Sars病毒抗體檢測方法及快速診斷試劑盒和製備方法
2023-05-22 11:07:11 1
專利名稱：Sars病毒抗體檢測方法及快速診斷試劑盒和製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於診斷、檢測SARS冠狀病毒抗體的方法，以及用於該方法的SARS冠狀病毒抗體金標快速診斷試劑盒和其製備方法。
背景技術：
嚴重急性呼吸系統綜合症(SARS)是一種近期發生於世界許多國家的人類突發性傳染病，是人類所面臨的一種突如其來的災難。SARS的防治已成為當前最重要的工作，廣大的醫務工作者正在奮戰抗擊SARS的前線，世界各國科學家正在研究SARS的防治辦法，包括診斷方法、治療藥物和預防疫苗。美國《科學》雜誌5月1日刊登了兩份SARS病毒基因組系列研究論文，這是首批經過同行評議SARS病毒基因組研究結果。美國和加拿大研究人員組成的兩個科研小組在研究結果中證實SARS病毒是一種全新的冠狀病毒。我國軍事醫學科學院微生物流行病研究所與中國科學院北京基因組研究所合作，也於4月15日完成了對SARS冠狀病毒的全基因組序列測定，基因組序列為29，727個核苷酸。SARS冠狀病毒基因組序列的測定，對於抗SARS藥物篩選、疫苗研製和建立快速診斷試劑具有重大的意義。
目前對SARS要做到早發現、早治療、早隔離。所以要求既檢測SARS病人的抗原，又要檢測SARS病人的抗體。抗體檢測除了IgG外，還要檢測其病毒特異的IgM，因為IgM在發病早期或急性期即可檢測到，有的甚至在潛伏末期即可檢測到。
SARS目前診斷方法主要有三種(1)病毒核酸檢測-PCR擴增方法，早期檢測，(2)抗體檢測ELISA和免疫螢光技術。(3)SARS病毒感染細胞培養模型。以上免疫檢測技術均採用SARS病毒感染細胞為抗原，培養的病毒抗原存在製備困難，有一定的危險性，不能大量生產，並可出現特異性差。
發明內容
本發明的第一目的是為了提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體的檢測方法，該方法為一步法檢測方法，靈敏度高、特異性強而且速度快、操作簡便，無需專門設備，適用於臨床檢測、流行病學調查和場地檢疫等多種場合。
本發明的第二目的是為了提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒，該試劑盒針對SARS冠狀病毒變異株抗體檢測提供一種簡便而且直接的一步法檢測盒，利用該試劑盒檢測SARS冠狀病毒變異株抗體的靈敏度高、特異性強，而且速度快、操作簡便，無需專門設施。
本發明的第三目的是為提供一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，該方法簡便、穩定性好、重複性好。
本發明的第一目的可通過如下措施來實現一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法，包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載於玻璃纖維或無紡部布載體上並在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴於膠體金標記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
本發明的第二目的可通過如下措施來實現一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒內設SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板。
所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板是在襯板上設有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和吸水端吸水層之間設有金標抗人Ig抗體層；檢測層上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線。
本發明的第三目的可通過如下措施來實現一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法主要包括製備金標抗體層和檢測層的控制線和檢測線的包被，然後在襯板上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標測試條和檢測板。
所述的金標抗體層的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備在濃度為0.004-0.012％的氯金酸中加入其體積的1.3-2％、濃度為1-3％的擰檬酸三鈉，煮沸10-20分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液ii膠體金標記抗人Ig(IgG，IgM)抗體，在膠體金溶液中用0.2mol碳酸鉀溶液調pH8.0-8.4，按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗體，攪拌後，再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動物血清蛋白，4℃靜置2-4小時iii將上述混合溶液經2000轉/分鐘離心10-15分鐘，去沉澱物，得上清液iv將上清液經10000轉/分鐘離心60-80分鐘離心得沉澱物v將沉澱物按4-10ml/100ml溶於0.02M、Ph7.4 Tris-HCl緩衝液得金標抗體溶液該緩衝液中含0.2-0.6％的動物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將金標抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止而形成金標抗體層。
所述膠體金標記抗體為抗人Ig(IgG，gM)。
所述的檢測層是在纖維素膜上設有基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原構成的檢測線和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。其製備方法是在濃度為0.8-2.4mg/ml的抗原或抗體溶液中加入1-3％的固定劑，再利用噴膜機將抗原或抗體噴在纖維素膜上，噴膜後37℃乾燥，再用0.01ml pH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃乾燥。
本發明相比現有技術具有如下優點1、本發明檢測、診斷SARS冠狀病毒變異株抗體的方法為一步法，具有較高的特異性和靈敏性，且操作簡便，無需專門設施。
2、本發明的診斷試劑盒檢測SARS冠狀病毒變異株抗體時具有較高的特異性和靈敏性，檢測過程操作訊速、快捷、方便，適用於臨床檢驗、流行病學調查和場地檢疫等多種場合，3、本發明的診斷試劑盒的製備方法簡便、穩定性好、重複性好。
圖1是本發明檢測板的外觀結構示意圖1—檢測板2—加樣孔3—觀察孔圖2是本發明檢測板的內部結構示意圖4—加樣端吸水層5—金標抗體層6—控制線7—檢測線8—檢測層9—吸水端吸水層10—襯板具體的實施方式本發明還將結合實施例作進一步詳述實施例一一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載於玻璃纖維或無紡部布載體上並在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴於膠體金標記抗體的載體上，如血清含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
參照圖1，一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒內設SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板1。
參照圖2，所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板1是在襯板10上設有加樣端吸水層4、檢測層8和吸水端吸水層9，在檢測層和吸水端吸水層9之間設有金標抗人Ig抗體層5在檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾紙製成；檢測層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜；金標抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標記抗體製成。
一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法主要包括製備金標抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)和檢測線(7)的包被，然後在襯板(10)上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標測試條和檢測板(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水紙層4和吸水端吸水層9；在其中段粘貼包被抗體的纖維素膜層8，在加樣端吸水紙層4於纖維素膜層8的交接部位，夾貼含金標抗體5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5部分在纖維素膜層8上。然後按4毫米寬、8釐米長規格切條，再組裝在塑料盒內。盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。
所述的金標抗體層5的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備，取100mg氯金酸溶於1000ml三蒸水中，加入15ml、濃度為1％的擰檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻後得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記抗人Ig抗體，取100ml膠體金溶液，用0.2mol碳酸鉀溶液調pH8.4，加入6mg抗人IgG單克隆抗體，攪拌20分鐘，再加入240mg牛血清白蛋白，繼續攪拌5分鐘，4℃靜置2-4小時iii將上述混合溶液經2000轉/分鐘離心10分鐘，去沉澱物，得上清液iv將上清液經10000轉/分鐘離心60分鐘離心得沉澱物v將沉澱物按4m10ml溶於0.02M Ph7.4 Tris-HCl緩衝液得金標抗體溶液該緩衝液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％疊氮鈉vi將金標抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，在37℃下2小時乾燥而形成金標抗體層5。
所述膠體金標記抗體為抗人IgG單克隆抗體。
所述的檢測層8是在纖維素膜上設有基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原構成的檢測線和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其製備方法是取基因工程SARS冠狀病毒變異株抗原，調濃度為1mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7；再取羊抗鼠IgG抗體調濃度為2mg/ml，加入2％的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5cm處，噴控制線6，按20ul/10cm設置噴膜量，噴膜37℃乾燥，2小時，再用0.01mpH7.0含10％小牛血清的PBS，在37℃下封閉30分鐘，0.01ml pH7.0的PBS漂洗，37℃乾燥。
實施例二SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法及其金標快速診斷試劑盒與例一同。
該試劑盒的製備方法除製備膠體金標記的抗體為抗人IgM單克隆抗體外，其他條件與例一同。
權利要求
1.一種SARS冠狀病毒變異株抗體檢測方法，包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗人Ig抗體包括IgG和IgM載於玻璃纖維或無紡部布載體上並在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴於膠體金標記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性。
2.一種SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒內設SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板(1)。
3.如權利要求2所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒，其特徵在於所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板(1)是在襯板(10)上設有加樣端吸水層(4)、檢測層(8)和吸水端吸水層(9)，在檢測層(8)和吸水端吸水層(9)之間設有金標抗人Ig抗體層(5)在檢測層(8)上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線(7)和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
4.一種權利要求2所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於主要包括製備金標抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)和檢測線(7)的包被，然後在襯板(10)上組合SARS冠狀病毒變異株抗體金標測試條和檢測板(1)。
5.如權利要求4所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的金標抗體層(5)的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備，採用公知的膠體金製備工藝製備膠體金ii膠體金標記抗人Ig(IgG，IgM)抗體，在膠體金溶液中按4-12mg/100ml加入抗人Ig抗體，經攪拌後再在溶液中按0.1-0.6g/100ml加入動物血清蛋白；iii將上述混合液經離心去沉澱物，得上清液iv將上清液離心得沉澱物v將沉澱物按4-10ml/100ml溶於0.02M、Ph7.4 Tris-HCl緩衝液得到金標抗體溶液該緩衝液中含0.2-0.6％的動物血清蛋白和0.01-0.06％疊氮鈉vi將金標抗體溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止而形成金標抗體層(5)。
6.如權利要求4或5所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述膠體金標記抗體為抗人Ig(IgG，gM)。
7.如權利要求4所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的檢測層(8)是在纖維素膜上設有SARS冠狀病毒變異株抗原構成的檢測線(7)和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權利要求7所述的SARS冠狀病毒變異株抗體金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的SARS冠狀病毒變異株抗原是採用基因工程製備而成。
全文摘要
本發明涉及一種SARS病毒抗體檢測方法及快速診斷試劑盒和製備方法，其檢測方法包括(1)將膠體金標記的抗人Ig抗體載於載體上並在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線(2)取人血清滴於膠體金標記抗體的載體上，如血清中含有SARS冠狀病毒變異株抗體則在檢測載體上形成檢測線、控制線雙線為陽性，否則為陰性；該診斷試劑盒包括SARS冠狀病毒變異株抗體金標檢測板；該檢測板是包括加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和吸水端吸水層之間設有金標抗人Ig抗體層；檢測層上包被有由SARS冠狀病毒變異株抗原形成的檢測線和由抗鼠IgG抗體形成的控制線；本發明的方法為一步法檢測方法，靈敏度高、特異性強；而且速度快、簡便，無需專門設施。
文檔編號G01N33/531GK1570638SQ03134419
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月22日 優先權日2003年7月22日
發明者李克生, 杜惠芬, 劉奇 申請人:李克生