精神分裂症動物模型及其藥物篩選平臺的製作方法

2023-05-22 11:32:51

專利名稱：精神分裂症動物模型及其藥物篩選平臺的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物行為學和藥物篩選領域，更具體地，本發明涉及一種精神分裂症動物模型及其藥物篩選平臺，以及利用該平臺篩選治療精神病藥物的方法。
背景技術：
精神病尤其是精神分裂症作為影響腦神經高級思維功能的病變，是近代以來對於影響人的思維及工作能力最具威脅力同時也是最缺乏診斷方法和治療手段的疾病。目前對其發病機理及發病的分子細胞生物學的機制缺乏了解。
精神分裂症動物模型的建立是精神分裂症機理及其藥物研究的首要關鍵。雖然長期以來研究者們也試圖建立一些動物模型用於精神病的研究，但由於精神病的複雜性以及其發病機制不明確，使精神病的機理研究陷入惡性循環有限的精神病相關知識限制了動物模型的建立，沒有好的動物模型又直接影響了精神病發病機制的研究。近來隨著神經內分泌學、神經化學、分子生物學的發展以及臨床調查的日趨細緻，使精神病動物模型的建立有了一定的理論基礎，其方法也開始從單一的幹擾動物生存環境如噪聲刺激、強光刺激、破壞生命節律等向多樣化發展，如藥物誘發、基因剔除等方法。
然而，迄今為止仍沒有令人滿意的精神分裂症動物模型。因此當前迫切需要開發新的精神分裂症動物模型，用以研究精神病尤其是精神分裂症的發病原因，生物學機理以及相關藥物的開發。

發明內容
本發明的目的就是提供一種新的精神分裂症動物模型及其獲得方法。
在本發明另一目的是提供基於該精神分裂症動物模型的藥物篩選平臺。
在本發明的第一方面，提供了一種建立精神分裂症哺乳動物模型的方法，它包括步驟給所述哺乳動物施用精神分裂症有效量的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑，較佳地，所述的拮抗劑是5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽。
在一優選例中，通過腹腔內注射施用5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽。
在本發明的第二方面，提供了一種篩選精神病藥物的方法，包括步驟(a)將候選物與5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽一起施用於哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的精神分裂症特徵行為，其中，精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的下降就表示該候選物是精神病藥物。
在一優選例中，所述的精神分裂症特徵行為包括跨格跑動性和異常重複性。
在另一優選例中，步驟(a)中，還包括將候選物或MK801分別單獨施用於哺乳動物。
在另一優選例中，步驟(a)中，5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽的施用量為0.05-5毫克/千克體重。


圖1 BALB/c小鼠注射不同劑量MK801後的跨格跑動曲線。
圖2 BALB/c注射不同劑量MK801後的異常重複性動作曲線。
圖3 C57BL/6小鼠注射不同劑量MK801後的跨格跑動曲線。
圖4 C57BL/6小鼠注射不同劑量MK801後的異常重複性動作曲線圖5 利司培酮作用於精神分裂症小鼠模型的跨格跑動曲線。圖中，Sal表示鹽水，Ris表示利司培酮，MK表示MK801。
圖6 利司培酮作用於精神分裂症小鼠模型的異常重複性動作曲線。圖中，Sal表示鹽水，Ris表示利司培酮，MK表示MK801。
具體實施例方式
本發明的發明人，經過多年廣泛而深入的研究，發現採用藥物誘發的方法，如通過給小鼠腹腔注射MK801，選擇跨格跑動性(locomotion activity)和異常重複性(stereotypy)兩個指標來測量給藥後小鼠類似精神分裂症症狀的表現程度，從而建立類似精神分裂症的小鼠模型，使精神分裂症的症狀首次得以量化。並在此基礎上建立了藥物篩選平臺。
如本文所用，術語「MK801」是5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸(或其鹽，尤其是藥學上可接受的鹽)，它是N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑，能使小鼠產生類似精神分裂症的症狀。
如本文所用，術語「精神分裂症有效量」指可以引起哺乳動物產生精神分裂症的症狀或行為的劑量。取決於所用的實驗動物，精神分裂症有效量會有所不同。本領域技術人員可以通過實驗確定精神分裂症有效量。對於MK801而言，精神分裂症有效量通常為約0.05-5毫克/千克體重，較佳地約0.1-2.5毫克/千克體重；更佳地約0.15-2毫克/千克體重，最佳地約0.3-1.0毫克/千克體重。
如本文所用，術語「精神分裂症特徵行為」指可以哺乳動物的代表精神分裂症的症狀的行為。代表性的例子包括(但並不限於)跨格跑動性加快，以及異常重複性(stereotypy)的出現和增加，例如小範圍的原地轉圈、大幅度的搖頭、原地打滾等。
在本發明方法中，首先是製備精神分裂症模型動物，即將精神分裂症有效量的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑如MK801施用於哺乳動物。施用方法沒有特別限制，優選的方法包括(但並不限於)腹腔注射，靜脈注射、肌內注射等。
適用於本發明的動物可以是哺乳動物，例如齧齒動物、靈長動物等，較佳的動物是嚙齒類動物，更佳的動物是小鼠、大鼠。
在本發明中，為了更好地進行比較，宜設置了用於比較的對照組動物，包括陽性對照和陰性對照。通常，對照動物的例子包括注射了生理鹽水的動物、注射了MK801的動物、僅注射了候選物質的動物、以及同時注射了MK801和已知藥物的動物(陽性對照)。
可用於本發明的動物行為包括任何可以反映動物精神分裂症症狀的行為。應理解，對於不同的實驗動物，所選用的動物行為可有所不同。例如，對於小鼠而言，代表性的動物行為包括(但並不限於)跨格跑動性(locomotion activity)和異常重複性(stereotypy)等。
本發明人在構建了上述小鼠精神分裂症藥物篩選平臺的基礎上，對已知藥物或未知物質進行了驗證或篩選，得到了令人滿意的結果。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。
實施例材料與方法1.材料試劑MK801，利司培酮(Risperidone)，GNTI[二氫鹽酸鹽(dihydrochloride)11/2H2O，分子式C27H29N5O3·2HCl，分子量544.48]儀器美國SD公司生產的Flex-Field System動物行為學監視系統，攝錄監控系統，進口Hamilton微量注射器。
實驗動物近交系BALB/c、C57BL/6小鼠，雄性，20-22g，SPF級，購自中科院上海實驗動物中心。
2.方法2.1 藥物注射方法小鼠腹腔注射。
2.2 小鼠跨格跑動性和異常重複性指標的測定將給藥後的小鼠放入Flex-Field System，系統自動記錄小鼠在規定時間內的跨格跑動情況；同時啟動攝錄監控系統，錄下小鼠在相應時間內的行為，觀看錄象帶，累計小鼠在一定時間內出現小範圍的原地轉圈、大幅度的搖頭、原地打滾等異常重複性動作的持續時間，並計算出異常重複動作的時間佔所有攝錄時間的百分比。
2.3 小鼠跨格跑動性和異常重複性指標的數據處理跨格跑動性曲線以時間為橫坐標，以每5分鐘小鼠的跨格次數總和為縱坐標。
異常重複性曲線以時間為橫坐標，以每5分鐘的第1分鐘內小鼠做重複性動作的持續時間(s)為縱坐標。
數據統計方法常規T檢驗法。
實施例1類似精神分裂症小鼠模型的建立給BALB/c小鼠注射不同濃度的MK801，對照組為生理鹽水。
跨格跑動性(圖1和表1)和異常重複性(圖2和表2)的結果表明MK801能使BALB/c小鼠產生不同於對照組的異常行為。當MK801為低濃度時(小於0.3mg/kg體重)，隨著濃度的增加，小鼠跨格跑動加快；高濃度時(大於1.0mg/kg體重)，隨著濃度的增加，小鼠跨格跑動變慢。對於異常重複性，隨著MK801濃度的增加，其表現加劇(生理鹽水組的異常重複性為0)。當MK801濃度為0.3-1.0mg/kg體重時，小鼠跨格跑動加快同時異常重複也加劇，表現出較為典型的精神分裂症症狀。
表1 BALB/c小鼠注射MK801後的跨格跑動數據(跨格次數)時間 MK801 劑量(mg/kg體重)鹽水(min) 0.15 0.3 0.6 1.0 2.01529.33 45.60 100.60 112.30 108.30 13.00±10.66 ±12.56 ±17.68** ±17.70** ±21.87** ±3.973029.50 47.60 109.00 144.70 107.30 26.33±10.94 ±17.06 ±21.61** ±26.12** ±21.78** ±9.824537.50 45.40 109.00 139.70 109.80 33.00±11.27 ±23.19 ±18.38** ±25.57** ±20.94*±9.966027.17 46.20 69.80 155.70 90.75 48.00±10.51 ±26.22 ±20.85 ±14.94*** ±32.74 ±10.617522.00 28.20 78.80 143.00 104.80 58.67±14.20 ±17.72 ±13.73*±9.59*** ±22.45*±8.96*9021.50 25.40 38.20 111.70 74.00 67.89±11.66 ±13.49 ±13.61 ±25.75** ±25.00 ±8.66**105 25.80 20.00 24.25 77.00 41.00 88.38±16.26 ±11.70 ±18.25 ±24.58 ±22.37 ±12.00**120 16.00 13.40 22.60 71.83 46.50 111.60±12.00 ±10.08 ±11.38 ±22.69 ±24.62 ±16.89**注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與生理鹽水對照組相比有差異；** p＜0.01與生理鹽水對照組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與生理鹽水對照組相比有極顯著差異。
表2 BALB/c小鼠注射MK801後的異常重複性動作數據(累計時間)時間 MK801劑量(mg/kg體重)(min) 鹽水0.15 0.3 0.6 1.0 2.015 0 00.1450 2.499 2.265 4.313±0.09905±0.9163* ±0.9496* ±1.056**30 0 00.1460 5.086 4.692 3.245±0.07496** ±1.870** ±1.645** ±0.8063**45 0 003.616 4.259 4.424±1.252** ±1.567** ±0.4898***60 0 0.0380 02.197 0.7544 4.457±0.03800 ±1.016*±0.4040* ±0.4265***75 0 000.7767 0.1013 4.368±0.4695±0.07310 ±0.6485***90 0 000.3601 0 2.917±0.2202±0.4287***105 0 000.09056 0 2.362±0.09056 ±0.2759***120 0 000 0 2.117±0.3347***注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與生理鹽水對照組相比有差異；** p＜0.01與生理鹽水對照組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與生理鹽水對照組相比有極顯著差異。
實施例2用不同品系的小鼠(C57BL/6)驗證建立的類似精神分裂症小鼠模型給C57BL/6小鼠注射不同濃度的MK801。
結果如圖3，圖4以及表3和表4所示，同樣能產生類似精神分裂症的症狀。即MK801能使C57BL/6小鼠產生不同於對照組的異常行為。當MK801為低濃度時(小於0.3mg/kg體重)，隨著濃度的增加，小鼠跨格跑動加快；高濃度時(大於1.0mg/kg體重)，隨著濃度的增加，小鼠跨格跑動變慢。對於異常重複性動作，隨著MK801濃度的增加，其表現加劇(生理鹽水組的異常重複性動作為0)。當MK801濃度為0.3-1.0mg/kg體重時，小鼠跨格跑動加快同時異常重複性動作也加劇，表現出較為典型的精神分裂症症狀。
表3 C57BL/6小鼠注射MK801後的跨格跑動數據(跨格次數)時間MK801劑量(mg/kg體重)(min) 鹽水 0.15 0.3 0.61.0 2.015 55.1068.7 91.578.56 46.8912.4±5.549 ±10.84 ±19.17 ±13.6 ±7.37 ±3.98***30 59.9071 136.9 74.56 59.1125.8±3.195 ±13.34 ±23.69*** ±6.564±3.195 ±8.87245 50.8 72.2 160.3 112.2 54.2234±6.936 ±15 ±26.77*** ±10.07*** ±4.627 ±9.01860 32.5 57.3 129.9 151.8 52.6746.7±6.529 ±11.55 ±28.57*±16.54*** ±8.268 ±9.57975 42.1 55.4 103.3 196.8 70.8957.5±6.047 ±7.521 ±26.51*±17.37*** ±11.89* ±7.77490 26.3 32 71.38 189.6 112 70.9±8.912 ±9.597 ±19.76*±18.91*** ±13.79*** ±8.561**10511 23.4 34 171.3 148.7106.0±5.292 ±14.38 ±8.805*±25.55*** ±20.15*** ±17.95***1204.3 419.25 109.3 158.8113.8±2.883 ±3.89 ±3.847 ±35.53** ±17.18*** ±15.35***注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與生理鹽水對照組相比有差異；** p＜0.01與生理鹽水對照組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與生理鹽水對照組相比有極顯著差異。
表4 C57BL/6小鼠注射MK801後的異常重複性動作數據(累計時間)時間 MK801劑量(mg/kg體重)(min)鹽水0.15 0.3 0.6 1.0 2.015 0 0.0870 1.4795.056 2.9503.491±0.05406±0.3544*** ±1.346** ±0.5436*** ±0.5932***30 0 0.1030 1.0592.976 3.5503.837±0.1030 ±0.1888*** ±0.3905*** ±0.8040*** ±0.5817***45 0 00.6833 3.349 3.7033.126±0.2845*±0.4500*** ±1.0460*** ±0.3209***60 0 00.4211 2.725 2.7382.940±0.1571*±0.3359*** ±0.5805*** ±0.4305***75 0 00.1972 1.560 2.9623.542±0.09994±0.2677*** ±0.4636*** ±0.5028***90 0 00.03500 1.123 2.5933.519±0.03500±0.2534*** ±0.2490*** ±0.3711***105 0 00.07778 0.9950 1.5252.642±0.07778±0.1910*** ±0.2236*** ±0.3110***120 0 000.5040 1.0482.338±0.2370* ±0.08966*** ±0.3124***注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與生理鹽水對照組相比有差異；** p＜0.01與生理鹽水對照組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與生理鹽水對照組相比有極顯著差異。
實施例3用治療精神分裂症的藥物驗證類似精神分裂症小鼠模型並初步建立相關藥物篩選平臺在本實施例中，給實驗小鼠注射當前臨床治療精神分裂症的藥物利司培酮等，若干分鐘後注射0.6mg/kg體重的MK801，隨即做跨格跑動性和異常重複性指標的檢測及分析。結果如圖5-6和表5-6所示，利司培酮對模型小鼠的跨格跑動性和異常重複性都有不同程度的抑制作用，而且這種抑制作用與濃度呈正相關，並以0.05-0.25mg/kg體重濃度為最適範圍。
表5 利司培酮作用於精神分裂症小鼠模型後的跨格跑動數據(跨格次數)時間 MK801 利司培酮劑量(mg/kg體重)(min) 0.05 0.1 0.251522.13 27.60 8.500 4.700±7.735 ±14.80±6.030 ±2.821*3023.75 7.100 4.500 1.100±6.974 ±4.119* ±3.121*±0.5260**4552.00 14.20 6.900 0.800±8.394 ±7.633** ±3.680*** ±0.4899***6073.00 19.20 22.80 0.800±4.200 ±8.349*** ±7.777*** ±0.4899***7580.00 34.20 46.90 0***±12.12 ±14.96* ±10.3490105.5 45.60 50.30 0.900±11.12 ±14.55** ±9.358** ±0.348***105 105.9 50.60 51.80 2.100±11.40 ±18.34* ±11.77** ±1.779***120 75.13 75.50 53.90 1.200±10.89 ±17.44±11.00 ±0.5121***注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與MK801模型組相比有差異；** p＜0.01與MK801模型組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與MK801模型組相比有極顯著差異。
表6利司培酮作用於精神分裂症小鼠模型後的異常重複性動作數據(累計時間)時間 MK801利司培酮劑量(mg/kg體重)(min)0.6mg/kg體重0.05 0.1 0.253.165 1.769 1.065 0.562515±0.5347±0.3671* ±0.2687** ±0.3287*3.522 2.473 1.325 0.511330±0.6593±0.5758 ±0.3053** ±0.5113*2.707 1.953 1.795 0.540045±0.6008±0.7616 ±0.3825±0.3119*1.759 0.6715 0.8305 0.345060±0.3423±0.3360* ±0.2524* ±0.2078*注表中數據為平均數±SE*p＜0.05與MK801模型組相比有差異；** p＜0.01與MK801模型組相比有顯著差異；*** p＜0.001 與MK801模型組相比有極顯著差異。
實施例4利用精神分裂症藥物驗證藥物篩選平臺有效性按實施例3所述的方法，對藥物篩選平臺進行驗證，不同點僅在於用當前臨床治療精神分裂症的藥物奧氮平(Olanzapine)替換利司培酮。
實驗結果顯示，藥物奧氮平(Olanzapine)能對MK801誘導產生的症狀起到緩解甚至消除的作用。這進一步證明已建立的小鼠模型與人類的精神分裂症確實存在著相關性。
實施例5利用精神分裂症藥物篩選平臺篩選候選藥物在本實施例中，給實驗小鼠注射藥物GNTI(分子式C27H29N5O3·2HCl)，10分鐘後注射0.6mg/kg體重的MK801，隨即做跨格跑動性和異常重複性指標的檢測及分析。結果顯示，GNTI對模型小鼠的跨格跑動性和異常重複性都有不同程度的抑制作用，而且這種抑制作用與濃度呈正相關，並以3.0-6.0mg/kg體重濃度為最適範圍，這表明GNTI可作為精神分裂症藥物。
討論人類的精神行為是異常複雜的，受許多因素影響，有外因和內因的作用，在人類的基礎上直接研究精神疾病，受到倫理、統計和不可操作性等許多因素的影響。用實驗動物來建立精神疾病動物模型，將現實疾病的複雜性簡化成具體的、可控制的影響因素，對於了解和闡明精神疾病發病機制，量化精神疾病的診斷指標具有重要意義；同時在藥物篩選或新藥鑑定中也將發揮作用，成為新藥開發的重要工具。
在此以前，已有用MK801誘導大鼠能產生類似精神分裂症症狀的報導，但並沒有基於此建立模型動物。作者通過大量實驗不僅證明了該藥物對小鼠有類似的作用，而且還建立了一整套監測跨格跑動性和異常重複性兩個指標的方法以及數據處理手段，使精神分裂症的症狀得以量化，使相關行為學的表現得到更客觀的反應。同時，由此找到了MK801誘發實驗小鼠精神分裂症的最適濃度範圍0.3-1.0mg/kg體重。
實驗小鼠因其基因組成研究基礎好以及與人類遺傳的同源性，特別是中樞神經系統指導的行為與人類的大量神經活動具有高度的可比性，成為這一研究中具有其他實驗材料無可比擬優越性的首選實驗動物。實驗小鼠又存在很多不同品系，它們的來源和遺傳背景都有著不同程度的差異，在行為學上也表現不一。然而，給不同品系的小鼠注射MK801，卻都出現了類似精神分裂症症狀，得到了類似的實驗結果，從而進一步證明了該動物模型的有效性和可重複性。但是由於動物品系之間的差異(對藥物的敏感性不同)，誘導精神分裂症的最適濃度可能會有一定的差異。
通過跨格跑動性和異常重複性這兩個指標的監測，本發明人發現注射MK801之後，小鼠出現了類似於精神分裂症的症狀。由於動物模型僅僅是人類疾病的模擬，因此用當前臨床治療精神分裂症的藥物利司培酮和奧氮平對所建立的模型進行了進一步驗證。實驗結果顯示這些藥物均能對MK801誘導產生的症狀起到緩解甚至消除的作用，從而進一步證明已建立的小鼠模型與人類的精神分裂症確實存在著相關性。
本發明的精神分裂症藥物篩選平臺，可用於篩選新藥以及開發其他治療方法。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種建立精神分裂症哺乳動物模型的方法，其特徵在於，它包括步驟給所述哺乳動物施用精神分裂症有效量的5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述動物是小鼠或大鼠。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過腹腔內注射施用5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽。
4.如權利要求1所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.05-5毫克/千克體重。
5.如權利要求4所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.1-2.5毫克/千克體重。
6.如權利要求5所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.15-2毫克/千克體重。
7.一種篩選精神病藥物的方法，其特徵在於，包括步驟(a)將候選物與5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽一起施用於哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的精神分裂症特徵行為，其中，精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的下降就表示該候選物是精神病藥物。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的精神分裂症特徵行為包括跨格跑動性和異常重複性。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中，還包括將候選物或MK801分別單獨施用於哺乳動物。
10.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中，5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽的施用量為0.05-5毫克/千克體重。
全文摘要
本發明提供了一種精神分裂症動物模型及其藥物篩選平臺，以及利用該平臺篩選治療精神病藥物的方法。本發明的小鼠模型與人類的精神分裂症確實存在相關性。基於該模型動物的精神分裂症藥物篩選平臺，可用於篩選新藥以及開發其他治療方法。
文檔編號A61P43/00GK1470235SQ0213616
公開日2004年1月28日 申請日期2002年7月24日 優先權日2002年7月24日
發明者金玫蕾, 鄒洪, 吳金華, 趙國屏, 於軍, 郭寧, 王凌燕, 謝青蓮 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心