一種即時檢測陰道加德納菌的螢光恆溫檢測試劑盒的製作方法

2023-05-22 09:00:16

本發明涉及一種即時檢測陰道加德納菌的螢光恆溫檢測試劑盒，特別涉及一種不依賴於高能量分子的恆溫擴增技術。
背景技術：
：陰道加德納氏菌（gv）是引起細菌性陰道病（bv）的病原菌。其致病與厭氧菌共同作用有關，除引起bv以外，gv還可致早產、產褥熱、新生兒敗血症、絨毛膜羊膜炎、產後敗血症、膿毒血症、尿路感染、腎周膿腫及膀胱炎等。gv是一種大小為1.5～2.5×0.5μm，多形性，無莢膜，無鞭毛，革蘭氏染色不穩定的細菌。在普通瓊脂培養基上不生長，在血瓊脂培養基、巧克力培養基上生長，但不需x因子、v因子、輔酶因子。兼性厭氧，在足夠co2的環境中，容易生長。生長最適溫度為35～37℃，ph為6.0～6.5。幾十年來，國內外學者研究表明，該菌還可以引起宮頸炎，不潔流產，術後感染，尿道感染等多種疾病，是新認識的一種性傳播疾病的病原菌和條件致病菌。陰道加德納菌是引起細菌性陰道病和尿道炎的重要病原體，在bv的微生物菌群中處於優勢地位，含量明顯高於其他非正常菌群，已被確認為bv的重要病原體。在bv患者與健康人群中，加德納菌的檢出率存在顯著差異，加德納菌抗原檢測可作為bv的一項重要檢測指標，結合臨床表現進行bv診斷。同時臨床研究表明，加德納菌感染還與不孕不育、異常妊娠高度相關，可引起輸卵管妊娠、胎膜早破和新生兒早產等不良妊娠結局，不孕和不良懷孕史患者中30~40%可檢出加德納菌，配偶之間互感率高達90%。檢測陰道加德納菌對於婦產科疾病以及不孕不育的預防和診斷有著較為重大的意義。基於病原體dna直接進行檢測，相比amsel等傳統方法大大提高靈敏度，可以極大提昇陽性檢出率。陰道加德納菌檢測最常用的是生化檢測和免疫螢光檢測技術，但塗片鏡檢測等人工操作多，人為主觀因素佔重要部分，免疫方法檢測多採用間接法，受樣本採集方法影響大，靈敏度不及核酸檢測方法。陰道加德納菌的dna檢測目前在國內還沒有商業推廣用的試劑盒，國外最常見就是bd公司的affirmtm陰道微生物檢測系統。本發明的恆溫擴增技術主要利用重組酶的活性，不進行核酸解鏈和退火即可在恆溫條件下（如37℃）進行核酸的擴增，與生化檢測和免疫螢光檢測技術相比，有著更少人為幹預，不需要人為判斷，能夠直接檢測病原體，靈敏度高等特點。與傳統的pcr技術相比，不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對酶的損耗。同時恆溫擴增技術在體系中不需要加入過量的引物，降低了引物與模板錯配或生成引物二聚體的可能性。另外，恆溫擴增體系有多重工具酶匹配進行有效擴增，擴增效率遠遠高於傳統pcr技術，所用時間更短，最短可以在5min內實現。最後，相對於目前其他恆溫擴增技術平臺相比，本發明所用的重組酶依賴擴增技術平臺是新一代核酸檢測的利器，在檢測的時效性，便捷性和技術參數等多個方面都優於其它恆溫擴增技術平臺，通過試劑的有效匹配，甚至可以在人體腋下進行擴增反應。在該技術平臺上，除了可以開發基於小型可攜式設備用於醫療檢測機構如醫院急診科、婦產科、手術室；社區服務中心和基層醫療機構；檢驗檢疫疾病防控機構的分子診斷產品，還可以開發出適合家庭使用的分子診斷產品，使我國不同區域即便存在經濟條件參差不齊的情況下，也可以展開全國性病毒性疾病、腫瘤和遺傳性疾病的定期和即時普查。這是一個非常巨大的潛在市場，其經濟價值和社會效益不可估量。當前我們已經開發適用於醫療機構和家庭使用的hiv檢測產品和宮頸癌hpv檢測產品。隨著平臺的不斷成熟，可進一步拓展到食品安全、檢驗檢疫、防恐等多個領域。本發明陰道加德納菌即時檢測試劑盒將恆溫擴增技術應用到陰道陰道加德納菌感染的檢測上，縮短了反應時間，降低了體系對反應條件的要求，大大地提高了檢測的效率，也不需要人為主觀判讀結果，同時檢測結果不受混合其他病原體感染的幹擾，因此能更準確的提示陰道加德納菌感染，非常有利於臨床的即時診斷和對症治療。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種即時檢測陰道加德納菌的螢光恆溫檢測方法及其試劑盒，包括反應液，啟動液，反應酶系，陰道加德納菌特異性引物及探針。陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒反應液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質量分數/質量濃度）tris-hcl80mmkcl40mmnacl10mm二硫蘇糖醇5mm甜菜鹼1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml作為上述反應液的進一步改進，tris-hcl的ph為7.0～9.0，優選ph為8.3。陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒啟動液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂5mm~20mm作為上述啟動液的進一步改進，氯化鎂的優選濃度為10mm。陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒反應酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上遊引物200nm下遊引物200nm作為上述反應酶系的進一步改進，重組酶選自e.colirect蛋白。陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒特異性引物及探針序列如下：上遊引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下遊引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）螢光探針1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）作為本發明方法的進一步改進，恆溫擴增的溫度為35～42℃，優選擴增溫度為40℃。本發明的有益效果：本發明的恆溫擴增體系，不依賴於atp、磷酸肌酸等高能能量分子，相對現有的恆溫擴增體系，其組成更為簡單，成本更為低廉，使用更為方便。本發明的恆溫擴增體系適用於複雜模板的擴增，擴增速度快且穩定，可以在15min以內完成擴增反應，擴增的靈敏度和準確性高，不易出現錯配，擴增效果好。本發明的恆溫擴增體系使用螢光實時定量技術，應用範圍更廣，適用於市面上大多數螢光定量擴增儀。本發明檢測陰道加德納菌。對比常規檢測的培養方法和鏡檢方法，時間更短，靈敏度高受培養條件限制少，人為誤操作機率低。附圖說明圖1為最適反應溫度下螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。圖2為非最適反應溫度下螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。圖3為非最適反應溫度下螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。圖4為重複性特異性實驗螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。圖5為實驗螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。圖6為靈敏度實驗螢光擴展曲線結果，圖中螢光曲線的標號對應實施例中反應管的標號。具體實施方式一種即時檢測陰道加德納菌的螢光恆溫檢測方法及其試劑盒，採用了一種不依賴於高能能量分子的恆溫擴增技術。試劑盒成分包括反應液，啟動液，反應酶系，陰道加德納菌特異性引物及探針，各成分的具體組分如下：陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒反應液的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/質量分數/質量濃度）tris-hcl（ph8.3）80mmkcl40mmnacl10mm二硫蘇糖醇5mm甜菜鹼1m海藻糖3.5%peg3.5%bsa0.1mg/ml陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒啟動液的具體組分如下：品名摩爾濃度氯化鎂10mm陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒反應酶系的具體組分如下：品名濃度（摩爾濃度/酶濃度/質量濃度）dntps200um聚合酶bsu100ng/ul單鏈結合蛋白262ng/ul重組酶（e.colirect）360ng/ul上遊引物200nm下遊引物200nm陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒特異性引物及探針序列如下：上遊引物1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg（seqidno：1）下遊引物1cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt（seqidno：2）螢光探針1ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcga(fam-dt)a(dspacer)(bhq-dt)tgcctcggggagctg（seqidno：3）下面結合具體的實驗，進一步說明陰道加德納菌恆溫檢測方法及其試劑盒的優勢，但並非限制本發明。實驗樣本來源：以細菌性陰道炎患者中分離的陰道加德納菌經提取得到的核酸溶液作為樣本；以外購金黃色葡萄球菌、捲曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠菌經提取得到的核酸溶液作為特異性實驗的樣本；以正常人陰道分泌物提取物為陰性對照樣本。實施例1（陰道加德納菌的檢測）：取2個200ul反應管，分別標記為反應管1~2。在反應管1~2中分別加入20ul反應液、5ul反應酶系；在反應管1、2中加入上遊引物1（200nm）、下遊引物1（200nm）、螢光探針1（150nm）。在反應管1中加入陰道加德納菌樣本2ul，反應管2加入陰性對照樣本2ul。各反應管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻後各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇螢光定量pcr儀進行擴增及收集螢光，具體上機條件為：40℃，30s，30個循環，每個循環都搜集螢光。實施例2（非最優擴增溫度條件的檢測）：同實施例1，不同之處在於上機條件改為：35℃，30s，30個循環，每個循環都收集螢光。結果如圖2。實施例3（非最優擴增溫度條件的檢測）：同實施例1，不同處在於上機條件改為：42℃，30s，30個循環，每個循環都收集螢光。結果如圖3。實施例4（特異性實驗）：按照實施例1配製體系8管，分別標記1~8反應管。在1~8反應管的體系中加入上遊引物1（200nm）、下遊引物1（200nm）、螢光探針1（150nm）；在1~8號反應管中按順序分別加入陰道加德納菌、黃色葡萄球菌、捲曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠菌樣本2ul；各反應管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻後各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇螢光定量pcr儀進行擴增及收集螢光，具體上機條件為：40℃，30s，30個循環，每個循環都搜集螢光，結果如圖4。實施例5（陰道加德納菌重複性實驗）：按實施例1配製體系10管，分別標記反應管1~10。在反應管1~10中加入上遊引物1（200nm）、下遊引物1（200nm）、螢光探針1（150nm）。在反應管1~5中均加陰道加德納菌樣本2ul，在反應管6~10中加入陰性對照樣本2ul。各反應管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻後各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇螢光定量pcr儀進行擴增及收集螢光，具體上機條件為：40℃，30s，30個循環，每個循環都搜集螢光，結果如圖5。實施例6（陰道加德納菌靈敏度實驗）按實施例1配製體系8管，分別標記反應管1~8。在反應管1~10中加入上遊引物1（200nm）、下遊引物1（200nm）、螢光探針1（150nm）。在反應管1~7中加入不同濃度的陰道加德納菌樣本2ul，在反應管8中加入陰性對照樣本2ul。各反應管均用滅菌水補足體系到45ul，振蕩混勻後各管再分別加入5ul啟動液（各管的終體積為50ul）。選擇螢光定量pcr儀進行擴增及收集螢光，具體上機條件為：40℃，30s，30個循環，每個循環都搜集螢光，結果如圖6。結論：1.從圖1的結果可以看出，陰道加德納氏菌反應管有「s」型擴增曲線，陰道對照管沒有擴增曲線，說明本發明試劑盒的陰陽性恆溫擴增效果好。2.從圖2、3的結果可以看出，即使不是在最適溫度下進行擴增反應，仍然得到穩定的陽性結果，說明本發明試劑盒有較寬的反應溫度範圍，非最優擴增溫度下的樣本出峰時間和信號值影響不大，試劑的容錯率高、穩定性強，可以適用於溫度不能精確控制的儀器或反應裝置，使試劑盒的使用範圍更為廣泛。3.從圖4的結果可以看出，非本試劑盒檢測範圍內的其他陰道內微生物（黃色葡萄球菌、捲曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株、陰道毛滴蟲、白色念珠）沒有曲線增長，檢測結果陰性，而陽性對照（陰道加德納）擴增結果陽性，說明試劑盒特異性較強。4.從圖5的結果可以看出，陰道加德納菌進行了重複實驗，均得到相應的「s」型擴增曲線，擴增曲線出峰時間相差不超過1min，螢光信號波動範圍小，說明本試劑盒的重複性好。5.從圖6的結果可以看出，陰道加德納菌進行了靈敏度實驗，均得到相應的「s」型擴增曲線，樣本濃度從1×105~1×102cfu/ml，在1×102cfu/ml下均為陽性，即使樣本在極濃度下本試劑盒仍能穩定檢測出陽性，說明本試劑盒的靈敏度高，適應臨床上各種發病期的樣本。。綜上，本發明試劑盒的擴增效果好，特異性強，容錯率高，穩定性強，靈敏度高。sequencelisting廣州和實生物技術有限公司一種即時檢測陰道加德納菌的螢光恆溫檢測試劑盒20163patentinversion3.5132dna人工序列1ataggctttttactggtgtatcactggtaagg32233dna人工序列2cactcttctcaaccccgtcagaggctgaacagt33345dna人工序列3ggaccgatgaaggacgtgacgggctgcgaatgcctcggggagctg45當前第1頁12