抗合成酶症候群EJ自身抗體的檢測方法與應用與流程
2023-05-22 14:16:51 1
本申請屬於生物技術領域，涉及抗合成酶症候群ej自身抗體的檢測方法與應用，具體地涉及抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法和免疫印跡檢測方法與應用。
背景技術：
特發性炎症性肌病(idiopathicinflammatorymyopathies，iim),又稱肌炎(myositis),是一組以侵害骨骼肌為主的系統性自身免疫性疾病。根據最近的診斷分類標準，iim可分為多發性肌炎(polymyositis，pm)、皮肌炎(dermatomyositis，dm)、免疫介導的壞死性肌炎(immune-mediatednecrotizingmyopathy，imnm)、非特異性肌炎(nonspecificmyositis，nsm)和包涵體肌炎(inclusionbodymyositis，sibm)。臨床特點表現為四肢近端肌無力、特徵性皮疹、系統性損害以及血清中存在多種自身抗體(marinosc.dalakas.inflammatorymusclediseases.nengljmed2015；372:1734-1747)。肌炎患者的自身抗體主要分為肌炎特異性自身抗體(myositisspecificautoantibodies，msas)和肌炎相關性自身抗體(myositisassociatedautoantibodies,maas)。maas多見於自身免疫性結締組織病的重疊症候群，而msas一般僅見於肌炎患者，具有高度選擇性、排他性，兩種msas很少出現在同一個患者。
至今已經被鑑定的msas大約有17種，儘管目前肌炎的診斷與分類標準並不包括自身抗體的檢測，但是越來越多的研究顯示肌炎特異性自身抗體與肌炎患者特異的臨床表現具有相關性，它們可能作為肌炎的血清標誌物，輔助肌炎的診斷與疾病分型，甚至可以預測臨床併發症以及對治療的反應性(betteridgez,mchughn.myositis-specificautoantibodies:animportanttooltosupportdiagnosisofmyositis.jinternmed2016；280:8-23)。
氨基醯轉運rna合成酶(aminoacyl-trnasynthetase，ars)是一類存在細胞漿的蛋白質，通過催化胺基酸連接到特異的轉運rna從而參與蛋白質的合成。抗氨基醯轉運rna合成酶的自身抗體，是特發性炎症性肌病中所佔比例最多的一類肌炎特異性自身抗體，陽性率約為25-35％。目前已經發現8種抗合成酶自身抗體如jo-1、pl12、pl7、ej、oj、ha、ks和zo，其中抗jo-1抗體是最常見的，約在15-30％的特發性炎症性肌病患者中存在，在60-70％的間質性肺疾病患者中檢測到，其餘的所有抗體約在10％的特發性炎症性肌病患者中存在(mahlerm,millerfw,fritzlermj.idiopathicinflammatorymyopathiesandtheanti-synthetasesyndrome:acomprehensivereview.autoimmunrev.2014,13:367-71.)。最初的研究顯示抗合成酶抗體只存在特發性炎症性肌病患者中，因此把它們歸為肌炎特異性自身抗體。後來的研究發現抗合成酶抗體在其他的自身免疫結締組織疾病中也存在，含有這類抗體的患者具有共同的特異性的臨床表現，包括肌炎、間質性肺疾病、關節炎、發熱、雷諾氏現象和技工手等臨床表現,統稱為抗合成酶症候群(anti-synthetasesyndrome)。肌肉的組織學研究也顯示抗合成酶症候群是特發性炎症性肌病中獨立的一個亞型。
抗ej抗體是抗合成酶抗體中的一種，靶抗原是甘氨醯轉運rna合成酶(targoffin.autoantibodiestoaminoacyl-transferrnasynthetasesforisoleucineandglycine.twoadditionalsynthetasesareantigenicinmyositis.jimmunol.1990，144:1737-43.)。第一個發現ej抗體陽性的患者有雷諾氏現象、輕度的指端硬化和無力，肌酸激酶水平增高，但是沒有肌活檢和肌電圖的檢查，也不伴有間質性肺疾病。targoffin用放射免疫沉澱方法分析了637例患者(包括肌炎和其他疾病)的ej抗體，發現5例患者存在ej抗體，他們都具有肌炎、皮肌炎的典型皮疹和間質性肺疾病等臨床表現。其中一個患者還診斷為系統性紅斑狼瘡，該患者出現肌炎之前的4個月ej抗體呈陽性(targoffin,trieuep,plotzph,millerfw.antibodiestoglycyl-transferrnasynthetaseinpatientswithmyositisandinterstitiallungdisease.arthritisrheum.1992，35:821-30.)。一個多中心的研究顯示50％的ej抗體陽性的患者被診斷為皮肌炎和無肌病性皮肌炎(hamaguchiy,fujimotom,matsushitat,etal.commonanddistinctclinicalfeaturesinadultpatientswithanti-aminoacyl-trnasynthetaseantibodies:heterogeneitywithinthesyndrome.plosone2013；8:e60442)。因此ej自身抗體的檢測對於肌炎的分類是非常重要的。
檢測ej自身抗體的主要方法有酶聯免疫吸附法(elisa)、放射標記的免疫沉澱方法、免疫印跡法，上述方法各有優缺點：(1)酶聯免疫吸附法(elisa)。elisa雖然為自身抗體的檢測提供敏感性高、快速、高通量且能夠定量的方法，但是目前ej自身抗體尚無商業化的elisa試劑盒，自行包被抗原需要高度純化的ej抗原(商業化購買或實驗室表達純化)，而且抗原包被的條件需要最優化，容易出現假陽性的結果；同時elisa試劑盒需要進行批量檢測，對於發病率不是很高的肌炎，不適合作為臨床實驗室的常規檢測。(2)採用商業化的免疫印跡膜條或者購買純化的抗原蛋白進行免疫印跡,但是這些膜條對抗體滴度不能進行定量而且在國內的推廣還有限。(3)免疫沉澱法是檢測肌炎特異性自身抗體的金標準，一般是採用s35標記hela細胞或k562細胞，然後將待測血清與細胞裂解液進行免疫沉澱，sds聚丙烯醯胺凝膠電泳分離沉澱物，放射自顯影，這是檢測ej自身抗體的金標準。作為金標準的放射標記免疫沉澱法有很高的特異性和敏感性，而且這種方法沉澱的是以天然構象存在的抗原以及與靶抗原相互作用的蛋白分子，但是放射同位素只能用於裝備良好的實驗室，而且這種方法難以區別分子量接近的不同種類的自身抗原。
技術實現要素：
為克服上述現有技術的缺陷，解決目前國內沒有商業化檢測ej抗體的elisa試劑盒以及免疫印跡膜條不能測定滴度的缺陷，以及自行包被ej抗原的elisa試劑盒高成本、高假陽性率和放射標記免疫沉澱法的安全性問題，本發明的目的在於提供抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射性檢測方法，具體地包括抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法和免疫印跡檢測方法。
本發明的目的還在於提供抗合成酶症候群ej自身抗體的上述非放射性檢測方法的應用。
本發明的上述目的通過以下技術方案實現：
抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射性檢測方法，包括：抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法和免疫印跡檢測方法。
所述的抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法，包括以下步驟：
(1)將帶有flag標籤的penter-ej質粒瞬時轉染人胚腎(hek)293細胞48小時，通過westernblot法用flag抗體檢測所述penter-ej質粒在所述人胚腎(hek)293細胞中的過表達；
(2)用proteing磁珠分別與20ulej抗體陽性的抗合成酶症候群患者血清或健康對照血清進行結合，然後與步驟(1)中所述過表達ej的hek293細胞裂解液孵育進行抗原吸附，洗脫後進行sds-page凝膠電泳，用所述flag抗體進行檢測。
所述的抗合成酶症候群ej自身抗體的免疫印跡檢測方法，包括以下步驟：
(1)將帶有flag標籤的penter-ej質粒瞬時轉染人胚腎(hek)293細胞48小時，通過westernblot法用flag抗體檢測所述penter-ej質粒在所述人胚腎(hek)293細胞中的過表達；
(2)將20ug步驟(1)中所述過表達ej的hek293細胞裂解液進行sds-page凝膠電泳，用ej抗體陽性血清作為一抗，用兔抗人iggh&l作為二抗進行檢測。
所述的抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射性檢測方法的應用，用於檢測肌炎患者的抗ej自身抗體。
附圖說明
此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申請的示意性實施例及其說明用於解釋本申請，並不構成對本申請的不當限定。
圖1是本申請所使用的penter-ej質粒圖譜；
圖2是本申請測序證實penter-ej質粒中ej序列和讀碼框的準確性；
圖3是本發明westernblot法檢測penter-ej質粒在hek293細胞的過表達；
圖4是本發明採用ej抗體陽性的抗合成酶症候群患者血清和健康對照血清與過表達ej的hek293細胞裂解液進行免疫沉澱，westernblot檢測沉澱的ej蛋白，從而證實抗合成酶症候群患者血清中ej抗體能夠識別hek293細胞中的含flag標籤的ej；
圖5是本發明將過表達ej的hek293細胞裂解液進行sds-page凝膠電泳，用ej抗體陽性血清作為一抗，用兔抗人iggh&l作為二抗進行檢測，證實ej抗體陽性血清能夠識別hek293細胞中的帶有flag標籤的ej；
圖6是本發明的非放射標記免疫沉澱方法篩選肌炎患者血清中的ej抗體，im為肌炎。
具體實施方式
以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用技術手段來解決技術問題並達成技術功效的實現過程能充分理解並據以實施。
實施例1抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法
1、材料
penter-ej質粒(維真生物公司，ch810182)
flag抗體(sigma-aldrich公司，f1804)
pureproteomeproteing磁珠(millipore公司，lskmagg10)
2、方法
抗合成酶症候群ej自身抗體的非放射標記免疫沉澱檢測方法，包括以下步驟：
(1)將帶有flag標籤的penter-ej質粒(如附圖1所示)進行測序，證實ej序列和讀碼框的準確性(如附圖2所示)；
(2)將2ugpenter-ej、4ugpenter-ej分別瞬時轉染人胚腎(hek)293細胞48小時，sds裂解液裂解hek293細胞，進行sds-page凝膠電泳和轉膜，採用flag抗體進行孵育，發現轉染penter-ej質粒的hek293細胞中有約為75kda的特異性條帶(如附圖3所示)，以上結果提示penter-ej質粒能在hek293細胞中過表達，表達的蛋白質約為75kda的帶有flag標籤的ej；
(3)取50ulproteing磁珠懸液分別與20ulej抗體陽性的抗合成酶症候群患者血清或健康對照血清於4℃持續混勻16h以捕獲抗體，反應後用500μlpbs(含0.1％20)洗滌上述磁珠3-5次，加入200ug過表達ej的hek293細胞裂解液，並用含1％蛋白酶抑制劑的ripa裂解液補足體積至500ul，室溫下旋轉混勻1-2小時進行抗原吸附；重複上述清洗磁珠步驟3-5次，向其中加入40μl1×sds-pageloadingbuffer混合均勻，95℃加熱10min，立即收集上清液至新的ep管；然後將上述樣品於10％sds-page電泳後轉移至pvdf膜上，加入flag抗體雜交，ecl化學發光，證實抗合成酶症候群患者血清的ej抗體能夠特異性地將hek293細胞中過表達的帶flag標籤的ej沉澱(如附圖4所示)。
實施例2抗合成酶症候群ej自身抗體的免疫印跡檢測方法
1、材料
penter-ej質粒(維真生物公司，ch810182)
flag抗體(sigma-aldrich公司，f1804)
ej抗體陽性血清(1:1000稀釋)
兔抗人iggh&l(1:5000，abcam公司，ab6759))
2、方法
抗合成酶症候群ej自身抗體的免疫印跡檢測方法，包括以下步驟：
(1)將2ugpenter-ej，4ugpenter-ej分別瞬時轉染hek293細胞48小時，sds裂解液裂解hek293細胞，進行sds-page凝膠電泳和轉膜，採用flag抗體進行孵育，發現轉染penter-ej質粒的hek293細胞中有約為75kda的特異性條帶(如附圖3所示)，以上結果提示penter-ej質粒能在hek293細胞中過表達，表達的蛋白質約為75kda的帶有flag標籤的ej；
(2)將30ug和60ug過表達ej的hek293細胞裂解液或未轉染penter-ej的hek293細胞裂解液進行sds-page凝膠電泳並轉移至pvdf膜上，用ej抗體陽性血清作為一抗4℃孵育過夜，用兔抗人iggh&l作為二抗室溫孵育1h，ecl化學發光，發現ej抗體陽性血清能夠特異性識別未轉染penter-ej質粒的hek293細胞中約75kda的蛋白質，說明ej這種合成酶在hek293細胞有內源性表達；同時ej抗體陽性血清也能夠特異性識別帶有flag標籤的ej(如附圖5所示)。
實施例3檢測200例肌炎患者血清的ej抗體的陽性率
肌炎患者血清的ej抗體的陽性率，包括以下步驟：
(1)接種30％hek293細胞於75cm2的細胞培養皿，37℃培養小於24小時；
(2)將20ugpenter-ej質粒轉染hek293細胞48小時；
(3)採用1ml含蛋白酶抑制劑的ripa裂解液裂解hek293細胞，蛋白進行定量；
(4)採用flag抗體證實hek293細胞中過表達的ej；
(5)取20ul炎性肌病患者待測血清、陽性血清、陰性血清分別與200ug過表達ej的細胞裂解液進行免疫沉澱，進行sds-page凝膠電泳，然後用flag抗體進行檢測，確定ej抗體在肌炎患者中的陽性率約為1.5％(如附圖6所示)。
上述說明示出並描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明並非局限於本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用於各種其他組合、修改和環境，並能夠在本文所述發明構想範圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和範圍，則都應在發明所附權利要求的保護範圍內。