一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法
2023-05-22 21:08:41 3
專利名稱：一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法，特別涉及一種高壓脈衝成球的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體製備方法。
背景技術：
微載體培養動物細胞技術可以在較短時間內得到大量細胞，且細胞傳代只需要添 加新的微載體，基本上可避免細胞在胰酶消化過程受到損傷。因此，微載體培養細胞是非常 方便和有意義的。現階段，無論是實驗室還是工業生產上，所用的細胞培養微載體主要是實心 Cytodex系列載體。這種載體以葡聚糖為基質，表面被覆明膠，價格昂貴，而且其基質葡聚糖 的機械強度、顆粒彈性都不是十分理想。更重要的是這種培養技術還是一種單層培養方式。 而在體內，組織、細胞的生長發育過程是在三維立體的內環境條件下進行的，細胞與細胞基 質以及細胞之間的相互信號傳遞對於調解細胞的增殖、分化有著重要影響，常規的體外單 層培養方法不能提供組織正常生長發育所需的三維環境條件，通常的後果是細胞發生轉化 現象，使得培養的細胞不僅失去了正常的形態，而且失去了其生化與功能性質。殼聚糖作為幾丁質脫乙醯化產物，是一種天然高分子惰性正電荷多糖，主要源於 海產甲殼類，在生物醫學方面尤其作為組織工程植入材料具有廣泛的應用前景。殼聚糖多 孔微載體具有良好的生物相容性和生物降解性；高表面積體積比，一定的機械強度和較理 想的可塑性。目前殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法為乳化法製備，可控性不強，所 形成的微球圓整度不好，粒徑不可控，且不均勻。因此需要開發一種在製備過程中粒徑可控 且分布均勻，所形成的微球圓整度高的的製備方法。
發明內容
本發明的目的在於提出了一種採用高壓脈衝成球製備殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔 微載體的方法。通過控制溶液的濃度、PH和高壓電場能使微球迅速成型，簡單方便，可操控 性強。本發明的技術方案一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，即殼聚糖在高壓 的作用下，滴入多聚磷酸鈉水溶液成球，再經戊二醛交聯處理後冷凍乾燥，形成具有三維結 構的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。其製備過程的工藝流程示意圖見圖1。一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，包括如下步驟(1)、溶液配製配製濃度為2 3%殼聚糖酸溶液和PH為4 10的多聚磷酸鈉水溶液；其中殼聚糖酸溶液與多聚磷酸鈉水溶液反應比按體積計算，即殼聚糖酸溶液多 聚磷酸鈉水溶液為2:1;
所述的殼聚糖脫乙醯度彡90% ；(2)、恆溫振蕩將步驟(1)所得的濃度為2 3%殼聚糖酸溶液在恆溫振蕩器中振蕩，控制水浴溫度在37°C，恆溫時間24h後，並靜置除泡；(3)、高壓脈衝成球步驟⑵經恆溫振蕩及除泡後的濃度為2 3%殼聚糖酸溶液和pH為4 10的 多聚磷酸鈉水溶液用高壓脈衝微膠囊成型裝置製備微球，待微球製備完成後濾出微球；其中所述的高壓脈衝微膠囊製備裝置由鐵架臺5、輸液泵4、注射器2、高壓發生器 3及燒杯1組成，輸液泵4固定在鐵架臺5上，輸液泵4推動裝有殼聚糖酸溶液的注射器2， 在高壓發生器3接出的正負極引線7、6分別與燒杯1中的銅線圈、注射器2的針頭連接，注 射器2中的殼聚糖酸溶液在輸液泵4的推動下成滴滴入燒杯1中的多聚磷酸鈉溶液中，從 而形成微球；其中高壓脈衝微膠囊成型裝置所選用的控制參數為高壓發生器3電壓55 60kV、頻率90Hz、脈衝6，輸液泵4的推進速度50 90mm/h、注射器2的針頭出液孔到燒杯 1中的多聚磷酸鈉溶液的液面距25mm ；(4)、戊二醛交聯在步驟(3)所得的微球中加入濃度為25%的戊二醛進行交聯，控制交聯時間為 90min ；濃度為25%的戊二醛的用量為0. 2ml，按其與微球中的殼聚糖體積比計算，即戊 二醛殼聚糖IL 500L ；(5)、清洗微球將步驟(4)交聯後的微球用蒸餾水反覆清洗至無殘留戊二醛，即得淡黃色微球；(6)、冷凍乾燥將步驟(5)所得的淡黃色微球採用三段冷凍乾燥技術，即預凍溫度控制 為-20 -40°C，時間為120 180mi η、一次乾燥溫度控制為-10 _20°C，時間為500 eOOmin、二次乾燥溫度控制為10 20°C，時間為180 240min，最終得殼聚糖/多聚磷酸 鈉多孔微載體。本發明的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法所得的 殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的孔徑為15 20 μ m,孔隙率近90%，吸水率高達8倍。本發明的有益效果本發明由於採用高壓脈衝技術，得到的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體圓整度 高、粒徑分布均勻。另外，由於在殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備過程中，在保證多 聚磷酸鈉PH的情況下，又結合冷凍乾燥技術使得所得的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的 孔徑為15 20 μ m,孔隙率近90%，吸水率高達8倍。
圖1、殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備過程的工藝流程示意2、高壓脈衝技術的微球製備裝置的示意3、殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的掃描電鏡圖
具體實施例方式下面通過實施例及來進一步解釋本發明，但本發明並不受其限制。實施例1一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，包括如下步驟(1)、溶液配製配製濃度為2. 5%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷酸鈉水溶液；其中殼聚糖酸溶液與多聚磷酸鈉水溶液反應比按體積計算，即殼聚糖酸溶液多聚磷酸鈉水溶液為2:1;所述的殼聚糖脫乙醯度≥90% ；(2)、恆溫振蕩將步驟(1)所得的濃度為2. 5%殼聚糖酸溶液在恆溫振蕩器中振蕩，控制水浴溫 度在37°C，恆溫時間24h後，並靜置除泡；(3)、高壓脈衝成球步驟(2)經恆溫振蕩及除泡後的濃度為2. 5%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷 酸鈉水溶液用高壓脈衝微膠囊成型裝置製備微球，待微球製備完成後濾出微球；其中高壓脈衝微膠囊成型裝置所選用的控制參數為高壓發生器3電壓60kV、頻 率90Hz、脈衝6，輸液泵4的推進速度90mm/h、注射器2的針頭出液孔到燒杯1中的多聚磷 酸鈉溶液的液面距25mm ；(4)、戊二醛交聯在步驟(3)所得的微球中加入濃度為25%的戊二醛進行交聯，控制交聯時間為 90min ；濃度為25%的戊二醛的用量為0. 2ml，按其與微球中的殼聚糖體積比計算，即戊 二醛殼聚糖IL 500L ；(5)、清洗微球將步驟(4)交聯後的微球用蒸餾水反覆清洗至無殘留戊二醛，即得淡黃色微球；(6)、冷凍乾燥將步驟(5)所得的淡黃色微球採用三段冷凍乾燥技術，即預凍溫度控制為-40°C， 時間為120min、一次乾燥溫度控制為-20°C，時間為600min、二次乾燥溫度控制為10°C，時 間為240mi n，最終得殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。所得的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的掃描電鏡圖見圖3，從圖3中可以看出微 載體孔徑分布均勻，孔徑大小為15 20 μ m,孔隙率近90%，吸水率達8倍。實施例2一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，包括如下步驟(1)、溶液配製配製濃度為2%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷酸鈉水溶液；其中殼聚糖酸溶液與多聚磷酸鈉水溶液反應比按體積計算，即殼聚糖酸溶液多聚磷酸鈉水溶液為2:1;所述的殼聚糖脫乙醯度彡90% ；
(2)、恆溫振蕩將步驟(1)所得的濃度為2%殼聚糖酸溶液在恆溫振蕩器中振蕩，控制水浴溫度在37°C，恆溫時間24h後，並靜置除泡；(3)、高壓脈衝成球步驟(2)經恆溫振蕩及除泡後的濃度為2%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷酸 鈉水溶液用高壓脈衝微膠囊成型裝置製備微球，待微球製備完成後濾出微球；其中高壓脈衝微膠囊成型裝置所選用的控制參數為高壓發生器3電壓55kV、頻 率90Hz、脈衝6，輸液泵4的推進速度90mm/h、注射器2的針頭出液孔到燒杯1中的多聚磷 酸鈉溶液的液面距25mm ；(4)、戊二醛交聯在步驟(3)所得的微球中加入濃度為25%的戊二醛進行交聯，控制交聯時間為 90min ；濃度為25%的戊二醛的用量為0. 2ml，按其與微球中的殼聚糖體積比計算，即戊 二醛殼聚糖IL 500L ；(5)、清洗微球將步驟(4)交聯後的微球用蒸餾水反覆清洗至無殘留戊二醛，即得淡黃色微球；(6)、冷凍乾燥將步驟(5)所得的淡黃色微球採用三段冷凍乾燥技術，即預凍溫度控制為-20°C， 時間為ISOmin、一次乾燥溫度控制為-10°C，時間為600min、二次乾燥溫度控制為20°C，時 間為180min，最終得殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。實施例3—種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，包括如下步驟(1)、溶液配製配製濃度為3%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷酸鈉水溶液；其中殼聚糖酸溶液與多聚磷酸鈉水溶液反應比按體積計算，即殼聚糖酸溶液多 聚磷酸鈉水溶液為2:1;所述的殼聚糖脫乙醯度彡90% ；(2)、恆溫振蕩將步驟(1)所得的濃度為3%殼聚糖酸溶液在恆溫振蕩器中振蕩，控制水浴溫度 在37°C，恆溫時間24h後，並靜置除泡；(3)、高壓脈衝成球步驟⑵經恆溫振蕩及除泡後的濃度為3%殼聚糖酸溶液和pH為10的多聚磷酸 鈉水溶液用高壓脈衝微膠囊成型裝置製備微球，待微球製備完成後濾出微球；其中高壓脈衝微膠囊成型裝置所選用的控制參數為高壓發生器3電壓55kV、頻 率50Hz、脈衝6，輸液泵4的推進速度90mm/h、注射器2的針頭出液孔到燒杯1中的多聚磷 酸鈉溶液的液面距25mm ；(4)、戊二醛交聯在步驟(3)所得的微球中加入濃度為25%的戊二醛進行交聯，控制交聯時間為 90min ；
濃度為25%的戊二醛的用量為0. 2ml按其與微球中的殼聚糖體積比計算，即戊二醛殼聚糖IL 500L ；(5)、清洗微球將步驟(4)交聯後的微球用蒸餾水反覆清洗至無殘留戊二醛，即得淡黃色微球；(6)、冷凍乾燥將步驟(5)所得的淡黃色微球採用三段冷凍乾燥技術，即預凍溫度控制為-30°C， 時間為210min、一次乾燥溫度控制為_15°C，時間為600min、二次乾燥溫度控制為15°C，時 間為210min，最終得殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。實施例4實現本發明所用的高壓脈衝微膠囊製備裝置的示意圖如圖2所示。一種高壓脈衝微膠囊製備裝置由鐵架臺5、輸液泵4、注射器2、高壓發生器3及燒 杯1組成，輸液泵4固定在鐵架臺5上，輸液泵4推動裝有殼聚糖酸溶液的注射器2，在高壓 發生器3接出的正負極引線7、6分別與燒杯1中的銅線圈、注射器2的針頭連接，注射器2 中的殼聚糖酸溶液在輸液泵4的推動下成滴滴入燒杯1中的多聚磷酸鈉溶液中，從而形成 微球。以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所做的任 何等效變換，均應屬於本發明的保護範圍。
權利要求
一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)、溶液配製配製濃度為2～3％殼聚糖酸溶液和pH為4～10的多聚磷酸鈉水溶液；其中殼聚糖酸溶液與多聚磷酸鈉水溶液反應比按體積計算，即殼聚糖酸溶液∶多聚磷酸鈉水溶液為2∶1；(2)、恆溫振蕩將步驟(1)所得的濃度為2～3％殼聚糖酸溶液在恆溫振蕩器中振蕩，控制水浴溫度在37℃，恆溫時間24h後，並靜置除泡；(3)、高壓脈衝成球步驟(2)經恆溫振蕩及除泡後的濃度為2～3％殼聚糖酸溶液和pH為4～10的多聚磷酸鈉水溶液用高壓脈衝微膠囊成型裝置製備微球，待微球製備完成後濾出微球；(4)、戊二醛交聯在步驟(3)所得的微球中加入濃度為25％的戊二醛進行交聯，控制交聯時間為90min；濃度為25％的戊二醛的用量為0.2ml，按其與微球中的殼聚糖體積比計算，即戊二醛∶殼聚糖1L∶500L；(5)、清洗微球將步驟(4)交聯後的微球用蒸餾水反覆清洗至無殘留戊二醛，即得淡黃色微球；(6)、冷凍乾燥將步驟(5)所得的淡黃色微球採用三段冷凍乾燥技術，即預凍溫度控制為-20～-40℃，時間為120～180min、一次乾燥溫度控制為-10～-20℃，時間為500～600min、二次乾燥溫度控制為10～20℃，時間為180～240min，最終得殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。
2.如權利要求1所述的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方 法，其特徵在於步驟(1)所述的所述的殼聚糖脫乙醯度> 90%。
3.如權利要求1或2所述的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球制 備方法，其特徵在於步驟(3)中高壓脈衝微膠囊成型裝置所選用的控制參數為高壓發生器 (3)電壓55 60kV、頻率90Hz、脈衝6，輸液泵(4)的推進速度50 90mm/h、注射器(2)的 針頭出液孔到燒杯(1)中的多聚磷酸鈉溶液的液面距25mm。
4.根據權利要求1或2所述的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球制 備方法所得的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體，其特徵在於所得的殼聚糖/多聚磷酸鈉多 孔微載體的孔徑為15 20 μ m,孔隙率近90%。
5.如權利要求1所述的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的高壓脈衝成球製備方 法，其特徵在於步驟(3)所述的高壓脈衝微膠囊製備裝置由鐵架臺(5)、輸液泵(4)、注射器 (2)、高壓發生器(3)及燒杯(1)組成，輸液泵(4)固定在鐵架臺(5)上，輸液泵(4)推動裝 有殼聚糖酸溶液的注射器(2)，在高壓發生器(3)接出的正負極引線(7)、(6)分別與燒杯 (1)中的銅線圈、注射器⑵的針頭連接，注射器⑵中的殼聚糖酸溶液成滴滴入燒杯(1) 中的多聚磷酸鈉溶液，從而形成微球。
全文摘要
本發明公開了一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法。即殼聚糖通過高壓脈衝微膠囊成型裝置，在高壓的作用下，滴入多聚磷酸鈉溶液中形成微球後，再經戊二醛交聯處理後冷凍乾燥，形成具有三維結構的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體。本發明的一種殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備方法所得到的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體圓整度高、粒徑分布均勻。另外，由於在殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的製備過程中，在保證多聚磷酸鈉pH的情況下，又結合冷凍乾燥技術使得所得的殼聚糖/多聚磷酸鈉多孔微載體的孔徑為15～20μm，孔隙率近90％，吸水率高達8倍。
文檔編號C12N5/07GK101844059SQ201010153148
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月22日 優先權日2010年4月22日
發明者劉寶林, 周燕, 彭承宏, 楊曉昀, 楊波, 王欣, 韓寶三 申請人:上海理工大學