分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測試劑盒及使用方法

2023-05-22 20:34:41

專利名稱：分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測試劑盒及使用方法
技術領域：
一種分泌型IgA抗子宮內膜抗體酶免檢測試劑盒及其檢測方法，屬於酶免疫分析技術領域。
背景技術：
不孕不育，分為不孕症和不育症，根據發生的原因可分為器質性、免疫性、醫源性、感染性、生理性不孕，根據是否有過妊娠史可分為原發性不孕和繼發性不孕。還有10% 20%的患者原因不明，在此類患者中，免疫因素佔據30 40%起著不可忽視的作用。因此免疫性不孕的臨床診治越來越被人們重視，它將有助於臨床的診斷與治療，為患者帶來福音。抗子宮內膜抗體(AEAb)主要有IgG、IgM、IgA3種類型，受孕是一個很複雜的生理生殖過程，需要機體生殖器官、內分泌、免疫系統功能正常，協調一致才能完成。正常位置的子宮內膜對機體無抗原性，但女性生殖道感染使其內部環境發生改變、生理屏障受到破壞、女性體內獨特型抗體和抗獨特型抗體的網絡功能紊亂，同時也可使免疫系統受損及損傷子宮內膜，導致機體將自身內膜組織作為抗原刺激機體產生抗子宮內膜抗體，以及異位的子宮內膜也可作為抗原刺激機體免疫系統，產生特異性的抗子宮內膜抗體，可以和子宮內膜中的抗原結合，發生抗原抗體反應，激活補體系統，發生一系列免疫反應，導致營養胚胎的糖原分泌不足，同時，抗子宮內膜抗體往往與子宮內膜異位症並存，可通過抑制排卵、幹擾精子和卵子的運送、阻礙精卵結合、影響早期胚胎的發育、幹擾胚胎著床等環節，最終導致孕卵著床失敗而致患者不孕不育。由於反覆刺激而大量產生達到一定含量時，可與自身靶細胞一子宮內膜組織發生抗原抗體結合反應，並激活補體引起損傷性效應，造成子宮內膜組織細胞生化代謝及生理功能損害，從而引起不孕。抗子宮內膜抗體是一種自身抗體，所針對的抗原為子宮內膜腺上皮細胞中的一種孕激素依賴蛋白，正常位置的子宮內膜對機體無抗原性，但異位的子宮內膜可作為抗原刺激機體免疫系統，產生特異抗子宮內膜抗體不僅和異位子宮內膜發生抗原抗體反應，同時也可與正常位置的子宮膜細胞中的抗原位點相結合，激活補體系統，局部產生免疫病理變化，直接影響子宮內膜腺體的功能，從而導致孕卵著床失敗或(和)不育，最終以不顯性的早期流產而告終。因此抗子宮內膜抗體檢測對臨床診斷與治療不孕不育患者也有重要意義。分泌型IgA抗體(SIgA抗體)可分為血清型和分泌型，血清型多為IgA單體，分泌型多為IgA 二聚體和多聚體，IgA可以單體、二聚體甚至多聚體的形式存在，聚合體不僅結合抗原的能力增強，還可使IgA能結合分泌片，賦於IgA以特殊的活性。局部免疫SIgA是由J鏈連接成的雙聚IgA與SC(分泌片段)結合後形成的複合物，多為二聚體或多聚體而不易檢測。SIgA與IgA在免疫功能上具有不同之處，作用的最大特點是將抗原抗體的反應控制在膜免疫系統的局部，而且是以非炎症的方式限制抗原物質對黏膜表面的侵入。SIgA的重鏈有一個含額外半胱氨酸的C端結構，可與B細胞產生的J鏈相結合，使IgA形成二聚體或多聚體。聚合體不僅結合抗原的能力增強，J鏈對於SIgA的形成有兩個重要的功能，除了使IgA形成雙聚體，在多聚IgA(多聚免疫球蛋白)與SC/pIgR(多聚免疫球蛋白受體)結合的親和性方面也起了重要作用，在排除抗原方面發揮了重要的作用，不僅可以通過聚集潛在入侵的病原體使之易於蠕動和粘液纖毛運動將其清除，而且SC能通過其糖類殘基使SIgA能與沿著表皮表面的黏膜抗體錨著於適當的組織處，破壞抗原的定位，進而清除抗原，SC上的N-糖基為抗原粘附和凝集素的結合提供了很多表位，因此，SIgA抗體在生殖免疫中起到重要作用。N-乙醯-L-半胱氨酸為粘液溶解劑，臨床上用於呼吸病人能增加呼吸道黏膜漿液腺的分泌，從而降低痰液粘度，促進肺表面活性物質的分泌，增加支氣管纖毛運動，使痰液易於咳出。本品的巰基(-SH)結構可使粘蛋白的雙硫(-S-S-)結構斷裂，降低宮腔分泌物粘度，胃蛋白酶具有分解蛋白質的作用，使分泌型抗子宮內膜抗體的多聚體轉變為單體而易於ELISA法檢測。採用聚苯乙烯反應板條固相吸附子宮內膜抗原，在反應過程中若被檢樣本存在抗子宮內膜抗體，則與板條中包被的精子抗原結合，形成抗原-抗體複合物，再與酶標記的二抗形成抗原-抗體-抗抗體複合物，並結合在微孔壁表面，通過底物作用在相應檢測孔中出現藍色，用以特異性的檢測分泌物中的抗子宮內膜抗體。

發明內容
本發明的目的是提供一種樣品前處理簡單，提取後可直接測定，簡便、快速、靈敏、準確的檢測分泌型IgA抗子宮內膜抗體的方法。本發明試劑盒主要由盒體(I)，酶標板(2)中設有反應孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標記的抗子宮內膜二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料託架(10)及酶標板(2)均放在盒體(I)內。本發明的原理是採用N-乙醯-L-半胱氨酸分解宮腔分泌物分泌型IgA抗體，然後採用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型IgA抗子宮內膜抗體。
具體實施例方式一、抗子宮內膜抗體酶標板的製備將子宮內膜抗原用包被液稀釋成1: 200倍，加入100 μ I包被微孔反應板的微孔，加入含1%小牛血清白蛋白磷酸鹽緩衝液350 μ I/每孔，室溫封閉2小時，4°C過夜。甩盡孔內液體後，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。二、酶標記抗體的製備(I)將辣根過氧化物酶5mg溶於0.5ml0.2mol/L pH5.6HAC-NaAc緩衝液中，滴入0.lmol/L NaIO40.25ml,4°C 30 分鐘。(2)加入 2.5% 乙二醇 0.5ml，室溫下 30min。(3)加入抗子宮內膜抗體二抗5 IOmg,用1.0mmol/L pH9.5碳酸鹽緩衝液調整反應液的pH至9.0左右，4°C過夜。(4)加入NaHB40.1ml 混勻，4°C 2 小時後對0.01mol/L ρΗ7.4PBS透析，4°C過夜。力口
入適量中性甘油後小量分裝。三、洗滌緩衝液(PH7.4PBS)配置:0.15M KH2PO40.2 克，Na2HPO4.12Η202.9 克，NaC18.0 克，KC10.2 克，Tween-200.05% 0.5ml 加蒸餾水至 1000ml。
四、前處理液的配置:在IL洗滌液中加入N-乙醯-L-半胱氨酸30mg，30mg胃蛋白酶即為前處理液。


圖1分泌型IgA抗子宮內膜抗體試劑盒示意圖。圖2酶標板示意圖。圖3酶標板條與反應孔示意圖。
具體實施例方式實施例11.樣品處理取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml前處理液中劇烈震蕩，靜至60min，待用。2.檢測方法使用前，將分泌型抗子宮內膜抗體試劑盒平衡至室溫，取IOOiU經N-乙醯-L-半胱氨酸溶解劑處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入到酶標板孔中，震蕩混勻後，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍幹，每孔加入酶標液50 yl，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍幹，加入試劑D、試劑E各50 yl，至37°C水浴箱水浴IOminjP I滴終止液，酶標儀讀取結果。3.結果判定:可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測OD值:在ELISA檢測儀上，於490nm處，以空白對照孔調零後測各孔OD值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
權利要求
1.一種分泌型IgA抗子宮內膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特徵在於由盒體(1)，酶標板(2)中設有反應孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(酶標記的抗子宮內膜二抗)(5)，C試劑瓶(含吐溫-20的磷酸鹽PBS溶液)(6)，D試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(7)，E試劑瓶(H2O2) (8)，F試劑瓶(硫酸溶液)(9)，塑料託架(10)及酶標板(2)均安放在盒體(I)內。
2.根據權利要求1所述的分泌型IgA抗子宮內膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述的塑料託架(10)上制有孔和凹槽。
3.根據權利要求1所述的分泌型抗子宮內膜抗體酶免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述的酶標板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成均放在盒體(I)內。
4.一種分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測方法，其特徵在於取待檢患者宮頸分泌物拭子，加入到2ml含有30g/L N-乙醯-L-半胱氨酸-PBS緩衝液中劇烈震蕩，靜至60min，分別取100 μ I經N-乙醯-L-半胱氨酸-PBS緩衝液液處理的分泌物溶液、陰陽性對照加入抗子宮內膜抗體ELISA反應孔中，震蕩混勻後，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍幹，每孔加入酶標液50 μ I，至37°C水浴箱水浴20min，應用洗滌液洗滌5次，拍幹，加入試劑D、E各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液酶標儀測定A49tol值。
5.按照權利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測方法，其特徵在於所述的A試劑瓶(分泌物前處理液)為含有30mg/L N-乙醯-L-半胱氨酸、30mg/L胃蛋白酶的PBS-Tween 緩衝液。
6.按照權利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測方法，其特徵在於所述的B試劑瓶，為辣根過氧化物酶標記的抗子宮內膜二抗。
7.按照權利要求4所述的分泌型IgA抗子宮內膜抗體檢測方法，其特徵在於所述的酶底物液，D試劑瓶為鄰苯二胺(OPD)試劑，E試劑瓶為H202。
全文摘要
本發明公開了一種分泌型IgA抗子宮內膜抗體酶免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬於酶免疫分析技術領域，本發明配製的試劑盒，通過N-乙醯-L-半胱氨酸使宮頸分泌物中分泌型IgA抗子宮內膜抗體多聚體的雙硫鍵(-S-S-)結構斷裂轉變成可溶性單體，加入到抗子宮內膜抗體檢測酶標板上，採用酶免疫吸附(ELISA)法檢測分泌型IgA抗子宮內膜抗體，經溫浴、洗滌、加酶標二抗，使兩者進行反應、洗滌、加入酶底物顯色。本發明前處理簡單，快速、靈敏、準確、廉價的檢測方法，適用於宮腔分泌物分泌型抗子宮內膜抗體檢測，可以作為不孕不育的重要檢查指標。
文檔編號G01N33/543GK103197057SQ201310102069
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者李立和, 王彥平, 李錚 申請人:天津市寶坻區人民醫院