一種利用scar技術鑑別金龍膽草及其混淆品的scar引物及其方法
2023-05-13 04:28:01
一種利用scar技術鑑別金龍膽草及其混淆品的scar引物及其方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物及其方法，提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，其SCAR-PCR擴增體系為：25μL體系中含有Mg2+2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；擴增程序為：94℃預變性4min，然後進行40個循環：94℃變性1min、36℃復性1min、72℃延伸2min，循環結束後72℃延伸10min，4℃保存；擴增結果有目的條帶的即為金龍膽草真品。方法更為客觀易行，時間短、準確性高，重複性好。
【專利說明】—種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物及其方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的方法。
【背景技術】
[0002]金龍膽草為菊科白酒草屬植物苦蒿ConyzabliniiL6vl.的乾燥地上部分,分布於雲南中、南部，四川攀西地區及貴州部分地區。系70年代四川省發掘的民間草藥，具有清熱化痰，止咳平喘，解毒利溼，涼血止血的功效，近年來的研究更報導其具有一定的抗腫瘤活性，應用前景廣闊。
[0003]金龍膽草的民間俗稱為「苦蒿」，但名為「苦蒿」的植物卻不止一種，且部分植物在形態與化學成分上與金龍膽草相近，使得收購藥材時很難識別混淆品，影響金龍膽草的品質。中草藥傳統的鑑定方法主要是性狀或組織顯微鑑別，以及有效成分含量的指紋圖譜區分道地產品，這些方法各有優缺點或局限性，且需時較長。隨著分子遺傳標記技術的發展，利用分子手段進行藥用植物的遺傳分析，可以使鑑別過程不受樣品形態、外部條件變化、發育時期、次生代謝物含量等因素的影響，更客觀、可靠得提供準確鑑別。
[0004]RAPD技術是建立在PCR基礎之上的一種DNA分子標記之一，可通過多個不同的隨機引物給出覆蓋整個基因組的多態性信息。因其具有快速、簡便、高效、周期短等特點，近年來，在遺傳育種及遺傳多樣性等方面都得到了廣泛的運用，尤其在尋找不同樣品間DNA的差異上被廣泛應用。SCAR分子標記，即序列特異擴增區域標記，是以RAH)技術為基礎的一種新型分子標記，在對RAH)特異擴增條帶測序的基礎上，設計一對特異引物，並利用此引物對基因組DNA進行PCR擴增，以檢測樣品是否為混淆品。此方法簡單，穩定，重複性好，且帶型簡單，可直觀利用「有或無」條帶觀測實驗結果，因此，SCAR標記已逐漸成為分子遺傳育種、植物品系鑑定的首選技術。
[0005]傳統鑑定技術主要以性狀或顯微、化學鑑別為主，存在一定的局限性，無法準確區分化學成分相近，外觀形態相似的金龍膽草及其混淆品。金龍膽草在外形上與白酒草屬植物白酒草，蒿屬植物艾草相似，同時由於民間俗名均為「苦蒿」，也易與青蒿混淆。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的方法。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]一種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
[0009]所述SCAR引物鑑別金龍膽草及其混淆品的方法，包括以下步驟:提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，其SCAR-PCR擴增體系為:25 μ L體系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物 SC2 各 1.5 μ mol/L, DNA 模板60ng，Taq酶1.5U ;擴增程序為:94°C預變性4min，然後進行40個循環:94°C變性lmin、36°C復性lmin、72°C延伸2min,循環結束後72°C延伸IOmin, 4°C保存；擴增結果有目的條帶的即
為金龍膽草真品。
[0010]本發明針對金龍膽草DNA序列的特異性，建立了金龍膽草基因組DNA的RAPD指紋圖譜，成功獲得一個特異SCAR標記，應用這個標記，可以根據凝結電泳判定樣品是否為混淆品，方法更為客觀易行，時間短、準確性高，重複性好。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1:18個金龍膽草樣品的基因組DNA凝膠電泳圖；
[0012]圖2:H37的RAPD特異擴增圖譜；
[0013]圖3 =SCAR轉化後的金龍膽草特異擴增圖譜；
[0014]圖4:左起為marker，1-3分別為白酒草、青蒿和艾草的RAPD擴增譜圖
[0015]圖5:左起為marker，1-4分別為白酒草、青蒿、艾草和金龍膽草的SCAR擴增譜圖
【具體實施方式】
[0016]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0017]本發明涉及到的SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的方法，具體包括以下步驟:
[0018]1、採用改良的SDS 法提取18個不同地區採集的金龍膽草基因組DNA (圖1)，方法為取約0.15g新鮮葉片(幹樣取三分之一重)置於研缽中以液氮快速研磨為粉末，將粉末快速轉移至 1.5mLEppendorf 管中，加入 800 μ L 提取緩衝液(1.4%SDS, IOOmmoI/LTris-HcI,50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，臨用前加入 0.1%14.4mol/LP -巰基乙醇及 2%PVP)，65°C水浴40min至溶液變為土黃色,加入150 μ IKAc,充分混勻,冰浴30min以沉澱蛋白質；室溫下12000r/min離心15min，上清液加入200 μ I氯仿/異戊醇(24:1)混勻，12000r/min離心lOmin，反覆操作2-3次；上清液加入0.6倍體積異丙醇(_20°C預冷)，-20°C冷卻30min ;離心5min收集沉澱。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA分子量，以λ DNA/HindIII為Maker，核酸蛋白儀(Bio-Rad公司)測定DNA濃度和蛋白質殘留。
[0019]表1供試實驗材料
[0020]
【權利要求】
1.一種利用SCAR技術鑑別金龍膽草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引物SCl和引物SC2，引物SCl和引物SC2序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
2.根據權利要求1所述SCAR引物鑑別金龍膽草及其混淆品的方法，其特徵在於，包括以下步驟:提取混淆品植物的基因組DNA，將樣品的基因組DNA進行SCAR-PCR擴增，其SCAR-PCR 擴增體系為:25 μ L 體系中含有 Mg2+2.5mmol/L, dNTPs4.5mmol/L,引物 SC1、引物SC2各1.5 μ mol/L, DNA模板60ng, Taq酶1.5U ;擴增程序為:94°C預變性4min,然後進行40個循環:94°C變性lmin、36°C復性lmin、72°C延伸2min，循環結束後72°C延伸10min，4°C保存；擴增結果有目的 條帶的即為金龍膽草真品。
【文檔編號】C12N15/11GK103589783SQ201310373522
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】陳惠 , 劉姍, 孫榮, 唐自鍾, 高靜雷, 李成磊, 韓學易, 吳琦, 黃曉燕 申請人:四川農業大學