HIV疫苗及其製備方法與流程
2023-05-23 01:01:46
本發明屬於疫苗領域，具體涉及一種基於構象誘導加特異性表位選擇加強免疫策略的新型愛滋病疫苗以及其製備方法。
背景技術：
愛滋病(aids)是由感染人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)引起人淋巴cd4t細胞大量死亡而導致的獲得性免疫缺陷症候群(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)。1981年發現首例愛滋病病例後，愛滋病迅速在全球範圍內蔓延擴散。根據聯合國愛滋病規劃署的估計，截至2015年底，全球仍有約3670萬愛滋病毒感染者。同年，約200萬人新感染了愛滋病毒，120萬人死於愛滋病毒相關原因，已經嚴重威脅全球的人類健康，嚴重危害社會進步和經濟增長，是全球所面臨的重大挑戰之一。如何有效預防hiv感染，降低發病率和死亡率是我國乃至全球面臨的緊迫任務。
疫苗是控制hiv傳播和感染的有效手段。遺憾的是，目前尚無有效的疫苗被批准上市。rv144是目前唯一一個在臨床試驗上證明具有一定保護效果的疫苗，臨床試驗表明其有31.2％的保護效果(3)。隨後的免疫分析發現其具有保護效果的原因(4)主要為：1)抗hiv保護率與疫苗接受者體內識別hiv包膜蛋白gp120v1v2區的igg抗體含量水平成正相關；2)抗hiv保護率與疫苗接受者體內血漿中識別hiv包膜蛋白iga的水平成負相關。血漿中該類iga可能跟該類igg競爭結合包膜蛋白，從而阻止該類igg發揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)，降低對hiv感染細胞的殺傷作用而削弱疫苗的保護效果。並且，針對v1v2區的igg所具有的adcc效應被認為與rv144具有保護效果密切相關，可能起到了關鍵作用。因此，如何誘導出更高水平的識別hiv-1天然構象v1v2的特異性igg及該igg介導的adcc能力、同時減少刺激產生識別包膜蛋白的iga，是hiv疫苗設計的關鍵技術瓶頸之一。
之前的研究表明，利用假病毒去免疫動物，免疫得到的抗體既能夠識別病毒包膜蛋白也能夠識別含有某一表位序列的多肽。但是，用含有某一表位序列的多肽作為抗原免疫動物所得到的抗體僅能識別該多肽抗原，而極難識別具有天然構象的病毒包膜蛋白(圖1)。因此，單純利用多肽免疫很難誘導產生識別結合天然構象病毒包膜蛋白的抗體，這是目前hiv疫苗研究中的共識。造成這一現象的原因可能是相同序列在多肽上的構象與在病毒上的天然構象不同。
目前這種以多肽為抗原的表位疫苗設計方案面臨以下幾個重要問題：1)表位多肽分子量相對小，免疫原性較弱；2)由於多肽抗原只包含關鍵表位的胺基酸序列，沒有較多的周圍輔助結構，所以很難具有類似於病毒上該表位的天然構象，因此有些多肽抗原很難誘導出能夠識別具有天然構象相應表位的抗體。例如，之前的研究表明，利用hiv-1gp41上mper區的表位多肽，誘導產生的抗體僅能夠識別該表位多肽，而對hiv的識別能力較差，沒有中和活性(1,2)。因此，如何利用表位疫苗誘導出識別病毒上具有天然構象的相應表位的抗體是hiv疫苗設計的一個難題。
技術實現要素：
針對以上兩個技術難點，我們在本發明中創新地提出了構象誘導加特異表位篩選的方法，來解決現有的hiv疫苗所存在的保護效果不高的問題。本發明提出的構象誘導加特異表位選擇加強免疫的設計能夠有效地解決利用線性表位疫苗難以誘導識別具有天然構象的該表位的抗體的難題，增強疫苗的抗病毒保護效果。
因此，一方面，本發明涉及一種愛滋病組合疫苗，其包含按以下順序分別接種的組分：
(a)表達包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白的dna；
(b)包含hivgp120蛋白序列或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白；和
(c)包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供了一種用於預防愛滋病的試劑盒，其包括：
(1)本發明在第一方面的愛滋病組合疫苗；和
(2)接種所述愛滋病組合疫苗的說明書。
在本發明的第三方面，提供了本發明在第一方面的愛滋病組合疫苗在製備用於預防愛滋病的藥物中的用途。
在本發明的第四方面，提供了一種對受試者進行免疫接種用於預防愛滋病的方法，包括以下步驟：
i.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(a)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行初次免疫(初免)；
ii.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(b)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行第一次加強免疫，優選地在初次免疫(初免)兩周後進行第一次加強免疫；並且
iii.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(c)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行第二次加強免疫，優選地在第一次加強免疫兩周後進行第二次加強免疫。
本發明的構象誘導加特異性表位選擇加強免疫的策略顯著提高了識別天然構象hiv-1gp120v1v2區的特異性igg抗體的水平，有效減少了免疫動物血漿中的識別hiv-1env的iga的產生；在此基礎上，顯著提高了adcc效應(圖7，圖8)。
附圖說明
圖1是現有技術中的多肽疫苗所遇到的技術難點的說明圖。
圖2是本發明的構象誘導加特異性表位選擇加強免疫之設計原理的示意圖。
圖3是示出jrfl-v1v2ab(jr-fl假病毒免疫後純化的v1v2特異性抗體)和pep-v1v2ab(v1v2多肽免疫後純化的v1v2特異性抗體)與v1v2多肽的識別情況的柱狀圖。
圖4是示出jrfl-v1v2ab識別細胞表達的天然構象的hiv-1包膜蛋白而pep-v1v2ab不識別該天然構象的hiv-1env的圖表。
圖5是示出構象誘導加特異性表位選擇加強的免疫策略提高識別天然構象hiv-1v1v2區的igg的水平的柱狀圖。
圖6是示出構象誘導加特異性表位選擇加強的免疫策略降低識別天然hiv-1env的iga的水平的柱狀圖。
圖7是示出構象誘導加特異性表位選擇加強的免疫策略獲得的特異性抗體具有更強adcc效應激活作用的柱狀圖。
圖8是示出構象誘導加特異性表位選擇加強的免疫策略獲得的特異性抗體具有誘導更強adcc效應的柱狀圖。
具體實施方式
在本公開文本中提到的所有出版物均以全文引用的方式納入本文，用於描述和公開出版物中所描述的方法，該方法可與本文中的描述聯合使用。在本申請上下文中討論的出版物僅僅由於其在本申請的申請日之前公布而被提供。此外，關於納入引用文獻中的類似或相同術語以及在本公開中明確定義的術語，在所有方面均以本公開文本中提供的術語定義為準。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與本公開所屬領域的普通技術人員通常所了解的含義相同。本文描述了示例性的方法、裝置和材料，但是與本文所述的方法和材料類似或同等的方法和材料都可用於所公開的方法和組合物的實施中。
在本文中，術語「包含」為開放式描述，表示除了該術語之後所列組分之外，還可以包含其它組分，前提條件是該其它組分不幹擾或者不顯著幹擾想要獲得的技術效果。類似的表述可以為例如「包括」、「含有」、「主要由……組成」、「基本由……組成」。另外，該術語「包含」還可以僅包含其後所列組分，類似的表述可以為例如「由……組成」、「僅包含」。
在本文中，術語「多肽」以其常規含義使用，即作為胺基酸序列使用。多肽不限於特定長度的產品。肽和蛋白質均包括在多肽的定義內，並且這三個術語可以在本文中互換使用，除非以其他方式具體指明。
本領域已知，動物或者人體內存在各種各樣的淋巴細胞克隆。利用不同抗原進行免疫能夠得到分泌針對所述不同抗原的抗體的多種淋巴細胞克隆。具體到本發明所涉及的人類免疫缺陷病毒(hiv)，(a)當用v1v2多肽免疫時，能夠誘導出可識別v1v2多肽的淋巴細胞克隆，然而該淋巴細胞克隆所分泌的抗體大多數僅可識別v1v2多肽而不能識別在細胞表面表達的天然構象env。(b)當利用表達天然構象的hivenv的dna免疫時，能夠誘導出分泌針對env之不同表位的抗體的各種淋巴細胞克隆，並且即便進一步利用相同dna增強免疫，誘導分泌出的抗體仍然針對env不同表位，能夠分泌針對某一有效表位的抗體的淋巴細胞比例依然很低，甚至由於該表位不是顯性表位，多次免疫後的特異性抗體比例更低。(c)當利用表達天然構象env的dna免疫時，能夠誘導出分泌針對env之不同表位的抗體的各種淋巴細胞克隆，進一步利用gp120單體免疫兩次，能夠誘導出分泌識別gp120單體的抗體的淋巴細胞克隆。相比於env，gp120上的表位要少得多，因此能夠適當提高分泌有效抗體的淋巴細胞的比例，但是該比例依然較低(圖2之(a)至(c))。
本申請發明人結合愛滋病疫苗領域的最新進展以及現有的rv144疫苗的經驗，發現利用構象誘導加特異性表位加強免疫的策略，可以有效地解決以上難題，提升rv144疫苗提示的所有保護相關因素。
本發明人提出的構象誘導加特異性表位選擇加強免疫的策略如下：首先利用表達天然構象env的dna進行初次免疫，然後用gp120單體蛋白加強免疫，最後利用v1v2多肽進一步選擇和加強(圖2之(d))。
具體地，在本發明中，發明人通過利用能夠表達天然構象env的dna比如質粒進行初次免疫，能誘導產生識別天然構象env的抗體。隨後，利用gp120蛋白加強免疫，從而激發產生出更多gp120特異性抗體。最後，利用含有v1v2區的多肽加強誘導針對v1v2區的抗體產生的免疫反應，由此可以產生識別天然構象v1v2的特異性抗體，並且其數量和比例得以選擇性提升，達到刺激增強特異性有效抗體產生的目的。
本發明中的實驗結果顯示，通過本發明中的新策略顯著增加了識別天然構象v1v2區的特異性igg抗體的產生，有效降低了免疫動物血漿中識別env的iga水平(圖5-圖6)。在此基礎上，可以顯著提高adcc效應(圖7-圖8)。adcc是指抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用，其被認為是rv144疫苗產生保護效應的關鍵因素(5)。
因此，本發明一方面涉及一種愛滋病組合疫苗，其包含按以下順序分別接種的組分：
(a)表達包含hiv-1包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白的dna；
(b)包含hiv-1gp120蛋白序列或與所述hivgp120蛋白序列具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白；和
(c)包含hiv-1gp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽。
在一個實施方案中，所述hiv病毒可以為hiv-1或者hiv-2，優選為hiv-1。
在本文中，術語「包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白」是指除了包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列自身之外，任選地還包含其它不影響所述hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的表達和免疫原性的胺基酸序列。本領域技術人員根據其所掌握的普通技術知識可以很容易地確定可以包含的胺基酸序列。
在本文中，術語「與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列」是指與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同源的胺基酸序列。
在一個實施方案中，所述hiv包膜蛋白的序列為seqidno:1，如下所示：
mrvkgirksyqylwkggtlllgilmicsaveklwvtvyygvpvwkeatttlfcasdakaydtevhnvwathacvptdpnpqevvlenvtehfnmwknnmveqmqediislwdqslkpcvkltplcvtlnckdvnatnttndsegtmergeikncsfnittsirdevqkeyalfykldvvpidnnntsyrliscdtsvitqacpkisfepipihycapagfailkcndktfngkgpcknvstvqcthgirpvvstqlllngslaeeevvirsdnftnnaktiivqlkesveinctrpnnntrksihigpgrafyttgeiigdirqahcnisrakwndtlkqiviklreqfenktivfnhssggdpeivmhsfncggeffycnstqlfnstwnnntegsnntegntitlpcrikqiinmwqevgkamyappirgqircssnitgllltrdgginengteifrpgggdmrdnwrselykykvvkieplgvaptkakrrvvqrekravgigavflgflgaagstmgaasmtltvqarlllsgivqqqnnllraieaqqrmlqltvwgikqlqarvlaverylgdqqllgiwgcsgklicttavpwnaswsnksldriwnnmtwmewereidnytseiytlieesqnqqekneqelleldkwaslwnwfditkwlwyikifimivgglvglrlvftvlsivnrvrqgysplsfqtllpaprgpdrpegieeegger。
在本文中，術語「包含hivgp120蛋白或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白」是指除了包含hivgp120蛋白或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列自身之外，任選地還包含其它不影響hivgp120蛋白或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的免疫原性的胺基酸序列。本領域技術人員根據其所掌握的普通技術知識可以很容易地確定可以包含的胺基酸序列。
在本文中，術語「與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列」是指與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同源的胺基酸序列。
在一個實施方案中，所述hivgp120的序列為seqidno:2，其序列如下所示：
lwvtvyygvpvwkeatttlfcasdakaydtevhnvwathacvptdpnpqevvlenvtehfnmwknnmveqmqediislwdqslkpcvkltplcvtlnckdvnatnttndsegtmergeikncsfnittsirdevqkeyalfykldvvpidnnntsyrliscdtsvitqacpkisfepipihycapagfailkcndktfngkgpcknvstvqcthgirpvvstqlllngslaeeevvirsdnftnnaktiivqlkesveinctrpnnntrksihigpgrafyttgeiigdirqahcnisrakwndtlkqiviklreqfenktivfnhssggdpeivmhsfncggeffycnstqlfnstwnnntegsnntegntitlpcrikqiinmwqevgkamyappirgqircssnitgllltrdgginengteifrpgggdmrdnwrselykykvvkieplgvaptkakrrvvqrekr。
在本文中，術語「包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽」是指除了包含hivgp120v1v2區或與其具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列自身之外，任選地還包含其它不影響hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的免疫原性的胺基酸序列。本領域技術人員根據其所掌握的普通技術知識可以很容易地確定可以包含的胺基酸序列。
在本文中，術語「與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列」是指與所述hivgp120v1v2區至少80％同源例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同源的胺基酸序列。
在一個實施方案中，所述hivgp120v1v2區的序列為seqidno:3，如下所示：
gtvkltplcvtlnckdvnatnttndsegtmergeikncsfnittsirdevqkeyalfykldvvpidnnntsyrliscdtsvitqa。
在一個具體實施方案中，所述hiv包膜蛋白的序列為seqidno:1，所述hivgp120的序列為seqidno:2，並且所述hivgp120v1v2區的序列為seqidno:3。
在一個實施方案中，所述表達包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白的dna為表達包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白的質粒、或者包含hiv包膜蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的病毒狀顆粒。優選地，所述質粒可以是pcdna-jr-fl-env，以下簡稱penv，其來自於nihaidsresearchandreferencereagentprogram，參見wang等人(2010)(8)。
在一個實施方案中，所述包含hivgp120蛋白序列或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白僅包含hivgp120蛋白或與所述hivgp120蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列。所述包含hivgp120蛋白或與所述hiv包膜蛋白具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的蛋白可以通過病毒分離、重組表達或者合成等方式產生，或者通過商購獲得。
在一個實施方案中，所述包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽可以通過真核細胞表達或合成的方式產生，或者通過商購獲得。例如，所述包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽是利用其中克隆有編碼所述包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽的dna的載體在體外表達獲得的。所述載體可以是，例如pcdna3。
在一個實施方案中，所述包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列的多肽可以僅包含hivgp120v1v2區或與所述hivgp120v1v2區具有相同免疫原性且至少80％同源的胺基酸序列作為直接免疫原或者作為組合免疫原的一部分。
在一個實施方案中，所述愛滋病組合疫苗可以進一步包含可藥用佐劑。所述可藥用佐劑包括但不限於弗氏佐劑、氫氧化鋁佐劑、mf59、as02a、qa-21、短小棒狀桿菌、脂多糖、細胞因子、明礬、以及油佐劑或水型佐劑。此外，與組分(a)、(b)和(c)組合使用的可藥用佐劑可以相同也可以不同。
本發明的愛滋病組合疫苗可通過例如注射方式進行接種，所述注射方式例如肌肉注射、皮下注射、皮內注射等。本領域技術人員可以利用本領域公知的技術對其進行配方，以使其適合相應靶點進行特異性抗體的誘導和相應的給藥方式。
在第二方面，本發明提供了一種用於預防愛滋病的試劑盒，其包括：1)本發明第一方面的愛滋病組合疫苗；和2)接種所述愛滋病組合疫苗的說明書。可以在該說明書上註明該愛滋病組合疫苗的各組分的免疫順序、免疫時間間隔以及免疫有效劑量等信息。
在第三方面，本發明提供了根據本發明第一方面的愛滋病組合疫苗在製備用於預防愛滋病的藥物中的用途。
在第四方面，本發明提供了一種對受試者進行免疫接種用於預防愛滋病的方法，包括以下步驟：
i.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(a)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行初次免疫(初免)；
ii.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(b)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行第一次加強免疫；並且
iii.用免疫有效量的本發明第一方面的愛滋病組合疫苗中的(c)組分和任選的可藥用佐劑對所述受試者進行第二次加強免疫。
此處所提及的「免疫有效量」是指在給予受試者之後能夠在該受試者體內產生足以預防某種疾病例如對於本發明是愛滋病的中和抗體的疫苗量。
在一個實施方案中，所述受試者可以是，例如人。
對於上述初次免疫、第一次加強免疫和第二次加強免疫，其可以進行一次或者多次，沒有具體次數限制，只要能達到或者實現所需的技術效果即可。優選地，所述初次免疫可以進行一次、兩次或者三次，優選三次。優選地，所述第一次加強免疫可以進行一次或者兩次，優選地進行兩次。優選地，所述第二次加強免疫可以進行一次或者兩次，優選地進行兩次。
在一個優選的實施方案中，在初次免疫兩周之後進行第一次加強免疫。
在另一個優選實施方案中，在第一次加強免疫兩周之後進行第二次加強免疫。
如上所述，本發明的愛滋病組合疫苗包含聯合使用的三種組分，將這三種組分用於有序免疫機體，誘導識別天然構象v1v2的igg抗體產生增強，與igg競爭的hiv-1env特異性iga水平下降，並使殺傷感染靶細胞的adcc效應顯著地提高，從而獲得比現有的rv144疫苗更優異的愛滋病疫苗效果。本發明的方法及策略可普遍用於愛滋病疫苗的研發以及其它傳染性疾病。
實施例
本發明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應當理解為對本發明的範圍或實施方式的限制。本發明的範圍由所附權利要求書限定，結合本說明書和本領域一般常識，本領域普通技術人員可以清楚地明白權利要求書所限定的範圍。在不偏離本發明的精神和範圍的前提下，本領域技術人員可以對本發明的技術方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發明的範圍內。
實施例1.不同疫苗的v1v2特異性抗體對v1v2多肽的識別
假病毒包裝：用vigofect(vigofectinc.beijing,china)轉染試劑，按照說明，每9.6cm2的培養皿分別轉染5μgjr-fl-env質粒(penv)和5μgpnl4-3質粒。轉染8h後更換新的培養基。3天後收集上清液，3000rpm×10min離心去除細胞碎片，上清液假病毒分裝存儲於-80℃。具體製備方法可參考sun等人(7)。
hiv-1jr-fl假病毒經試劑盒純化後透析到pbs，使用p24檢測試劑盒檢測定量，每次免疫所用假病毒為16μg/只，輔以等體積odncpg佐劑。v1v2多肽按照常規的免疫接種方法，每次免疫所用多肽為50μg/只，首先配製多肽溶液，使用等體積的弗氏佐劑混合乳化。利用jr-fl假病毒(製備方法如上所述)和hiv-1v1v2多肽(購自江蘇海元蛋白生物技術有限公司，其序列為seqidno:3，貨號為pjw4303/gp70v1v2-jrfl)免疫紐西蘭大白兔，每隔兩周進行加強免疫，每次免疫前取血。經過5次免疫後，採集兔血清並用elisa測定抗體滴度。首先利用proteing柱材(gehealthcare,sweden)提取血清中的總igg，然後利用v1v2多肽特異性偶聯柱材(gehealthcare,sweden)按說明書提取v1v2-特異性抗體。利用酶聯免疫吸附法(elisa)測定經純化的特異性抗體對v1v2多肽的結合。elisa的具體操作如下：利用包被液(0.05mnahco3,ph9.6)稀釋v1v2多肽為5μg/ml，並按照50μl/孔在96孔elisa板上4℃包被過夜。利用洗液(0.05％吐溫的pbs溶液)洗兩遍包被板，然後使用2％的脫脂牛奶溶液200μl/孔封閉包被板，37℃孵育2h。將純化的v1v2特異性igg抗體用pbs進行50μl體系的梯度稀釋，然後加入該elisa板，37℃孵育1h後用洗液洗3遍，加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的抗兔igg抗體(dako,glostrup,denmark)(1:2500)，37℃孵育1h後用洗液洗5遍，再用四甲基聯苯胺(tmb)配製的顯色液顯色。
結果如圖3所示，在v1v2-特異性igg抗體的濃度為5μg/ml時，jr-fl假病毒免疫後純化的特異性抗體(jrfl-v1v2ab)與v1v2多肽結合的od450值為1.2，而v1v2多肽免疫後純化的特異性抗體(pep-v1v2ab)與v1v2多肽結合的od450值為1.28。可見，jrfl-v1v2ab和pep-v1v2ab這兩種抗體都能夠很好地結合v1v2多肽。
實施例2.不同的特異性抗體對天然構象hiv-1env的識別
將5mlhiv-1jr-fl活病毒原液加入4×106個cem.nkr.ccr5細胞，輕輕吹打約60次，然後將細胞和病毒混合液在37℃co2培養箱內孵育2h，其中每隔30min輕輕晃動重懸細胞。之後將細胞和病毒混合液加入適當體積含10％fbs的1640培養基，移入培養瓶置於37℃co2培養箱中培養。為了保證細胞代謝需要，及時補液，感染後第四天的細胞即為表達hiv-1jr-flenv的cem.nkr.ccr5靶細胞(以下稱靶細胞)(參見bruel等人(6))。
將10μg/ml的jrfl-v1v2ab和pep-v1v2ab各100μl(含1％bsa)分別與106個cem.nkr.ccr5靶細胞混勻，室溫孵育1h。然後1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸細胞，離心棄上清，重複三次。然後加入100μl546紅色螢光標記的抗兔igg抗體(lifetechnologies，america)(1:500)重懸，室溫孵育半個小時。之後1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸細胞，離心棄上清，重複三次。利用accuric6(bd)檢測被螢光標記的細胞數量。
如圖4所示，jrfl-v1v2ab較強地結合cem.nkr.ccr5靶細胞(14.9％)，而pep-v1v2ab基本不結合cem.nkr.ccr5靶細胞(0.6％)。
實施例3.對不同的免疫組抗體中識別天然構象hiv-1env的v1v2特異性igg含量的比較
將紐西蘭大白兔分六組，每組三隻，進行如下處理：第一組用pbs免疫五次，每兩周免疫一次，每次免疫1ml/只；第二組利用hiv-1gp120單體免疫五次，配製高濃度的蛋白溶液，使用pbs將其稀釋，然後與等體積的弗氏佐劑混合乳化，每兩周免疫一次，每次免疫50μg/只；第三組利用hiv-1v1v2多肽(購自江蘇海元蛋白生物技術有限公司，其序列為seqidno:3，貨號為pjw4303/gp70v1v2-jrfl)免疫五次，使用pbs稀釋多肽溶液，然後與等體積的弗氏佐劑混合乳化，每兩周免疫一次，每次免疫50μg/只；第四組利用表達jr-flenv的質粒(penv)免疫三次，使用pbs稀釋質粒溶液，然後與等體積的弗氏佐劑混合乳化，每三周免疫一次，每次免疫50μg/只，然後利用hiv-1gp120單體蛋白加強免疫四次，每兩周免疫一次，每次免疫50μg/只；第五組利用表達jr-flenv的質粒(penv)免疫三次後，然後利用hiv-1v1v2多肽進行加強和選擇免疫四次，免疫方法同上；第六組先利用表達jr-flenv的質粒(penv)免疫三次後，然後利用hiv-1gp120單體蛋白加強免疫兩次，最後再利用hiv-1v1v2多肽進行加強和選擇免疫兩次，免疫方法同上。
免疫完成後，收集血清並純化igg，然後利用v1v2多肽特異性偶聯柱材按說明書提取v1v2特異性igg抗體。將從前述第一組至第六組獲得的抗體分別以組別標記為pbs組(pbs免疫完成後純化的特異性抗體)、gp120組(gp120單體蛋白免疫完成後純化的特異性抗體)、v1v2組(v1v2多肽免疫後純化的特異性抗體)、penv+gp120組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用gp120單體蛋白增強免疫後純化的特異性抗體)、penv+v1v2組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用v1v2多肽增強選擇免疫後純化的特異性抗體)、penv+gp120+v1v2組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用gp120單體蛋白增強免疫、最後用v1v2多肽增強選擇免疫純化的特異性抗體)。
將10μg/ml的上述六種抗體各100μl(含1％bsa稀釋)分別與106個表達jr-flenv的cem.nkr.ccr5靶細胞混勻室溫孵育1小時。然後1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸，離心棄上清，重複三次。加入100μl546紅色螢光標記的抗兔igg抗體(1:500)重懸，室溫溫育半個小時。然後1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸，離心棄上清，重複三次。利用accuric6(bd)檢測被螢光標記的細胞數量。
結果如圖5所示，gp120組和v1v2組這兩組的抗體都較難結合cem.nkr.ccr5靶細胞表面表達的jr-flenv，分別為21.2％和10.3％。而在使用表達env的質粒初免進行構象誘導、gp120單體蛋白加強後產生的抗體，即penv+gp120組抗體，結合cem.nkr.ccr5靶細胞表面表達的jr-flenv明顯加強，為46.1％。另外，先使用表達env的質粒初免進行構象誘導、然後直接利用v1v2表位多肽進行選擇和加強後產生的抗體，即penv+v1v2組抗體，結合cem.nkr.ccr5靶細胞表面表達的jr-flenv的效果相對於gp120組和v1v2組有所提高，但效果不是很明顯，為32.6％。這可能是因為經構象誘導後，雖然產生了分泌識別env不同表位的抗體的淋巴細胞克隆，但是這些克隆數目很低，以至於直接利用特異性表位v1v2多肽誘導，沒有產生明顯的效果。但在使用表達env的質粒初免進行構象誘導後，利用gp120單體蛋白加強選擇那些能夠分泌識別gp120不同表位的抗體的淋巴細胞克隆，然後利用特異性抗體表位v1v2多肽進一步選擇那些能夠分泌識別gp120上v1v2區表位的抗體的細胞後產生的抗體，即penv+gp120+v1v2組的抗體，對在cem.nkr.ccr5靶細胞表面表達的jr-fl天然構象env的識別明顯提高，達到65.3％。
實施例4.對不同的免疫組抗體中識別天然構象hiv-1env的iga含量的比較
上述紐西蘭大白兔免疫完成後(實施例3)，檢測其抗體滴度並收集血清。使用proteinl/agarose(invivogen，america)柱材，按照說明書純化血清中的igg和iga，再使用proteing柱材(gehealthcare,sweden)將其中的igg去除，即為血清中的iga抗體。pbs組(pbs免疫完成後純化的iga抗體)、gp120組(gp120單體蛋白免疫完成後純化的iga抗體)、v1v2組(v1v2多肽免疫後純化的iga抗體)、penv+gp120組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用gp120單體蛋白增強免疫後純化的iga抗體)、penv+v1v2組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用v1v2多肽增強選擇免疫後純化的iga抗體)、penv+gp120+v1v2組(用表達jr-flenv的質粒初免、再用gp120單體蛋白增強免疫、最後用v1v2多肽增強選擇免疫純化的iga抗體)。
本發明人檢測了這些血清中識別jr-flenv的iga的含量。具體如下：將10μg/ml的上述六種iga抗體100μl(含1％bsa)分別與106個cem.nkr.ccr5靶細胞混勻室溫孵育1小時。然後1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸，離心棄上清，重複三次。之後加入100μl異硫氰酸螢光素(fitc)標記的抗兔iga二抗(abcam，england)(1:500稀釋)重懸細胞，室溫溫育半小時。1000rpm×3min離心收集細胞，用200μlpbs重懸，離心棄上清，重複三次。利用accuric6(bd)檢測螢光標記的靶細胞數量。
結果如圖6所示，直接利用gp120單體蛋白免疫(gp120組)可以誘導出高水平的識別表達在cem.nkr.ccr5靶細胞表面的jr-flenv的iga(19％)。而使用表達env的質粒初免進行構象誘導、再經gp120單體蛋白加強後，penv+gp120組iga抗體中存在結合在cem.nkr.ccr5靶細胞的iga，但相對只用gp120單體蛋白免疫有所降低，為10.3％，這跟臨床數據相一致(3)。進一步地，使用表達env的質粒初免進行構象誘導、再直接利用v1v2表位多肽進行選擇和加強後，penv+v1v2組iga抗體中結合表達在cem.nkr.ccr5靶細胞表面的jr-flenv的iga較低，為2％。這可能是因為經構象誘導後，雖然產生了分泌識別env不同表位的抗體的淋巴細胞克隆，但是這些克隆數目很低，加之v1v2多肽的表位單一，接著利用特異性表位免疫誘導可能會導致識別env的iga的量較低。但是在使用表達env的質粒初免進行構象誘導後，利用gp120單體蛋白加強選擇那些能夠分泌識別gp120不同表位的抗體的淋巴細胞克隆，然後利用特異性抗體表位v1v2多肽進一步選擇加強免疫後，penv+gp120+v1v2組iga抗體中識別表達在cem.nkr.ccr5靶細胞表面env的iga的含量明顯降低，為3.5％。這可能是由於經構象誘導後，雖然能夠產生分泌識別env不同表位的抗體的淋巴細胞克隆，但是這些克隆數目很低；另外，雖然通過gp120單體蛋白選擇能夠識別針對gp120的免疫反應，但繼續利用v1v2多肽選擇和加強，識別其他env和gp120表位的免疫反應不能夠持續，而識別v1v2表位的免疫反應得以增強，因此可能導致識別env的iga的量較低。
實施例5.對不同免疫組抗體對adcc效應的激活作用檢測
上述紐西蘭大白兔經免疫後(實施例3)，檢測其抗體滴度並收集血清。如實施例1所述，首先從血清中純化igg，然後利用v1v2多肽特異性偶聯柱材按說明書純化血清中的特異性抗體：pbs免疫後得到的特異性抗體(pbs組)、經表達jr-flenv的質粒(penv)初免再經gp120單體蛋白增強免疫後得到的特異性抗體(penv+gp120組)、經表達jr-flenv的質粒(penv)初免再經gp120單體蛋白增強免疫後最後經v1v2多肽增強選擇免疫後得到的特異性抗體(penv+gp120+v1v2組)。檢測這些特異性抗體激活adcc效應的能力。adcc被認為是rv144疫苗產生保護效應的關鍵因素，因此我們選用該指標來評估所設計的新型疫苗的效果。
在本發明中，我們選用了promega公司的adccreporterbioassaypropagationmodel(promega,madison,wi)，該模型可以較好地檢測抗體對adcc效應的激活作用。在nature子刊等文章也使用該模型來研究抗體的adcc效應(6,7)。抗體對adcc效應的激活能力可通過檢測螢光值間接地檢測，其對adcc效應的激活能力越強，其所激活的adcc效應越強，其對應的螢光值越高。
對抗體所具有的adcc效應激活能力的檢測方案具體如下：純化出血清中的igg之後，利用偶聯v1v2多肽的nhs柱材純化v1v2特異性抗體，過濾除菌以進行激活adcc效應的試驗。將單核細胞(jurkatcells)細胞鋪板於96孔板(500,000細胞/孔)。靶細胞為感染hiv-1jr-fl活病毒後表達hiv-1env的cem.nkr.ccr5靶細胞。靶細胞(10,000細胞/孔)和不同濃度的抗體(5μg/ml，15μg/ml，30μg/ml)室溫孵育30min之後加入效應細胞。將細胞板300g×5min離心後，置於37℃5％co2培養箱孵育24h。細胞上清(100μl)被轉移至空白板，並加入adccreporterbioassaypropagationmodel(promega)顯色試劑，100μl/孔。infinitem200pro酶標儀檢測其螢光值。
如圖7所示，隨著抗體濃度升高，所誘發的螢光值也越高。直接用pbs免疫後，產生的pbs組特異性igg抗體(濃度為30μg/ml)可以誘發一定的螢光值(rlu：9365)，對adcc效應的激活作用極弱；經構象誘導再經gp120單體蛋白加強後，產生的penv+gp120組特異性igg抗體(濃度為30μg/ml)誘發的螢光值明顯增強(rlu：520131)，對adcc效應的激活作用提高；經構象誘導再經gp120單體蛋白加強，然後利用v1v2多肽進一步選擇加強免疫後，產生的penv+gp120+v1v2組特異性igg抗體(濃度為30μg/ml)誘發的螢光值更進一步提高(rlu：754498)，說明其對adcc效應的激活作用顯著增強。
實施例6.對不同免疫組抗體的adcc效應檢測
上述紐西蘭大白兔經免疫後(實施例3)，檢測其抗體滴度並收集血清。如實施例1所述，首先從血清中純化igg，然後利用v1v2多肽特異性偶聯柱材按說明書純化血清中的特異性抗體：pbs免疫後得到的特異性抗體(pbs組)、經表達jr-flenv的質粒(penv)初免再經gp120單體蛋白增強免疫後得到的特異性抗體(penv+gp120組)、經表達jr-flenv的質粒(penv)初免再經gp120單體蛋白增強免疫後最後經v1v2多肽增強選擇免疫後得到的特異性抗體(penv+gp120+v1v2組)。檢測這些特異性抗體介導的adcc效應。adcc被認為是rv144疫苗產生保護效應的關鍵因素，因此我們選用該指標來評估所設計的新型疫苗的效果。
對抗體所具有的adcc效應的檢測方案具體如下：純化出血清中的igg之後，利用偶聯v1v2多肽的nhs柱材純化v1v2特異性抗體，過濾除菌以進行adcc試驗。將外周血單核細胞(pbmc，全細胞)細胞鋪板於96孔板(500,000細胞/孔)，37℃孵育3h使細胞貼壁，之後用溫育的pbs洗兩遍以去除未貼壁的細胞，以貼壁的細胞作為效應細胞。靶細胞為感染hiv-1jr-fl活病毒後表達hiv-1env的cem.nkr.ccr5靶細胞。將cem.nkr.ccr5靶細胞(10,000細胞/孔)和不同濃度的抗體(1.67μg/ml，5μg/ml，15μg/ml)室溫孵育30min之後加入效應細胞。將細胞板300g×5min離心後，置於37℃5％co2培養箱孵育12h。細胞上清(100μl)被轉移至空白板，並加入cytotox-onetmhomogeneousmembraneintegrityassay(promega)顯色試劑，100μl/孔。裂解細胞乳酸脫氫酶(ldh)產生的乳酸脫氫酶轉換為細胞色素氧化酶底物產生螢光(刃天青)，通過螢光計檢測該螢光(ex560nm/em590nm)。計算特異性殺傷的比例：(實驗組-空白對照)/(陽性對照-空白對照)×100％。用2μl裂解液(cytotox-onehomogeneousmembraneintegrityassaykit)單獨處理靶細胞作為陽性對照，靶細胞和效應細胞作用不加抗體的處理作為陰性對照。如圖8所示，隨著抗體濃度升高，所誘發的螢光值也越高。直接用pbs免疫後，產生的pbs組特異性igg抗體(濃度為15μg/ml)殺傷靶細胞的比例為0.6654％，介導極弱的adcc效應；經構象誘導再經gp120單體蛋白加強後，產生的penv+gp120組特異性igg抗體(濃度為15μg/ml)殺傷靶細胞的比例為14.03％，說明其誘導的adcc效應提高；經構象誘導再經gp120單體蛋白加強後，然後利用v1v2多肽進一步選擇加強免疫，產生的抗體penv+gp120+v1v2組特異性igg抗體(濃度為15μg/ml)殺傷靶細胞的比例為19.73％，說明其誘導的adcc效應顯著增強。
綜合adcc效應的檢測結果，這可能是由於penv免疫的構象誘導再經gp120單體加強免疫後，增加了識別天然構象hiv-1env的v1v2特異性igg含量(圖5)，從而使其激活adcc效應的能力和介導的adcc效應提高；然後利用v1v2多肽進一步選擇加強免疫後，所得penv+gp120+v1v2組特異性igg抗體識別天然構象的igg含量顯著增加，其激活adcc效應的能力和介導的adcc效應也呈顯著增強。該指標表明，本發明人所設計的疫苗可在體內誘導出具有更強adcc效應的抗體。
對於本領域技術人員而言顯而易見的是，本發明並不限於上述示例的細節，在不背離本發明的精神和宗旨的情況下，本領域技術人員能夠想到本文所描述技術方案的變化方案，並且該變化方案也在本發明的保護範圍內。本發明的保護範圍由隨附權利要求所限定。
另外，應當理解，雖然本說明書通過實施方式來對本發明進行了描述，但是並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案。本說明書的這種敘述方案僅為清楚起見，本領域技術人員應當將本說明書當作一個整體，各個實施方式中的技術方案可以適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其它實施方式。
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序列表
復旦大學
hiv疫苗及其製備方法
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