱形培養瓶中液體培養，並用支持板固定植株，培養液為holgland營養液，每周更換一次，充分通氣；培養瓶外周用錫箔紙包好，進行遮光處理，將水培棉花放到組培室中進行培養，組培室條件為溫度28°C，溼度45%，關照時間14h (光照)/10h (黑暗)，光強 7000Lux(TES1330A Digital Lux Meter)。2周後，待棉花生長穩定，對其進行乾旱處理。將棉花放入12% (w/v)的PEG-6000holgland營養液中處理12個小時，分別選取乾旱處理前、乾旱處理12小時後生長狀態一致的同一部位葉片進行如下(I)、(2)的研究(I)轉基因植株LEA基因轉錄水平表達量分析分別提取12% (w/v)PEG-6000處理前、後的棉花葉片總RNA。利用實時螢光定量RT-PCR分析LEA基因轉錄水平表達量，以檢測LEA基因對乾旱的響應情況，以18srRNA和UBQ7為實時螢光定量RT-PCR的內參基因；結果如圖4所示結果表明，相比較乾旱處理前，轉基因棉花在模擬乾旱處理12小時後LEA基因表達量顯著增加3-5倍，說明乾旱脅迫誘導LEA基因的表達及積累。(2)轉基因植株抗旱性生理指標測定
實驗重複3次。①丙二醛(MDA)含量變化丙二醛(MDA)含量變化結果見圖6，結果表明乾旱脅迫前，WT和轉基因棉花MDA含量差別不顯著；模擬乾旱脅迫12小時後，WT和轉基因棉花的丙二醛含量都呈現上升趨勢，但WT的丙二醛含量極顯著高於轉基因棉花；結果表明在乾旱脅迫發生的情況下，轉LEA基因棉花植株可以顯著減少丙二醛的生成量。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產物之一，具有很強的毒性。膜脂過氧化會引起膜中蛋白質聚合、交聯以及類脂的變化，使膜上的孔隙變大，通透性增加，離子大量外洩引起細胞代謝紊亂，嚴重時導致植物受傷或死亡，因此丙二醛含量高低可用以衡量植物在逆境脅迫下生物膜受活性氧傷害的程度，在模擬乾旱脅迫試驗中，轉LEA基因棉花植株可 以有效減少丙二醛的生成量，降低膜脂的氧化程度，保護膜脂的穩定性。因此，轉LEA基因棉花有助於在乾旱脅迫時保護膜脂穩定，進而保護細胞膜的完整性與穩定性，對於植株正常生命活動的維持發揮重要作用。②游離脯氨酸含量變化結果游離脯氨酸含量變化結果見圖7，結果表明乾旱脅迫前，WT和轉基因棉花游離脯氨酸含量差別不顯著；模擬乾旱脅迫12小時後，WT和轉基因棉花的游離脯氨酸含量都呈現上升趨勢，並且轉基因植株的增幅為WT的4-7倍，LI的游離脯氨酸含量極顯著高於WT，L2的游離脯氨酸含量顯著高於WT，L3的游離脯氨酸含量與WT雖然無顯著性差異，但是從圖中仍可以看出L3的值高於WT，總體結果顯示在乾旱脅迫發生的情況下，轉LEA基因棉花植株可以提高游離脯氨酸的含量。游離脯氨酸是重要的滲透調節物質，植物內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱性的生理指標。另外，由於脯氨酸親水性極強，能穩定原生質體及組織內的代謝過程，因而能有效防止細胞脫水的作用。本研究創製的轉LEA基因棉花植株在乾旱脅迫發生的情況下，可顯著提高游離脯氨酸的含量，對於增加棉花的抗旱性能有貢獻。這可能與LEA基因可作為一種調節蛋白而參與植物滲透調節的功能有關。③可溶性糖含量變化可溶性糖含量變化結果見圖8，結果表明乾旱脅迫前，WT和轉基因棉花可溶性糖含量差別不顯著；模擬乾旱脅迫12小時後，WT和轉基因棉花的可溶性糖含量都呈現上升趨勢，並且轉基因植株的增幅為非轉基因植株的3倍左右，LI、L2的可溶性糖含量顯著高於WT，L3的可溶性糖含量極顯著高於WT。總體結果表明在乾旱脅迫發生的情況下，轉LEA基因棉花植株可以提可溶性糖的含量。在乾旱脅迫下，植物通過滲透調節保持細胞內溶質積累，保證組織水勢下降時細胞膨壓得以維持，細胞內可溶性糖濃度的提高可增強細胞的滲透吸水能力從而增強植物的抗旱性。本研究創製的轉LEA基因棉花植株在乾旱脅迫發生的情況下，可顯著提高可溶性糖含量和生成量，提高植株的抗旱性。④可溶性蛋白含量變化可溶性蛋白含量變化結果見圖9，結果表明乾旱脅迫前，WT和轉基因棉花可溶性蛋白含量差別不顯著；模擬乾旱脅迫12小時後，WT和轉基因棉花的可溶性蛋白含量都呈現上升趨勢，並且轉基因植株的增幅為非轉基因植株的5倍左右，LI、L2、L3的可溶性蛋白含量均顯著高於WT。結果表明在乾旱脅迫發生的情況下，轉LEA基因棉花植株可以提可溶性蛋白的含量。如細胞內可溶性糖一樣，在乾旱脅迫下，可溶性蛋白濃度的提高可增強細胞的滲透吸水能力從而增強植物的抗旱性。本研究創製的轉LEA基因棉花植株在乾旱脅迫發生的情況下，可顯著提高可溶性蛋白含量和生成量，提高植株的抗旱性。(3)轉基因植株生物量及抗旱 性形態指標測定當用12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理水培棉花時，4小時後，WT出現萎蔫現象，6小時後，轉基因棉花開始出呈現萎蔫狀態。處理12小時後，WT葉片枯萎，有3片葉子卷葉嚴重，且頂端葉片邊緣也出現枯萎跡象。相比較而言，轉基因棉花受乾旱脅迫影響較小，只有最基部2個葉片表現出枯萎跡象，雖然L3個體比WT小，但它的葉片枯萎程度明顯好於WT，頂端葉片邊緣也無枯萎跡象(如圖5)。可見，在水分脅迫實驗中轉LEA基因棉花植株表現出更強的抗旱性。12% (w/v)PEG-6000模擬乾旱處理12小時後，繼續水培棉花45天，holgland營養液每周更換一次，充分通氣。至棉花開花前測定它們的生物量指標，如表I所示；測定它們的抗旱性形態指標，如表2所示。表I棉花生物量數據表
植株編號葉乾重(g)莖幹重(g)根乾重(g)總生物量(g)
WT 1.483 0.9740.3542.811LI 2.697 1.8850.7965.378 L2 3.203 2.1550.966.318 L3 1.69 0.990.5863.266表2棉花形態指標數據表
植株編
葉片數株高(cm) 莖直徑(cm)主根長(cm)
號
WT13430.74511.9
LI16480.76625.1
L215500.86417.4
L314440.71321.6結果表明轉LEA基因棉花與WT相比，其葉片數增多，植株高大，莖直徑變大，主根長度增加；烘乾後發現，無論是根、莖、葉分營養器官組分還是總生物量，轉基因植株的生物量均高於WT。結果表明植物在受到水分脅迫時，轉LEA基因棉花的植株生長，地上及地下乾物質積累程度都明顯優於非轉基因棉花。
權利要求
1.一種利用晚期胚胎發生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉基因棉花中的應用，其特徵在於按下列步驟進行 a、將晚期胚胎發生豐富蛋白基因通過常規分子生物學方法插入到植物轉基因表達載體中，並通過花粉管通道法導入到棉花受體材料中，獲得轉基因植株； b、通過大田卡那黴素檢測和室內分子檢測，經過繼代培養並每代進行嚴格的陽性植株篩選，直至獲得穩定遺傳的T3代轉基因植株； C、轉基因抗旱材料的抗逆性鑑定和利用，根據目的基因過表達的生理作用，進行相應的生理生化指標檢測，並通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出抗旱性能明顯提高的轉基因育種材料，獲得的優異材料用於棉花育種或生產實踐。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於所述晚期胚胎發生豐富蛋白的胺基酸序列如 Genebank 號 ABG54481 所不。
3.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於所述晚期胚胎發生豐富蛋白編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所不。
4.根據權利要求書I所述的應用，其特徵在於所述用於遺傳轉化的棉花品種為早熟棉新陸早18號。
全文摘要
本發明涉及一種晚期胚胎發生豐富蛋白及其編碼基因在培育抗旱轉基因棉花中的應用。所述晚期胚胎發生豐富蛋白(LEA)的胺基酸序列如Genebank號ABG54481所示；所述編碼基因的核苷酸序列如Genebank號DQ663481所示；將LEA基因重組到一個植物表達載體中，轉化入棉花細胞並讓其表達，獲得轉基因植株，從轉基因植株及其後代中篩選出穩定遺傳的T3代植株，培育出棉花抗旱育種新種質，進而創建出棉花抗旱育種新材料，以用於棉花的常規品種或雜交品種培育。
文檔編號C07K14/415GK102732552SQ20111039321
公開日2012年10月17日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者張道遠, 李小雙, 楊紅蘭, 蔡明 , 裴金玲 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所