用於高度專一性檢測過亞硝酸根的試劑的製作方法

2023-05-22 21:58:56

專利名稱：：用於高度專一性檢測過亞硝酸根的試劑的製作方法
技術領域：
：本發明一般涉及過亞辨酸根(peroxynitrite)的檢測領域。更具體地，本發明涉及可用作專一性檢測過亞硝酸根的試劑的化合物。本發明包括探針分子、其途。
背景技術：
：過亞硝酸根(ONOO-)是硝酸根的異構體，為人所知的歷史已有約一個世紀。由於它在生物和醫藥領域具有潛在重要作用，在過去十年裡，人們對它做了廣泛研究，參見Beckman，J.S.，J附./戶/i",0/.CW//Vi"/o/.1996,271，C1424誦1437;Goldstein,S.等，Free及fl力cfl/所o/.在1996，21，965-974;Groves,J.T.，Curr.Opin.Chem.Biol.1999，3,226;Radi，R.等，/^ee腸/.在2001，30，463-488;Ta卩pey，M.M.等，C7m2001，89，224-236;Koppenol，W.H.，2001，6，339-341。過亞硝酸根可通過氧化氮(NO)和超氧根(superoxide)(02—)以1:1的化學計量比率在活體中發生擴散控制的反應(k=0.4-1.9xl010M-V)來形成(Kissner，R.等，CTie附.r。ja'co/.1997，10，1285-1292)，在產生過亞硝酸根的過程中，NO的濃度是關鍵控制因素。當NO的濃度增加時，氧化氮與超氧根發生反應，並能克服超氧化物歧化酶引起的歧化反應。當氧化氮(NO)在受細胞因子刺激的誘導型氧化氮合酶(iNOS)作用下過量產生時，就會發生這種情況。ONOO-的病理活性同它跟生物中普遍存在的C02之間的反應有關，該反應產生高反應活性的自由基C(V和N02'，產率約為35%(Radi，R.等，及fl^/ca/歷o/.在Aferf.2001，30，463-488)。結果，過亞硝酸根能夠使酪氨酸發生硝化(Ischiropoulos，H.，JrcA.5&c/ie附.5fV/;/^s.1998，356，l畫ll，以及BeckmanJ.S.等，JrcA5/ocAe附.5/印Ajs.,1992，298，438-445)，並氧化蛋白質、脂質(Radi，R.等，^rc/i5z>p/^s.，1991,288,481，以及Shi,H.等，所oc/ie附.Com附"rt.，1999,257，651)和生物分子中的鐵及硫蔟(Radi，R.等，J.5,》/.CAew.，1991，266，4244-4250)。與生物活體中的其他氧化劑類似，過亞硝酸根及其質子化形式既產生有益作用，也具有有害作用。巨嗜細胞產生過亞硝酸根，作為對細菌入侵的宿主防禦反應。然而，若干研究表明，過亞硝酸根在許多人類疾病中是導致組織損傷的一個因素，所述疾病例如為缺血再灌注損傷、風溼性關節炎、膿毒性休克、多發性硬化、動脈硬化症、中風、炎症性腸病、癌症以及幾種神經變性疾病(MacMillan-Crow，L.A.等，iVoc.V"rf.Sc/.USA1996，93,11853;Rodenas，J.等，Free及flrfica/.5/。/.在2000，28，374;Cuzzocrea，S.等，戶Afl簡actf/及ev.2001,53，135;Szabo，C.r頻co/.丄e汰2003，140,105;White,C.R.等，iVoc.胸/.」c".5W.USA1994，91，1044;Lipton，S.A.等，胸瞬1993,364,626;Pappolla，M.A.等，/.7Ve訓/T腦亂2000,107,203;以及Beal,M.F.，/Vee及arf/ca/在Merf.2002,32，797-803)。對過亞硝酸根在生物活體中所起關鍵作用作出解釋變得日益重要。雖然過亞硝酸根在鹼性溶液中穩定，但它在生理pH下發生質子化後迅速分解。由於過亞硝酸根在生物體系中的半衰期短(在中性pH值的緩衝劑中為1秒，在細胞中短於100毫秒)，所以不可能將其直接分離出來(Radi，R.，CTie附.r狄/o/.1998，11，720-721;Denicola，A.等，Jrc/^5/oc/ie附.5/o/7/^s.1996，333，49-58)。即便在有確鑿證據證明活體內形成了過亞硝酸根的情況下，還沒有工具可用來明確檢測並定量細胞和組織中的過亞硝酸根。迄今為止，用來檢測和測定過亞硝酸根的可用分析方法可分為三類。第一類是電化學傳感器，其用來估測在氧化應激下細胞中所產生的過亞硝酸根的量(Augusto，O.等，/五"矽附o/.1996，269，346-354;Gatti,R.M.等，F五^yIe汰，1994，348，287-290;Gatti,R.M.等，/^c/t.5/oc/ie附.1998，349，36-46;以及Karoui，H.等，/.CTie附.1996，271，6000-6009)。但此方法需要操作複雜的設備，且無法得到過亞硝酸根的立體圖像。第二類方法依賴氧化探針的使用。例如，可被過亞硝酸根氧化成高螢光分子的DCFH(2，，7，-二氯二氫螢光素)和DHR123(二氫若丹明123),已被用來監測細胞和組織中的過亞硝酸根(Royall，J.A.等，JrcA.說'ocAe附.5Zo/;/ijs.1993,302，348-355;Kooy，N.W.等，及atrf/c.及o/.^ferf.1994，16，149-156;Kooy，N.W.等，/^ee1997，27，245-254;Crow,J.P.，iVi加c1997，1，145-157;Ischiropoulos,H.等，^/^"/^rfs五"矽附o/.1999，301，367-373;以及Miles,A.M.等，J.所o/.CAe附.1996，271，40-47)。然而，過亞硝酸根氧化DCFH和DHR的機理還有大量不清楚之處，這些探針也能被細胞產生的許多其他ROS(活性氧中間體(species))氧化。用來檢測細胞培養液中的過亞硝酸根的魯米諾化學發光體系也存在類似的問題。HPF(羥苯基螢光素)可用來鑑別過亞硝酸根和氧化氮，但(Setsukinai，K.等，丄B/o/.CTie附.2003，278，3170-3175;國際公開WO01/64664(Nagano等)；以及國際公開WO2004040296(Nagano等))。第三類方法利用生物分子的足跡反應。例如，可用免疫化學方法檢測3-硝基酪氨酸，其是在生物體系中蛋白質上的酪氨酸殘基被過亞硝酸根氧化後產生的硝化產物(Kaur，H.等，屍五AS"1994，350，9-12)。近來也有人通過螢光法，用NADH(還原型煙醯胺腺噪呤二核苦酸)來監測緩衝液中過亞硝酸根的濃度。然而，目前還沒有一種化學修飾方法能夠使探針或生物分子獲得完全專一性，使它們能夠直接而明確地顯示細胞中是否產生了過亞硝酸根。這意味著生物體系中存在的其它活性氧中間體和活性氮中間體可能與過亞硝酸根形成竟爭，幹擾了結果。已知有若干方法用於檢測/測定過亞硝酸根，包括電化學方法、化學發光法和足跡法。然而，這些方法需要做煩瑣、耗時的對照實驗，實驗中要聯合使用清除劑和抑制劑，靈敏度低，專一性差。因此，為了便於直接研究生物體系中的過亞硝酸根，開發出靈敏度高、操作簡便的專門用於檢測和測定過亞硝酸根的方法是極為重要的。發明概述本發明涉及可用於確切檢測和測定過亞硝酸根的新穎化合物。具體而言，本發明提供了化合物或其鹽，它們與過亞硝酸根發生專一性反應，而不與其他的活性氧中間體和活性氮中間體反應，所述化合物由以下通式(I)、(II)、(III)表示formulaseeoriginaldocumentpage10(I)formulaseeoriginaldocumentpage11其中Rj(i=l~22)的定義見下面的"發明詳述"。本發明還提供了用於測定過亞硝酸根的試劑，該試劑包含上述任意化合物。本發明還提供了測定樣品中的過亞硝酸根的方法，其包括以下步驟a)使上述任意化合物與樣品接觸；的螢光。本發明還提供了用於檢測過亞硝酸根的高通量篩選螢光法(high-throughputscreeningfluorescentmethod),該方法包括採用測定過亞硝酸根的試劑，其中所述試劑包含上述任意化合物。本發明還提供了用於篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過亞硝酸根的產生，所述方法包括使用上述任意化合物。圖1圖示了用過亞硝酸根或Oxone(2KHS05KHS04'K2S04)氧化酮的反應(la/lb)。圖2顯示了通式(II)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=7~17)的定義見"發明詳述"部分。圖3顯示了通式(III)所示化合物的一般合成方案，其中各Ri(i=18~27)的定義見"發明詳述"部分，圖4~圖7顯示了實施例1的合成方案，圖8顯示了實施例1中所得到的本發明化合物(ss-6)的20jiM溶液的螢光光譜。圖9顯示了15當量ONOO-與5毫升20jiMss-6反應30分鐘後的溶液的螢光光譜。圖IO顯示了20nMss-6的吸收光譜。圖ll顯示了ss-6與濃度為0~300nM的ONOO'反應30分鐘後獲得的螢光光鐠'圖12顯示了焚光強度與ONOO—濃度之間的線性關係。圖13圖18顯示了實施例5的合成方案。圖19顯示了實施例5中所得到的本發明化合物(ss-12)的20jiM溶液的螢光光鐠。圖20顯示了15當量ONOCT與5毫升20fiMss-12反應30分鐘後的溶液的螢光光鐠。圖21顯示了20fiMss-12的吸收光譜。圖22顯示了ss-6與濃度為0-300pM的ONOCT反應30分鐘後獲得的螢光光譜'圖23顯示了螢光強度與ONOO-濃度之間的線性關係。圖24顯示了經原代培養的神經元細胞的螢光顯微鏡檢結果，所述神經元細胞先用20jiM的ss-6和ss-12孵育，然後用10jiM和IOOjiM的SIN-1(3-嗎啉代-斯德酮亞胺《鹽酸)處理。發明詳述定義除非另外明確指出，本申請中所用下列各術語均應具有下面所描述的含義。"烷基"指含有碳和氫的完全飽和的無環單價基團，其可以是支鏈的或直鏈的.烷基的例子有甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和異丙基。"低級烷基"指1~6個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、正戊基和異戊基。"烯基"指含有碳和氫的一價或二價不飽和(優選單不飽和)基團，其可以是環狀的、支鏈的或直鏈的。"低級烯基，，指具有15個碳原子的這樣的基團。"芳基"指取代或未取代的一價芳基，一般含有一個單環(例如苯)或稠合雙環(例如萘)。一般優選單環芳基。該術語包括雜芳基，它是環中含有一個或多個氮原子、氧原子或石危原子的芳環基團，如呋喃基、吡咯基、吡啶基和吲哚。"取代"是指芳基中一個或多個環上氫原子被一個或多個基團取代，所述基團優選選自氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、羥基、羥曱基、硝基、氨基、甲基氨基、二曱基氨基、甲氧基、卣代甲氧基和卣代甲基。"芳烷基，，指進一步被芳基取代的烷基(優選為低級烷基)取代基，其例子有節基和苯乙基。"螢光團"指能被光激發而發射螢光的小分子或大分子的一部分。優選地，在波長範圍為約200~約1000納米，優選為約500~約800納米的光的激發下螢光團能有效地產生螢光。螢光團優選選自吖啶橙、蒽環、別藻藍蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙紅、赤蘚紅、螢光胺、螢光素、FAM(羧基螢光素)、HEX(六氯螢光素)、JOE(6-羧基-4，,5，-二氯-2，，7，-二甲氧基-螢光素)、俄勒岡綠(OregonGreen)、藻藍蛋白、藻紅蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯螢光素)、德克薩斯紅、四曱基若丹明和黃嘌呤。這樣的基團報導於《螢光探針和研究產品手冊》(i^"rf^do/jP/worescew,iVo6e51/fesearc/j9thEdition,MolecularProbes,Eugene,Oregon,Haughland，2003)中。"無機酯"指無機酸與醇的反應產物。無機酯主要得自無機酸與醇的縮合。術語"鹽"指標準酸鹼反應的產物，其中鹼性基團(如氨基)的平衡離子來自有機酸或無機酸。這樣的平衡離子包括氯根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、琥珀酸根、檸檬酸根、乳酸根、馬來酸根、富馬酸根、棕櫚酸根、膽酸根、穀氨酸根、戊二酸根、酒石酸根、硬脂酸根、水楊酸根、曱磺酸根、苯磺酸根、山梨酸根、苦味酸根、苯甲酸根、肉桂酸根等。術語"生理上可接受的鹽"包括含有機陽離子和無機陽離子的羧酸鹽，所述陽離子例如為鹼金屬陽離子和鹼土金屬陽離子(如鋰、鈉、鉀、鎂、鋇和鈣)；銨；或有機陽離子，例如二苄基銨、苄基銨、2-羥乙基銨、二(2-羥乙基)銨、苯基乙基節基銨等。上述術語涵蓋的其它陽離子包括普魯卡因、奎寧和N-曱基葡萄糖胺的質子化形式，以及鹼性胺基酸(如甘氨酸、鳥氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和精氨酸)的質子化形式。本發明的實施方式如上所述，本發明提供了與過亞硝酸根發生專一性反應而不與其它活性氧中間體和活性氮中間體發生反應的化合物。所述化合物具有以下通式(I):formulaseeoriginaldocumentpage14(I)其中R!為OR,，或NR2，R3，，其中R、R和R3，獨立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷醯基、烯醯基、炔醯基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳醯基或聚醚的基團；R2、R3、R4和R5獨立地為氫或選自滷素、烷基、烷氧基、烷基氧基(alkyoxy)、聚醚的基團；R2和R3共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環(heterocyclic)、雜芳基或雜芳環(heteroaromatic);或者Rt和Rs共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R6是吸電子基團，選自CF3、滷素取代的低級烷基(例如CFnH3_n，其中n為l或2)、或(C-O)-O-W,,其中W,是選自烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團；並且螢光團或掩蔽(masked)螢光團可與R,(i=l~5)之一共價鍵合。此外，上面剛剛討論過的化合物進一步具有以下實施方式R2和R3共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R4和Rs共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R是CH3或OCHzOZp其中Zi是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷醯基、烯醯基、炔醯基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳醯基或聚醚的基團；R3，是(C-0)Z2，其中Z2是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、或聚醚的基團；且/或螢光團選自吖啶橙、蒽環、別藻藍蛋白、BODIPY、花青、香豆素、Edans、曙紅、赤蘚紅、螢光胺、螢光素、FAM(羧基螢光素)、HEX(六氯螢光素)、JOE(6-羧基-4，，5，-二氯-2，，7，-二曱氧基螢光素)、俄勒岡綠、藻藍蛋白、藻紅蛋白、若丹明、ROX(羧基-X-若丹明)、TAMRA(羧基四甲基若丹明)、TET(四氯螢光素)、德克薩斯紅、四甲基若丹明和黃嘌呤。本發明還提供了在過亞硝酸根的測定中具有高度專一性和選擇性的化合物。在一種實施方式中，所述化合物具有以下通式(II):(II)其中R7和RK)獨立地為氬或選自卣素、低級烷基、低級烯基、卣代烷基、CN或戰的基團；R8、R9、Ru和Ru獨立地為氫、由素、烷基、卣代烷基、烯基，或是選自酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、烷基氨基、羥基、烷氧基、烷氧基烷基、聚醚、烷基硫代(alkylthio)、氰基、硝基的基團，或者具有(C-O)-Y或(C-O)-X-Y形式，其中X是低級烷基或烯基鏈，Y是氫或者選自烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、氨基、烷基氨基羥基、烷氧基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺醯基、無機酯的基團，或者為57元雜環，其環原子選自碳、氮、氧和硫，其中環原子進一步包括3~6個碳原子以及一般不超過2個的雜原子；Ru是ORt，或NR5，R6，，其中R4，、Rs，和R6，獨立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷醯基、烯醯基、炔醯基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳醯基或聚醚的基團；R!4和Ri5獨立地為氫、卣素、烷基、烷氧基、聚醚；或者R"和R!5共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；Rw是氫、烷基、烷氧基或聚醚；以及R,7是吸電子基團，其選自CF"滷素取代的低級烷基(例如CFJH3-n,其中n為1或2)或(00)-0-W2，其中\￥2是選自烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團。此外，上面討論的通式(II)的化合物進一步具有以下實施方式R9是(C-0)NR,R2"，其中R,和R2"是烷基(例如-(CH2)k-CH3，其中k=024，以及國(CH2)「CH3，其中1=0~24);Rs和R9共同形成環，優選為5、6或7元環，以形成環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R,2是(C-0)NR3"R4"，其中Rs，，和R4"是烷基(例如-(CH2)p-CH3，其中p=0~24,以及-(CH2)q-CH3，其中q一24);R"和Ri2共同形成環，優選為5、6或7元環，以形成環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；和/或Rt，是CH3或OCH2OZ3,其中Z3是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、烷醯基、烯醯基、炔醯基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、芳醯基或聚醚的基團。通式(II)表示的化合物可以鹽的形式存在。生理上可接受的水溶性鹽可適用於本發明的試劑和測定方法。此外，游離態的通式(II)所示化合物或其鹽可以水合物或溶劑合物存在，這些物質中的任何一種均落入本發明的範圍之內。對形成所述溶劑合物的溶劑類型沒有特別限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作為所述溶劑的例子。在另一種實施方式中，在過亞硝酸根的測定中具有高度專一性和選擇性的化合物具有以下通式(III):formulaseeoriginaldocumentpage17(III)其中Rjs和R^獨立地為氫、囟素、烷基或烷氧基；R20是氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、羧酸酯或氨基烷基；R^和R22獨立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、羧基烷基、羧酸根、羧酸酯、氨基曱酸酯、醯胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺醯基或無機酯的基團；R23選自下式所示基團R7，、R8，、R9，和Rn)，獨立地為氫或選自囟素(例如C1、Br或I)、烷基(例如CH3)、烷氧基、烷基氧基或聚醚的基團；Ru，是吸電子基團，其選自CF3、囟素取代的低級烷基(例如CFJH3-n,其中n為1或2)或(C-0)-0-W3，其中W3是選自烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基或芳烷基的基團；以及R24、R25、Rm和1127獨立地為氫或選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氧基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、酮基、醛、羧酸根、羧酸、羧酸酯、氨基甲酸酯、醯胺、氨基、烷基氨基、聚醚、烷基硫代、氰基、硝基、磺醯基、無機酯的基團；Rm和1125共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；Rm和R^共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；或R26和R27共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、其中j一或1;雜芳基或雜芳環。此外，上面討論的具有通式(III)的化合物進一步具有以下實施方式R/和R8，共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R9，和R^，共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R2o是-(CH2U-COOH，其中m-l24;R24和R25共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；R25和R26共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環；和/或R26和Rr/共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環、雜芳基或雜芳環。通式(III)表示的化合物也可以鹽的形式存在。生理上可接受的水溶性鹽可適用於本發明的試劑和測定方法。此外，游離態的通式(III)所示化合物或其鹽可以水合物或溶劑合物存在，這些物質中的任何一種均落入本發明的範圍之內。對形成所述溶劑合物的溶劑類型沒有特別限制。例如，乙腈、乙醇、水或乙腈-水混合物可以作為所述溶劑的例子。已經發現，過亞硝酸根對通式(I)表示的某些特定酮的氧化方式類似於後者與過一硫酸根的反應，所述過一硫酸根的商業來源是Oxone(2KHS05*KHS04'K2S04)(產率為30-55%，轉化率為100%)(圖1)。該反應經由二氧雜環丙烷(dioxirane)中間體進行。二氧雜環丙烷的形成及其隨後在分子內對酚衍生物的氧化，為設計用於專一性檢測細胞內的過亞硝酸根的探針提供了基礎。此外，已經發現，生物體系中存在的酮與其它活性氧中間體或活性氮中間體之間不會發生類似的反應。進一步發現，通過用螢光團取代酮中的一些基團，可以合成針對過亞硝酸根的螢光探針。在一種實施方式中，可通過PET(光誘導電子轉移)機理來控制BODIPY基探針的螢光性質。基於PM3計算方法，設計了受到依賴於PET(光誘導電子轉移)的螢光滅/亮開關機理(fluorescenceoff/onswitchingmechanism)控制的螢光探4十(圖2)。在另一種實施方式中，在用過亞硝酸根氧化之前，將焚光團掩蔽起來，所述探針沒有螢光性。然而，與過亞硝酸根反應後，該焚光團被釋放出來，變得具有強焚光性。例如，螢光素/二氯螢光素的酚羥基處發生的衍生可顯著降低螢光強度。因此，設計了不同的基於螢光素/二氯螢光素的探針。還發現，通式(II)或(III)表示的基本無螢光的化合物在生理條件下與過亞硝酸根高效反應，給出強螢光信號。因此，通過測定氧化態螢光化合物的螢光，可以非常高的專一性和選擇性來測定過亞硝酸根，由所述通式(II)或(III)所示無螢光化合物與過亞硝酸根在活細胞或活組織內反應生成該氧化態螢光化合物。本發明還提供了用於測定過亞硝酸根的試劑，其包含上述任意化合物。本發明還提供了用於測定化學或生物樣品(例如來自動物或植物的細胞和組織，以及微生物)中的過亞硝酸根的方法，其包括如下步驟a)使上述任意化合物與化學或生物樣品接觸；的螢光。本發明還提供了用於檢測過亞硝酸根的高通量篩選螢光法，該方法包括使用以上提到的用於測定過亞硝酸根的試劑。本發明還提供了篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過亞硝酸根的產生，所述方法包括採用上述任意化合物。通用合成程序藉助已知技術以及本文揭示的通用合成程序，有機合成領域的技術人員可以製備本發明的化合物。例如，通式(I)表示的一些化合物一般可利用Yang等概述的程序(義CTiew.，2000，65，4179-4184)來合成。通式(II)的化合物一般可通過以下程序合成(Nagano,T.等，j挑.CTie附.5"oc，2004,126,3357-3367)。一般合成方案如圖2所示。在室溫80。C的溫度下，用催化量的TFA(三氟乙酸)在合適的溶劑(如二氯曱烷或1,2-二氯乙烷)中處理相應的(corresponding)吡咯部分和醛部分。當TLC監控顯示相應的醛消耗完畢時，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醍)，並繼續攪拌15~30分鐘。通過後處理(work-up)和柱純化，可以分離出純的中間體，然後用乙醚合三氟化硼和三乙胺在二氯甲烷中處理所述中間體。在室溫下攪拌溶液14小時。通式(II)表示的本發明化合物可先後通過後處理和純化而分離出來。用於實施合成反應的優選化合物見"實施例"部分。其中，可獨立製備相應的吡咯部分和醛部分，一些官能團可通過保護基予以保護。上述合成方案有時可通過選擇不同的保護基來優化。舉例而言，有關保護基的詳細解釋和合適的保護基的選擇技術可參見名為《有機合成中的保護基》一書(iVCe"/veGVowps/wOrgam'c5^w^rew's，Greene,T.W.，JohnWiley&Sons,Inc.,1999)。通式(III)所示化合物一般可通過以下程序合成(John,E.T.等，丄CAe附.Soc，戶e^/"7>a"s/.,1995,1993;McWatt，M.等，五w./CTie附.2001,2535-2545;Rychnovsky，S.D.等，義爿附.CAe/w.Src.1992，114，671~677)。該一般合成方案如圖3所示。用叔丁醇鉀在適當溶劑(如苯和甲醇的混合物)中的溶液處理相應的螢光素衍生物。當螢光素衍生物固體完全溶解時，真空蒸發溶劑，得到相應的鉀鹽。然後，加入溶於合適溶劑(如吡啶)中的R23I和CuCl，其中Ru如前文所定義。所得混合物在氬氣下回流24小時。冷卻至室溫後，可先後通過後處理和純化而分離出通式(III)所示的本發明化合物。用於實施合成反應的優選化合物見"實施例"部分。其中，可獨立製備相應的螢光素衍生物和R23I，一些官能團可通過保護基予以保護。跟通式(II)所示化合物的一般合成方案一樣，上述合成方案有時可通過選擇不同的保護基來優化。術語"後處理"和"純化"是指有機合成中所用的技術的組合，例如洗滌、過濾、萃取、蒸發、蒸餾、結晶、色譜處理等。中間體也可不經純化而直接用於後續反應。實施例以下實施例1~4是對通式(II)所示化合物的製備和使用方法的詳細描述。該詳述落入上述"通用合成程序"的範圍之內，並起示例作用，而所述"通用合成程序"構成本發明的一部分。這些實施例以及實施例5-9僅用於說明目的，無意限制本發明的範圍。實施例1一ss-6的合成方案1)吡咯-2-甲酸的合成(如圖4所示)將吡咯-2-曱醛(IO.O克，105毫摩爾)溶解在50毫升曱醇中，然後用500毫升蒸餾水稀釋。加入新鮮製備的氧化銀(48.3克，210毫摩爾)和氫氧化鈉(8.5克，212毫摩爾)。然後在室溫下攪拌反應混合物1小時。濾出沉澱，用熱水洗滌。用乙醚(500毫升)萃取合併的濾液和洗滌液，然後在O'C用37%鹽酸酸化。用乙醚(200毫升x4)萃取所得溶液。用硫酸鎂乾燥合併的有機萃取液。減壓蒸發溶劑，得到吡咯-2-甲酸634-97-9(9.9克，產率85%)。2)N，N-二乙基-lH-吡咯-2-甲醯胺(ss-l)的合成(如圖4所示)將吡咯-2-曱酸(IO.O克，90毫摩爾)溶解在250毫升二氯甲烷中，隨後在氬氣氣氛下於O'C加入DCC(N，N，-二環己基碳二亞胺)(20.4克，99毫摩爾)、DMAP(4-二曱基氨基吡啶)(2.2克，18毫摩爾)和二乙胺(10.2毫升，99毫摩爾)。在0。C攪拌反應混合物30分鐘，然後在室溫攪拌8小時。用二氯甲烷稀釋所得溶液，濾去固體。先後用稀鹽酸和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌濾液。用硫酸鈉乾燥有機層，然後減壓蒸發溶劑。用矽膠柱色譜純化殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/2),得到N，N-二乙基-lH-吡咯-2-曱醯胺，其為白色固體(10.5克，產率70%),熔點78.6-79.9。C;'HNMR(300MHz，CDC13):S10.1(br，1H),6.94-6.88(m，1H)，6.57-6.51(m，1H),6.26-6.21(m，1H)，3.95國3.86(m，4H)，1.31-1.24(m，6H);13C醒R(75.5Hz,CDC13):S161.9，120.7，111.3，110.1，109.5，41.9，13.4;IR(CH2C12)3442，2981，2937，1716,1600cm1;LRMS(EI)m/z(%)166(M+;100);HRMS(EI):對於C9H14N20，計算值166.1106,測量值116.1106。3)4-曱氧基肉桂酸甲酯的合成(如圖5所示)將對羥基肉桂酸(IO.O克，61毫摩爾)溶解在200毫升丙酮中，在室溫下加入碳酸鉀(58.7克，213毫摩爾)。15分鐘後，在氬氣下於室溫加入硫酸二曱酯(16.4毫升，213毫摩爾)，然後在氬氣氣氛下加熱回流8小時。濾去固體，在濾液中加入50毫升水。減壓蒸發溶劑，用200毫升乙酸乙酯萃取所得混合物兩次。用硫酸鈉乾燥合併的有機層，然後減壓蒸發溶劑。用矽膠柱色譜純化殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/10)，得到4-甲氧基肉桂酸甲酯832-01-91Ul.7克，產率99%)。4)3-(4-曱氧基苯基)丙酸曱酯的合成(如圖5所示)將4-甲氧基肉桂酸甲酯Ul.7克，61毫摩爾)溶解在300毫升甲醇中。在強氬氣流下緩慢加入鈀(5%位於活化碳粉上；1.1克)。鼓泡通入氫氣，將反應混合物劇烈攪拌2小時。濾出固體，用硫酸鈉乾燥濾液。減壓蒸發溶劑，得到3-(4-甲氧基苯基)丙酸甲酯[15823-04-8(U.7克，99%)。5)3-(3-甲醯基-4-曱氧基苯基)丙酸甲酯(ss-2)的合成(如圖5所示)將3-(4-甲氧基苯基)丙酸曱酯(500毫克，2.56毫摩爾)溶解在30毫升無水二氯曱烷中，隨後在氬氣下於-20。C加入TiClj(2.1毫升，19毫摩爾)和MeOCHCl2(0.81毫升，9.0毫摩爾)。在-20。C下攪拌反應混合物6小時。然後將反應混合物緩慢倒入稀鹽酸溶液中。分離二氯甲烷層，依次用水和鹽水洗滌，然後用硫酸鎂乾燥。減壓蒸發溶劑。然後用矽膠柱色語純化粗殘留物(洗脫劑乙酸乙酯/正己烷=1/10),得到3-(3-曱醯基-4-曱氧基苯基)丙酸曱酯(ss-2),其為無色油狀物(429毫克，產率75%)。^NMR(400MHz，CDC13):510.4(s，1H)，7.65(s，1H)，7.40(dd，J=6.3，1.6Hz，1H)，6.92(d，J=6.4Hz，1H),3.91(s，3H)，3.66(s,3H);2.92(t，J=5.6Hz，2H)，2.61(t，J=5.6Hz，2H);13C醒R(100MHz，CDC13):8189.7，173.0，160.4，135.9，132.7，127.8，124.6，111.8，55.7，51.6，35.4，29.7;IR(CH2C12)3055,2945，1734，1682cm1;LRMS(EI)m/z(%)222(M+;61)，149(100);HRMS(EI):對於C12H1404，計算值222.0892，測量值222.0892。6)N，N-二乙基-5-[2-甲氧基-5-(3-曱氧基-3-氧代丙基)苯基卜10H-二吡咯曱烯(dipyrrin)-1,9-二曱醯胺(ss-3)的合成(如圖6所示)在氬氣氣氛下將化合物ss-1(134毫克，0.81毫摩爾)和ss-2(90毫克，0.41毫摩爾)溶解在30毫升無水1，2-二氯乙烷中。加入一滴TFA(三氟乙酸)，加熱回流所得溶液。當TLC監控(二氧化矽；CH2Cl2)顯示搭消耗完時，加入DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌)(189亳克，0.81毫摩爾)在CH2C12中的溶液，持續攪拌15分鐘。用水洗滌反應混合物，用MgS04乾燥，過濾，蒸發。用矽膠柱色譜純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯曱烷/正己烷=1/1/1)，得到化合物ss-3，其為棕紅色油狀物(289毫克，67%)。^NMR(400MHz，CDC13):37.27(dd，J=8.4，1.9Hz，1H)，7.07(d，J=1.9Hz，1H)，6.92(d，J=8.4Hz，1H)，6.62(d，J=4.3Hz，2H)，6.45(d，J=4.3Hz，2H);3.72-3.60(m，14H),2.93(t，J=7.5Hz,2H),2.64(t,J=7.5Hz，2H)，1.30畫1.23(m，12H);13C畫R(75.5MHz,CDC13):S172.8，162.8，155.7，148.6，141.7，139.4，131.5，131.3，129.8，128.0，125.1,119.1，111.0，55.5，51.3，41.0(br)，35.5，29.6，12.5(br);IR(CH2C12)3483，2938，1639cm1;LRMS(EI)m/z(%)534(M+;21)，463(100);HRMS(EI):對於C3。H38N4Os,計算值534.2842,測量值534.2842。7)N，N-二乙基-8-2-甲氧基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基]-4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮雜-s-引達省(indacene)-3，5-二曱醯胺(ss-4)的合成(如圖7所示)在氬氣氣氛下將化合物ss-3(100毫克，0.19毫摩爾)和三乙胺(0.73毫升，5.2毫摩爾)溶解在20毫升無水二氯甲烷中，室溫下攪拌所得溶液10分鐘。加入BF3-OEt2(0.73毫升，5.8毫摩爾)，繼續攪拌40分鐘。用水和2NNaOH洗滌反應混合物。用CH2Cl2萃取水溶液。用Na2S04乾燥合併的有機萃取液，過濾，蒸發。用矽膠柱色鐠純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯曱烷=1/1),得到化合物ss-4，其為橙色晶體(74毫克，產率70%)。熔點77.0~77.9°C;NMR(400MHz，CDC13):S7.33(dd，J=8.2，2.2Hz，1H)，7.12(d，J=2.2Hz，1H),6.98(d，J=8.5Hz,1H)，6.78(d，J=4.2Hz，2H)，6.44(d，J=4.2Hz，2H)，3.73(s，3H);3.66(s，3H)，3.58(q，J=7.1Hz，4H)，3.29(q，J=7.1Hz，4H)，2.95(t，J=7.5Hz，2H),2.64(t，J=7.5Hz，2H)，1.25(t，J=7.1Hz，6H)，1,10(t，J=7.1Hz，6H);13C應R(100MHz，CDC13):8172.7，162.6，155.4,151.0，145.1，135.2,131.9，131.3，131.2，131.1,121.9，116.6，111.3，55.4，51.4，42.8，38.4，35.4,29.5，13.7,11.9;19FNMR(376.5MHz，CDC13):S-144.2(m，J=30Hz)，-145.2(m,J=30Hz);IR(CH2C12)2980,1734，1640cm1;LRMS(EI)m/z(%)582(M+;21)，551(100);HRMS(EI):對於C30H37BF2N4O5，計算值582,2825，測量值582.2831。8)N，N-二乙基-8-5-羧乙基-2-甲氧基苯基卜4，4-二氟-4-硼-3a，4a，-二氮雜-s國引達省-3，5-二曱醯胺(ss-5)的合成(如圖7所示)將化合物ss-4(100毫克，0.17毫摩爾)溶解在3毫升THF中，然後加入1毫升甲醇和l毫升蒸餾水。加入一水合氫氧化鋰(22毫克，0.52毫摩爾)，持續攪拌6小時，然後加入1毫升鹽水。用10毫升Et20將所得溶液萃取3次。用Na2S04乾燥合併的有機萃取液，過濾，蒸發。所得粗化合物無須進一步純化，直接用於下一步反應。9)N，N-二乙基-8-[2-甲氧基-(4，4，4-三氟-3-氧代丁基)苯基]-4,4-二氟-4-硼-33，48,-二氮雜-8-引達省-3，5-二曱醯胺(ss-6)的合成(如圖7所示)將粗化合物ss-5(560毫克，約1.0毫摩爾)溶解在20毫升無水二氯甲烷中，然後在O'C和氬氣氣氛下加入草醯氯和一滴DMF。然後在室溫下攪拌所得反應混合物30分鐘。蒸發溶劑，在高真空條件下用泵抽掉痕量水和溶劑。然後，將所得固體重新溶解在20亳升無水二氯甲烷中。隨後在-40'C和氬氣氣氛下加入三氟醋酐(0.84毫升，6.0毫摩爾)和無水吡啶(0.65毫升，8.0毫摩爾)。然後在-20。C攪拌反應混合物4小時。加入5毫升水，使反應猝滅，並用20毫升二氯曱烷萃取所得溶液2次。用MgS04乾燥合併的有機萃取物，過濾，蒸發。用矽膠柱色i瞽純化粗化合物(洗脫劑乙酸乙酯/二氯甲烷=1/2)，得到化合物ss-6，其為紅色晶體(210毫克，約34%)。熔點83.6~84.6°C;HNMR(300MHz，CDC13):87.32(d，J=8,6，1H)，7.12(dd，J=6.5,2.2Hz，1H)，6.96(d，J=8.6Hz，1H)，6'73(d，J=4.0Hz，2H),6.43(d，J-4.6Hz，2H)，3.73(s，3H);3.59(q，J=7.2Hz,4H)，3.31(q，J=7.2Hz，4H)，3.06-3.00(m，2H)，2.83-2.77(m，1H)，2.08畫2.03(m，1H)，1.25(t，JN7.1Hz，6H)，1.09(t，J=7.1Hz，6H);13CNMR(100MHz，CDCI3):Sl卯.4(q，Jc_F=35.4Hz),162.9，155.8，151.2，145.0，135,3，131.4，131.2，122.3，116.8,U1.6(q，Jc.產285Hz)，55.6，43.0，38.7，37.8，36.1，29.6，27.2，13.8，12.0;19FNMR(376.5MHz，CDC13):8畫79.3(m，J=llHz)，-144.0(m，J=30Hz)，-145.3(m，J=30Hz);IR(CH2C12)2980，1639，1565cm、LRMS(EI)m/z(%)620(M+;30)，589(100);HRMS(EI):對於C3。H34BF5N404，計算值620.2593，測量值620,2598。實施例21)ss-6的螢光光譜將實施例1中得到的化合物ss-6溶解於CH3CN至濃度為2mM，然後向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20pM。用PerkinElmerLS50螢光光譜儀測定20jiMss-6溶液的激發光譜和螢光光譜。用於測定激發光譜和螢光光譜的狹縫寬度均為5納米，光電倍增管電壓為775伏。在515納米的激發光波長處進行測定。所得結果示於圖8。為了研究ss-6與過亞硝酸根(ONOO-)之間的反應，按照Keith和Powell(Keith,W.G.&Powell,R.E.;氾weft.csrfec糊/7柳'ft'卵o//;emx:j;m'^"sac/rf;J.Chem.Soc.A.，1969，l，90)的方法製備ONOCT溶液。筒而言之，用鹽酸(0.6摩爾/升)酸化亞硝酸鈉(0.6摩爾/升)和過氧化氫(0.7摩爾/升)的混合物，在1~2秒內加入氫氧化鈉(1.5摩爾/升)以中和酸，使溶液呈鹼性。使該溶液通過二氧化錳，以驅除過量的過氧化氫。然後冷凍該溶液，分離出富含過亞硝酸根的暗黃色溶液，用於以下所有試驗。利用1670釐米"(摩爾/升)"的消光係數(302納米處)估測所用儲備溶液中過亞硝酸根的濃度(HughesThechemistryofpernitrites.PartI.Kineticsofdecompositionofpernitriousacid;CAew.5"ocA，1968,2,450-452)。所製備的過亞硝酸鹽溶液的鹼性一般非常強(pH12)。當加入較大量的過亞硝酸鹽時，在實驗當天中和部分過量的鹼。在研究開始和結束時，都要檢查該較低鹼性的過亞硝酸鹽溶液的吸光率，以確定過亞硝酸根在所需孵育時間內沒有分解。還要定期檢查孵育管，以確信加入過亞硝酸鹽後，最終的pH沒有變化。隨後在室溫和劇烈攪拌下，向20nMss-6溶液中緩慢加入不同濃度的15當量ONOO-溶液。體積變化不得超過1%。30分鐘後測定螢光強度的變化，結果示於圖9。反應完成後，利用上述相同條件測定溶液的激發光譜和螢光光譜。與圖8相比，可以看到螢光強度急劇增加。2)ss-6的紫外-可見光吸收光譜將化合物ss-6溶解於二氯甲烷至濃度為20jiM,測定所得20pMss-6溶液的吸收光譜，結果示於圖10。該結果證實了ss-6在515納米附近有最大吸光度。實施例3—比較ss-6與不同活性氧中間體的專一性將實施例1中得到的化合物ss-6溶解於CH3CN至濃度為2mM，然後向所得溶液中加入100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20jiM。將50微升不同的活性氧中間體(10當量)分別加入5毫升相應的ss-6溶液中。測定處理前後螢光強度的變化，在實施例2中所述相同條件下測定螢光強度。上述螢光探針的濃度均為20jiM(lOOmM磷酸鈉緩衝液，pH7.4)。結果示於表1。結果證實了ss-6具有非常高的選擇性。表ltableseeoriginaldocumentpage25(a)SIN-1在緩衝液中能緩慢產生ONOO-。(b)加入Fe(CI04)2(25微升，40mM在緩衝液中)和H202(25微升，80mM),(c)在37。C下加入3-(l，4-二氫-l，4-橋二氧-l-萘基)丙酸(50微升，20mM)。(d)首先加入黃嘌呤氧化酶，待所有XO溶解後，加入黃嘌"H50微升，20mM)。實施例4—ss-6對過亞硝酸根的專一性檢測將實施例1中得到的化合物ss-6溶解於CH3CN至濃度為2mM，然後向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20jiM。然後加入過亞硝酸才艮，使其終濃度達到0、20、60、100、200、240和300nM，30分鐘後測定螢光光語。在與實施例2中相同的條件下測定螢光光譜，結果示於圖11。從圖ll可清楚看到，ss-6極大提高了螢光強度，且螢光強度與ONOO-的濃度具有良好的線性關係(如圖12所示)。以下實施例詳細描述了通式(III)所示化合物的製備和使用方法。該詳述落入上述"通用合成程序"的範圍之內，並起示例作用，而所述"通用合成程序"構成本發明的一部分。這些實施例僅用於說明目的，無意本限制發明的範圍。實施例5—ss-12的合成方案1)ss-7的合成(如圖13所示)向2，7-二氯螢光素(l.O克，2.5毫摩爾)的DMF(二甲基甲醯胺)溶液中加入烯丙基溴(0.47毫升，5.0毫摩爾)。在60。C下攪拌反應混合物3小時後，加水，形成紅色固體。過濾得到化合物ss-7，產率大於99%。NMR(300MHz，CDC13):S8.33(d，J=7.6，1H)，7'78(t，J=7.3Hz，1H)，7'74(t，J=7.3Hz，1H)，7.30(d，J=7.3Hz，1H)，7.03(d，J=2.8Hz，2H)，6.96(s，1H);6.58(s，1H)，6.12國6.00(m，1H)，5.74國5.58(m,1H)，5.56誦5.38(m，2H)，5.21-5.13(m，2H)，4.75(d，J=6.2Hz,2H)，4.53(d，J=5.8Hz,2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.71，164.54，158.16，157.79，152.35，149.52，135.28，133.55,133,12，131.59，131.05，130.97，130.38，130.27，130.13，128.03，127.29，120.43，119.29，119.08，117.71，115.04，105.67，101.14，70.35，66.10;IR(CH2C12)1718，1589cm';LRMS(EI)m/z(%)480(M+;100);HRMS(EI):對於C26H17C1205，計算值480.0453，測量值480.0447。2)ss-8的合成(如圖14所示)將化合物ss-7(1.2克，2.5毫摩爾)溶解在丙酮(50毫升)與NaOH(1.25M,50毫升)的混合物中，將所得溶液加熱至回流，並保持1小時。冷卻到室溫後，在反應混合物中加入1N鹽酸，以將溶液中和到pH2。加入乙酸乙酯進行萃取。有機層用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，真空蒸發。用矽膠柱色語純化殘留物，得到化合物ss-8(760毫克，產率68%)。，HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.07(d，J=7.1Hz，1H)，7.72(t,J=7.3Hz,IH)，7.68(t，J=7.3Hz，1H),7.16(d，J=7.4Hz，IH)，6.91(s，IH);6.80(s,IH)，6.73(s，1H),6.71(s，IH)，6.10畫6.03(m，IH)，5.48(d，J=17.2Hz,IH)，5.36(d，J=10.5Hz，IH)，4.12(d，J=7.2Hz，2H);13C醒R(lOOMHz，CDC13):S168.27，155.21，155.04，151.51，150.30，149.98，135.96，132.59,130.59，128.27，128.09，125.83，125.18，123.95，118.10，117.26，116.44，111.48，110.34,103.62，102.39，81.23，69.53;IR(CH2CI2)2955，1771，1597cm1;LRMS(EI)m/z(%)440(M+;3)，361(100);HRMS(EI):對於C23H14C1205，計算值440.0218,測量值440.0222'3)ss-9的合成(如圖15所示)在室溫下，在叔丁醇鉀(230毫克，2.0毫摩爾)在苯(8毫升)和甲醇(3毫升)的混合物中形成的溶液中加入ss-8。當固體完全溶解後，真空蒸發溶劑，得到相應的鉀鹽。然後，加入CuCl(204毫克，1.9毫摩爾)和溶於吡啶(9毫升)中的化合物ss-8(980毫克，3.4毫摩爾)。所得混合物在氬氣下回流24小時。冷卻到室溫後，反應混合物用HC1水溶液酸化。用乙酸乙酯萃取所得混合物。有機層用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，真空蒸發。用矽膠柱色譜純化殘留物，得到化合物ss-9(200毫克，產率20%)。力NMR(300MHz，CDCI3):88.07(d，J=6.6Hz，1H),7.74(t,J=7.3Hz，1H)，7'71(t，J=7.3Hz，1H)，7.24(d，J=8.3Hz，2H),7'18(d，J=7.0Hz，1H)，7.00(d，J=8.4Hz,2H);6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H),6.08-6.01(m，1H)，5.46(d,J=17.2Hz，1H),5.34(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d，J=5.0Hz，2H),3.70(s，3H)，2.98(t，J=7.5Hz，2H)，2.66(t，J=7.5Hz,2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5173.16，168.74，155.62，155.33，153.67，151.91，150.43，150.37，137.21，135.51,131.65，130.38，129.94，129.36，128.74，126.34，125.50，123.81，119.78，118.83，118.47，115.29，114.10，111.32，106.29，101.52，81.53，69.83，51.68，35.64，30.19;IR(CH2C12)3055，2928，1765，1589，1475，1412cm";LRMS(EI)m/z(%)602(M+;100);HRMS(EI):對於C33H24C1207,計算值602.0899，測量值602.0890。4)ss-10的合成(如圖16所示)在室溫下，向化合物ss-9(874毫克，1.44毫摩爾)在THF(IO毫升)和水(3毫升)中的溶液裡加入LiOH'H20(300毫克，7.2毫摩爾)。在40。C下攪拌3小時後，用1N鹽酸酸化反應混合物。用NaCI使所得溶液達到飽和，並用乙酸乙酯進行萃取。用無水硫酸鈉乾燥合併的有機層，濃縮得到ss-10(500毫克，產率60%)。'HNMR(400MHz，CDC13):S8.30(br，1H)，8.08(d，J=7.3Hz，1H)，7.74(t，J=7.3Hz,1H)，7.70(t,J=7.3Hz，1H)，7.26(d，J=8.3Hz,2H)，7.18(d，J=7.0Hz，1H);7.01(d，J=8.4Hz，2H),6.82(s，1H)，6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s,1H),6.06-6.00(m:1H)，5.46(d，J=17.2Hz，1H),5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.61(d，J=5.0Hz，2H)，2.99(t，J=7.5Hz，2H)，2.72(t，J=7.5Hz，2H);13C醒R(75MHz，CDC13):8177.77，168.81，155.67，155.30，154.83,151.93，150.46，150.42，136.87，135.55，131.67，130.42，129.97，129.41，128.78，126.38，125.55，123.83，119.80，118.89，118.50，115.37，114.21，111.35，106.42,101.56，81.59，69.87，35.76，29.93;IR(CH2C12)3421，3055，1765，1624,1416cm1;FABm/z589(JVT);HRMS(EI):對於C32H22C1207，計算值589.0821，測量值589.0820。5)ss-11的合成(如圖17所示)在化合物ss-10(490毫克，0.83毫摩爾)的CH2C12(15毫升)溶液中加入將草醯氯(0,22毫升，2.5毫摩爾)，在室溫下攪拌所得溶液3小時。減壓蒸發掉溶劑和過量的草醯氯。將所得醯基氯溶解在CH2C12(20毫升)中，然後在氮氣下於-40"加入三氟醋酐(0.7毫升，5毫摩爾)和吡啶(0.54毫升，7毫摩爾)'使所得混合物緩慢升溫到-20。C，在該溫度下持續攪拌4小時。緩慢加水，使反應猝滅。用鹽水洗滌反應混合物。用無水硫酸鈉乾燥有機層並濃縮。用快速柱色譜純化殘留物，得到ss-l1，其為黃色固體(240毫克，產率45%)。熔點85.0~86.1°C;NMR(400MHz，CDC13):S8.08(d，J=7.4Hz，1H)，7.76-7.68(m，2H)，7.26(d，J=8.5Hz，2H)，7.18(d，J=7.4Hz，1H)，7.02(d，J=8.4Hz,2H),6.83(s，1H);6.74(s，1H)，6.73(s，1H)，6.71(s，1H)，6.07-6.00(m，1H),5.46(d，J=17.2Hz，1H)，5.33(d，J=10.5Hz，1H)，4.62(d,J=4.4Hz，2H),3.10-3.07(m，2H)，3.04畫3.00(m,2H);13CNMR(101MHz，CDC13):S190.5(q，Jc.F=35.3Hz)，168.72，155.67，155.09，154.12，151.91，150.43，150.41，135.79,135.53，131.66，130.41，129.97，129.44，128.76，126.36，125.52，123.81，120.07，119.82，118.92，118.47，H5.70(q，Jc.F=292Hz)，114.41，111.34，106.60，101.55，81.49，69.86，37.99，27.61;19F(376MHz，CDC13)S-79.18;IR(CH2C12)3055，1765，1597，1475，1402cm1;LRMS(EI)m/z(%)640(M4)，561(100);HRMS(EI):對於C33H21a2F306,計算值640.0665，測量值640.0667。6)ss-12的合成(如圖18所示)向化合物ss-11(260毫克，0.4毫摩爾)在混合溶劑CH3CN(4毫升)、CC14(4毫升)和水(6毫升)中形成的溶液裡依次加入催化劑RuCl3'3H20(5毫克)和NaI04(865毫克，4,0毫摩爾)在室溫下劇烈攪拌所得混合物1小時，然後加入CH2Clz。分離有機層，用無水硫酸鈉乾燥，濃縮後得到殘留物。用快速柱色語純化殘留物，得到化合物ss-12(214毫克，產率80%)。熔點105.0~106.0°C;NMR(400MHz，CDC13):58.09(d，J=7.2Hz，IH)，7.76-7.71(m，2H)，7.24(d，J=8.5Hz，2H),7.18(d，J=7.4Hz，IH)，7.01(d，J=8.5Hz，2H)，6.83(s，1H);6.78(s，IH)，6'71(s，1H)，6'67(s，IH)，4.76(d,J=2.5Hz，2H)，3.08(t，J=6.2Hz，2H)，3.02(t，J=6.2Hz，2H);13CNMR(75MHz，CDC13):5190.48(q，Jc.F=35.3Hz)，172.44，168.82，155.23，154.72，153.97，151.77，150.32，150.24,135.88，135.64,130.51，129.99，129.40，129.24，126.21，125.59，123.82，120.16，119.87，118.94，U5.46(q，Jc—F=292.2Hz)，114.13，112.71，106.44，101.67，81.34，65.49，37.96，27.57;IR(CH2C12)3420，3055，1765，1610，1408cm1;LRMS(EI)m/z(%)614(M+畫COOH;19)，579(100);HRMS(EI):對於C31H18CI2F306，計算值613.0433,測量值613.0469。實施例61)ss-12的螢光光譜將實施例5中得到的化合物ss-12溶解於CH3CN至濃度為2mM，然後向所得溶液中加入lOOmM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20fiM。用PerkinElmerLS50螢光光鐠儀測定20fiMss-12溶液的激發光鐠和螢光光譜。用於測定激發光譜和螢光光譜的狹縫寬度均為2.5納米，光電倍增管電壓為775伏。在490納米的激發光波長處進行測定。所得結果示於圖19。隨後在室溫和劇烈攪拌下，向20jiMss-12溶液中緩慢加入不同濃度的15當量ONOO-溶液。體積變化不得超過1%。30分鐘後測定螢光強度的變化，結果示於圖20。反應完成後，利用上述相同條件測定溶液的激發光譜和螢光光譜。與圖19相比，可以看到螢光強度急劇增加。2)ss-12的紫外-可見光吸收光譜將化合物ss-12溶解於二氯甲烷至濃度為20pM，測定所得的20jiMss-12溶液的吸收光譜，結果示於圖21。結果表明，ss-12在460納米和490納米附近有兩個吸收峰。實施例7—比較ss-12與不同活性氧中間體的專一性將實施例5中得到的化合物ss-12溶解於CH3CN至濃度為2mM,然後向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20fiM。將50微升不同的活性氧中間體(10當量)分別加入到5毫升相應的ss-12溶液中。測定處理前後螢光強度的變化，在實施例2中所述相同條件下測定螢光強度。上述螢光探針的濃度均為20jiM(100mM磷酸鈉緩沖液，pH7.4)。結果示於表2。結果證實了ss-12具有非常高的選擇性。表2tableseeoriginaldocumentpage30(a)請參見實施例3表1中ROS的產生過程。(b)通過SNP(二水合亞硝基鐵(III)氰化鈉)產生NO(FeelischM.，義1993，14,123-132)。實施例8—ss-12對過亞硝酸根的專一性檢測將實施例5中得到的化合物ss-12溶解於CH3CN至濃度為2mM，然後向該溶液中加入100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)使其溶解，終濃度為20pM。然後加入過亞硝酸根，使其終濃度達到0、20、60、100、200、240和300fiM，30分鐘後測定螢光光譜。在與實施例6中相同的條件下測定螢光光譜，結果示於圖22。從圖22可清楚看到，ss-12極大提高了螢光強度，且螢光強度與ONOCT的濃度具有良好的線性關係(如圖23所示)。實施例9一細胞試驗在該研究的整個過程中，由胚齡為15天的Sprague-Dawley大鼠製備原代培養的皮質神經元。簡而言之，在聚-L-賴氨酸包被的6孔板上(BDBiosciences,SanDiego，CA，USA)上用Neurobasal/2%B27(Gibco-BRL，GrandIsland,NY)平板培養(plated)解離的細胞懸浮體，密度為2xlS個細胞/孔，所述Neurobasal/2%B27中有含穀氨酸(0.5mM，SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO)、青黴素(100U/mL)和鏈黴素(100jig/mL).在5%C02-95%空氣和37。C條件下，將細胞保持在增溼孵育器中。在第10天，將培養的皮質細胞用於實驗，用濃度為20fiM的ss-6和ss-12在孵育所述經過原代培養的神經元細胞15分鐘，然後用磷酸鈉緩衝液(100mM，pH7.4)洗滌3次。隨後，分別用10和IOOjiMSIN-1(3-嗎啉代_斯德酮亞胺*鹽酸)處理細胞15分鐘。用磷酸鈉緩衝液(100mM,pH7.4)洗滌後，在螢光顯微鏡下觀察細胞。結果表明，探針在測定分子內ONOO-的產生方面給出了令人滿意的結果(如圖24所示)。參考文獻1.PCT國際公開WO01/64664，公開於2001年9月7日(Nagano等)。2.PCT國際公開WO2004040296，公開於2004年5月31日(Nagano等)。3.Augusto，O.;Radi，R,Gatti，R.M.;Vasquez國Vivar，J.MethodsEnzymol.1996，269，346-354.4.Beal，M.F.，FreeRadicalBiol.&Med.2002,32，392.5.Beckman，J.S.，Am.J.Physiol.CellPhysiol.1996，271，C1424.6.BeckmanJ.S.，IschiropoulosH，ZhuL，vanderWoerdM，SmithC,ChenJ,HarrisonJ，MartinJ,C.andTsaiM.，ArchBiochem.Biophys.,1992，298，438-445.7.Crow,J.P.，NitricOxide.1997，1,145-157.8.Cuzzocrea，S.，Riley,D.P.，Caputi，A.P.，Salvemini，D.，PharmacolRev.2001，53，1359.FeelischM.，EurHeartJ.1993，14，123-132.10.Gatti，R.M.，Alvarez,B.,Vasquez-Vivar，J.，Radi，R.，Augusto,O.，Arch.Biochem.Biophys.1998，349，36-46.11.Gatti，R.M.，Radi，R.，Augusto,O.，FEBSLett.,1994,348，287-290.12.Groves,J.T.，Curr.Opin.Chem,Biol.1999，3,226.13.Gryglewski，R.，Nature1986，320，454.14.Hughes,M.N.，Nicklin,H.G，，J.Chem.Soc.A.，1968，2，450-452.15.Ischiropoulos,H.，Arch.Biochem.Biophys.1998，356，1-11.16.Ischiropoulos,H.，Gow，A.，Thom，S.R.，Kooy，N,W,，Royall，J.A,，Ceow，J.P.,MethodsEnzymol.1999，301，367-373.17.John,E.T.Corrie，DavidR.Trentham，J.Chem.Soc.，PerkinTransI.，1995，1993.18.Kaur，H.，Halliwell，B.，FEBSLett.1994，350，9-12,19.Keith,W.G.，Powell,R.E.，J.Chem.Soc，A.，1969，1，90.20.Kooy，N.W.，Royall,J.A.，Ischiropoulos,H.，Beckman,J.S.，FreeRadic.Biol.Med.1994，16，149-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醯基或聚醚的基團。34.權利要求33所述的化合物，其中Z3是CH3。35.權利要求1所述的化合物，其中Ru，是NRs，R6，。36.權利要求35所述的化合物，其中Rs，是氫。37.權利要求36所述的化合物，其中IV是(C-0)Z4。38.權利要求37所述的化合物，其中Z4是選自烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、環烷基、環烯基、環炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、聚醚的基團。39.權利要求l所述的化合物，其中R"和Rw共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環。40.權利要求1所述的化合物，其中Rn是卣素取代的低級烷基。41.權利要求40所述的化合物，其中Rn是CFJH:^。42.權利要求41所述的化合物，其中"n"為1或2。43.權利要求1所述的化合物，其中\￥2是CH3。44.權利要求1所述的化合物，其中\￥2是叔丁基。45.權利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。46.權利要求1所述的化合物，其中議18是CH3。47.權利要求l所述的化合物，其中R^是C1、Br或I。48.權利要求1所述的化合物，其中Rw是CH3。49.權利要求1所述的化合物，其中R2Q是-(CH2)m-COOH。50.權利要求49所述的化合物，其中m-l24。51.權利要求l所述的化合物，其中R/和Rs，共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環或雜芳基或雜芳環。52.權利要求l所述的化合物，其中119，和R^，共同形成5、6或7元環，其選自芳基、雜環、雜芳基或雜芳環。53.權利要求l所述的化合物，其中Ru，是自素取代的低級烷基。54.權利要求40所述的化合物，其中Ru，是CFnH3—n。55.權利要求41所述的化合物，其中"n"為1或2。56.權利要求1所述的化合物，其中W3是CH3。57.權利要求1所述的化合物，其中\￥3是叔丁基。58.權利要求l所述的化合物，其中1124和R2s共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環或雜芳基或雜芳環。59.權利要求l所述的化合物，其中Rm和Rm共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環或雜芳基或雜芳環.60.權利要求l所述的化合物，其中Rm和1127共同形成5、6或7元環，其選自環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜環或雜芳基或雜芳環。61.用於測定過亞硝酸根的試劑，其包含根據權利要求1所述的化合物。62.測定樣品中過亞硝酸根的方法，其包括以下步驟a)使根據權利要求1所述的化合物與樣品接觸；螢光。63.權利要求62所述的方法，其中所述樣品是化學樣品或生物樣品。64.權利要求63所述的方法，其中所述生物樣品是動物細胞、動物組織、植物細胞、植物組織或微生物。65.用於檢測過亞硝酸根的高通量篩選螢光法，其包括使用根據權利要求61所述的試劑。66.用於篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過亞硝酸根的產生，所述方法包括使用根據權利要求l所述的化合物。全文摘要本發明提供了能與過亞硝酸根發生專一性反應，而不與其他的活性氧中間體和活性氮中間體反應的組合物。本發明還提供了用於測定過亞硝酸根的相關試劑。本發明還提供了利用這樣的組合物和試劑測定樣品中過亞硝酸根的相關方法、檢測過亞硝酸根的高通量篩選螢光法和篩選化合物的高通量方法，所述化合物能增加或減少過亞硝酸根的產生。文檔編號G01N31/22GK101321767SQ200680045462公開日2008年12月10日申請日期2006年8月25日優先權日2005年10月7日發明者D·揚,H·王,J·沈,Z·孫申請人:香港大學