一種同時提取刺激兩類t細胞的結核桿菌抗原的方法

2023-05-13 04:38:01 1

專利名稱：一種同時提取刺激兩類t細胞的結核桿菌抗原的方法
技術領域：
本發明屬於抗結核分枝桿菌感染的細胞免疫學技術領域，具體地說是一種同時提取可刺激α βT細胞和Y δT細胞增殖的結核桿菌蛋白質抗原的方法。
背景技術：
由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的結核病，目前仍是發病率和病死率最高的傳染病之一。然而迄今為止，關於結核病的發病機制，特別是機體對Mtb感染的免疫機制並未完全闡明。以前的大量研究報導證明T細胞特別是普通T細胞即α 01~細胞(包括00411細胞和00811細胞)和巨噬細胞在抗結核桿菌感染的免疫保護作用中起著關鍵性的地位，因此對於探討涉及免疫保護作用或致病性的結核桿菌的抗原也是集中在α β T細胞所識別的是抗原及其表位。但近年來，另外一類數量較少的T細胞即
Yδ T細胞在抗結核感染免疫的中的保護作用，或者可能參與致病的作用，也已日益得到關注和重視。由於這類Y S T細胞在識別抗原的方式與普通的α β T細胞有所不同，可以以 MHC非限制性方式識別肽類和非肽類抗原。因此，多數研究者關注Y δ T細胞對非肽類抗原如磷酸類抗原的識別方式和機制，而對來自結核桿菌的蛋白多肽抗原的識別的研究報導較少。美國學者Boom曾報導來自結核桿菌的耐熱性的低分子蛋白，可以特異性優先激活人
YST細胞的增殖。我們在十多年前就開始應用這種抗原探討Y δT細胞在抗原識別和激活後的信號轉導的機制，以及比較這種抗原對結核病患者和健康個體的Y S T細胞的激活和誘導凋亡作用方面的差異。由於最早報導的製備這種耐熱性抗原的過程較漫長和繁瑣， 獲得量不高，特別是各製備批次之間的活性差別較大。另外，在多數對α βΤ細胞識別結核桿菌分泌性抗原的研究也僅是關注少數蛋白抗原的表位，而不能從蛋白組學和抗原組學的角度深入了解α βT細胞對結核桿菌抗原庫的識別。因此，對T細胞識別結核桿菌抗原庫的研究需要重視這兩類T細胞，S卩α βT細胞和γ δT細胞所識別的抗原進行更為深入的探索研究，也就需要建立可以同時提取刺激α βT細胞和γ δT細胞活化和增殖的結核桿菌抗原的方法，以滿足對這兩類T細胞所識別的抗原的實驗研究需要。這對於全面和確切深入了解機體在結核桿菌感染的免疫保護作用和病理機制，有重要的學術探討意義和臨床實用價值。

發明內容
本發明目的在於建立一種實用而有效的從結核分枝桿菌同時提取可刺激兩類T 細胞增殖的蛋白質抗原的方法，其設計原理和操作方案是採用分步培養法和超濾技術批量製備結核分枝桿菌分泌性蛋白抗原和菌體耐熱性低分子蛋白抗原，可分別有效地刺激 α βT細胞和γ δT細胞的增殖。本發明的方法包括以下步驟1.將結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，如H37Ra)接種於不含血清或其他蛋白的結核桿菌液體培養基。通常用蘇通氏液體培養基或者Middlebr00k7H9，置37度溫箱培養2周左右時，收集培養上清。此培養上清即為結核桿菌的早期培養上清，含有結核桿菌分泌性蛋白。2.將上述結核桿菌的早期培養上清，放入超濾柱(截留分子量3kDa)中，離心， 4000r/min，40分鐘，收集截留物後，再加少量(如0. 5ml)洗滌超濾柱膜，收集殘留液體與收集截留物合併，即為濃縮的結核桿菌分泌性蛋白，是特異性刺激α βΤ細胞活化和增殖的蛋白抗原。3.將上述離心沉澱的結核桿菌加入含有約10%新生牛血清的結核桿菌液體培養基，如蘇通氏液體培養基或者Middlebrook 7Η9，或將菌體接種於結核桿菌的固體培養基， 如羅-琴氏培養基，或Middlebrook 7Η10和7Η11等固體培養基，置於37度溫箱培養5周左右，即約在32天至38天時收集菌體。4.將上述收集的結核桿菌菌體加2倍體積純水，在高壓滅菌器，於115°C至121°C 處理20或者30分鐘，離心收集上清液，即為含有刺激α β T細胞和γ δ T細胞的蛋白抗原。5.將上述高溫處理的結核桿菌上清液，移入到超濾柱(截留分子量30kDa)，離心過濾，4000r/min，40 60分鐘，收集截留物為富含刺激α β T細胞的大分子蛋白抗原，可與上述步驟2收集的結核桿菌分泌性蛋白合併一起，作為特異性刺激α β T細胞的蛋白抗原。6.經上述超濾柱(30kDa)離心過濾後的濾過物，再放入超濾柱(截留分子量 3kDa)離心，4000r/min，40分鐘後，收集截留物，即為濃縮的富含低分子蛋白多肽組分，是特異性刺激Y ST細胞活化增殖的耐熱性低分蛋白抗原。7用結核桿菌早期分泌蛋白質抗原和菌體釋放耐熱性低分子蛋白抗原，在體外分別刺激人外周血α β T細胞和γ δ T細胞增殖，具體方法如下(1)人外周血採集後用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離獲取單個核細胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養液製備細胞懸液後放入M孔培養板，加入可刺激人α βΤ細胞的結核桿菌早期分泌蛋白質抗原，最適使用終濃度為5 10yg/ml，或者加入可刺激人Y ST細胞活化增殖的結核桿菌菌體耐熱性低分子蛋白抗原，最適使用終濃度為4 8μ g/ml。(2)將培養板置於(X)2培養箱，於37°C，5% CO2和飽和溼度下培養，(3) 在培養開始或者培養3天後，加入人重組IL-2，終濃度為20 50u/ml，並每隔3 4天補充同樣劑量的IL-2。(4)在培養過程中，每隔3 4天觀察細胞增殖，根據細胞增殖程度分孔擴大培養；(5)在培養第7 9天時，或者更長天數時，取出擴增培養的細胞，通常大多數是T細胞，並計數擴增的細胞數量。(6)取出的擴增細胞用螢光標記單抗染色後，在流式細胞儀上檢測T細胞表型，計算不同T細胞亞群，即α β T細胞中的⑶4+Τ細胞和⑶8Τ+細胞，以及Y S T細胞的比例以及擴增的細胞數量，並計算擴增倍數。8.結核桿菌早期培養上清經過超濾柱離心濃縮的結核桿菌早期分泌蛋白質抗原，以及菌體釋放耐熱性蛋白抗原經過超濾柱離心濃縮分離後的低分子蛋白的分子量鑑定，通過應用常規的聚丙烯凝膠電泳 (SDS-PAGE)，和快速蛋白液相層析系統(FPLC)進行。本發明的方法的主要特點是⑴重視和增加對刺激Y δ T細胞的蛋白多肽抗原的提取方法。( 除了提取結核桿菌中特異性刺激α β T細胞分泌性抗原外，在提取刺激 Y S T細胞的抗原組分時，同時分離和收集能刺激α β T細胞的大分子蛋白抗原，擴大了刺激α βΤ細胞的抗原庫。(3)在製備抗原時，採取不同的培養條件培養結核桿菌。為獲取單純的結核桿菌分泌性抗原時，用不含任何蛋白成分的基礎液體培養基，如蘇通氏液體培養基培養；在需要快速生長培養結核桿菌菌體時，則在培養基中添加含量較高的新生牛血清。(4)充分利用超濾的原理和技術，採用和組合不同截留分子量的超濾膜分離和濃縮刺激 Y S T細胞和α β T細胞的抗原。(5)縮短實驗過程，充分利用和節省資源。


。圖1.結核桿菌分泌性蛋白的電泳結果結核桿菌的早期培養上清，經過超濾柱(截留分子量3kDa)離心濃縮後的分泌蛋白，在SDS-PAGE凝膠上電泳，經過考馬斯亮蘭染色後的條帶，顯示含有多個蛋白組分，右側為蛋白分子量標準。圖2.結核桿菌菌體耐熱性蛋白成分經超濾柱分離為大分子和低分子兩個組分結核桿菌菌體高溫處理上清含釋放的菌體混合蛋白，經過兩種不同截留分子量超濾柱的超濾，濃縮和分離為大分子蛋白組分和低分子蛋白組分。圖中顯示不同蛋白樣品在快速蛋白液相層析系統(FPLC，AKTA Explorer 100)上檢測結果圖。(A)圖為結核桿菌菌體耐熱性蛋白混合組分，超濾柱過濾前樣品，顯示含有大分子蛋白組分和低分子蛋白組分。(B)圖為結核桿菌耐熱性蛋白混合組分，經過超濾柱(截留分子量30kDa)超濾後的截留物，為含有大分子蛋白組分，有刺激α β T細胞增殖的活性；(C) 圖顯示的是結核桿菌耐熱性蛋白混合組分經過超濾柱(截留分子量30kDa)超濾離心的濾出物，再在超濾柱(截留分子量3kDa)超濾離心收穫的截留物，顯示含有低分子量(約在 10 14kDa)的蛋白組分，有特異性刺激人Y δ T細胞的增殖的抗原活性。圖3，人外周血單個核細胞用結核桿菌耐熱性抗原刺激後Y δ T細胞的增殖人外周血分離獲取的單個核細胞，用不同批次結核桿菌耐熱性菌體抗原(5μ g/ml)和(或單加) rhIL-2 (50u/ml)，每3 4天分孔傳代並補加50u rhIL-2以維持細胞生長，培養第9天時收穫細胞。用螢光標記單抗(抗⑶3mAb，抗TCR γ δ mAb)檢測、δ T細胞在擴增細胞中比例。圖中顯示的為一次代表性的流式檢測分析圖(A)和(B)分別代表未加抗原和IL-2組， 和單純加IL-2培養組，(C)、(D)、和(E)分別代表不同批次有較高活性(低分子蛋白含量高)的耐熱菌體抗原，(F)為活性稍低(低分子蛋白含量低)抗原批次的刺激結果。圖4，結核桿菌分泌性抗原刺激人外周血CD4+T細胞的增殖人外周血分離出單個核細胞後在用貼壁粘附法和尼龍毛柱分離技術獲取單核細胞和純化T細胞，用活細胞螢光染料CFSE標記T細胞後，加結核桿菌分泌性抗原(Mtb-SAg) 刺激和添加IL-2擴增培養，於第11天收集細胞用螢光標記單抗(抗CD3和抗CD4)染色後在流式細胞儀上檢測。(A)圖顯示流式檢測分析圖，顯示CFSE螢光降低的CD4+T細胞為增殖細胞，其中(a)，(b)和(c)分別為單純T細胞組，純化T細胞+單核細胞組，和純化T細胞+樹突狀細胞(DC)組。(B)顯示的統計結果，以增殖細胞比例和增殖指數表示上述三組實驗的結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例1本實施例1是採用分步培養法大量製備結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和菌體耐熱性抗原，包括以下步驟
1.將結核桿菌菌體種子溼重50克接種於200ml的蘇通氏液體培養基內，於37°C 培養箱內靜止培養2周，經4000轉/分離心30分鐘以收穫結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原，經考馬斯亮藍G-250法測定早期培養濾液的蛋白質濃度，其濃度大約為700yg/ml。2.將培養2周的結核桿菌培養液內添加終濃度為10%的新生牛血清，再繼續於 37°C培養箱內靜止培養4周，收集培養的細菌懸液，經4000轉/分離心30分鐘以收穫結核桿菌菌體。將菌體依次經生理鹽水洗滌2次，再用兩倍體積的蒸餾水重懸浮細菌，將菌體經 121°C高壓蒸汽處理30分鐘，以獲取結核桿菌耐熱性蛋白質抗原，採用此方法收穫的結核桿菌耐熱蛋白質抗原的濃度大約為500μ g/ml。3採用超濾柱離心超濾法收穫提取結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和菌體耐熱性蛋白質抗原。首先將結核桿菌早期培養濾液經超濾柱(截留分子量為3kDa)在4000轉 /分離心60分鐘超濾，以濃縮收穫結核桿菌早期分泌蛋白，可用於體外顯著優先刺激人 α β T細胞大量活化增殖。4.將培養4周收穫的結核桿菌菌體經121°C高壓蒸汽處理30分鐘，收穫菌體釋放蛋白，將此耐熱蛋白質抗原先經超濾柱(截留分子量為30 kDa)在4000轉/分離心60分鐘超濾，將其離心過濾液再經超濾柱(截留分子量為3 kDa)在4000轉/分離心60分鐘超濾濃縮，以收穫提取到結核桿菌耐熱蛋白質抗原，此抗原可用於體外顯著優先刺激人Y δΤ 細胞的大量活化增殖。5.結果採用本發明方法製備的每IOOml的結核桿菌早期培養濾液濃縮獲得的早期分泌性蛋白質抗原的量約為69mg。表明早期分泌性蛋白質抗原的損耗很少。而每100 ml 的經高壓蒸汽處理菌體懸液而製備的菌體釋放蛋白溶液，經超濾提取的菌體耐熱性蛋白質抗原的量達到48 mg，也表明該蛋白質抗原的損耗很少。實施例2本實施例1是用結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和菌體耐熱性蛋白質抗原分別體外刺激人外周血α βT細胞和γ δT細胞後顯著大量活化和增殖。具體操作包括以下步驟1.採集健康人外周血經聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心法分離獲得的單個核細胞放入M孔細胞培養板內，調整細胞密度為Ixio6Ail，每孔加入1 ml，每孔添加人IL-2 50 u/ml和不同濃度的結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原，於胞37°C 5% CO2溫箱中培養。根據細胞生長情況，結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原刺激組，自培養開始後每2至3天細胞分孔擴大培養；而結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原刺激組，則於培養後第6至8天後才開始細胞分孔擴大培養。各組均應每3天向培養液內添加人IL-2 50 u/ml。定期計數觀察細胞增殖情況，於培養第12天收穫各組細胞，記錄擴增細胞懸液體積和計數擴增細胞總數。2.用流式細胞儀對擴增T細胞亞群的檢測和計算擴增倍數。取上述培養擴增12 天的細胞，用含5%新生牛血清和0. 疊氮鈉的PBS溶液洗滌2次，調整細胞密度為IxlO6/ ml，每個檢測管內加入50 μ 1細胞懸液，加入螢光標記抗體(抗^3呼1幾，抗110^ β-PE, 抗TCR γ δ-PE)染色，置4°C染色30分鐘，用上述PBS溶液離心洗滌2次，加含多聚甲醛的PBS溶液固定後，在流式細胞儀上檢測，數據文件採用WinMDI軟體分析。3結果(1)結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和菌體耐熱性蛋白質抗原濃度對擴增人淋巴細胞亞群的影響經結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原刺激培養的人外周血α β T 細胞擴增比例顯著高於結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原刺激組，隨著早期分泌性蛋白質抗原的刺激劑量增加，其刺激人α β T細胞活化增殖的活性也逐漸增加，其最適刺激劑量為 10yg/ml，培養增殖的人α β T細胞佔總擴增細胞的比例高達85%，而人、δ T細胞增殖比例很低，僅為2%。與此相反，經結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原刺激培養的人外周血 Y δ T細胞擴增比例顯著高於結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原刺激組，隨著菌體耐熱性蛋白質抗原的刺激劑量增加，其刺激人Y S T細胞活化增殖的活性液逐漸增加，其最適刺激劑量為5yg/ml，培養增殖的人γ δ T細胞佔總擴增細胞的比例高達80%，而人Y δ T細胞增殖比例很低，僅為8%。 (2)結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原和菌體耐熱性蛋白質抗原濃度對人外周血淋巴細胞中α β T細胞和γ δ T細胞亞群的絕對擴增倍數經結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原刺激培養的人外周血α βT細胞絕對擴增數量顯著高於結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原刺激組，隨著早期分泌性蛋白質抗原的刺激劑量增加，其刺激人α β T細胞活化增殖的活性也逐漸增加，在其最適刺激劑量10 μ g/ml時，在6個健康個體中，培養增殖的人α βΤ 細胞的絕對擴增倍數高達182倍至270倍。與此相反，經結核桿菌菌體耐熱性蛋白質抗原刺激培養的人外周血Y ST細胞絕對擴增倍數顯著高於結核桿菌早期分泌性蛋白質抗原刺激組，隨著菌體耐熱性蛋白質抗原的刺激劑量增加，其刺激人Y S T細胞活化增殖的活性也逐漸增加，在其最適刺激劑量5yg/ml時，在6個健康個體中，培養增殖的人、δτ細胞絕對擴增細胞倍數高達430倍至510倍。
權利要求
1.一種從結核分枝桿菌同時提取可刺激兩類T細胞增殖的蛋白質抗原的方法，其特點是採用分步培養法和超濾技術製備結核分枝桿菌分泌性蛋白抗原和菌體耐熱性低分子蛋白抗原，可分別刺激α βT細胞和γ δτ細胞的增殖。本發明的方法包括以下步驟(1)將結核分枝桿菌接種於不含血清或其他蛋白的結核桿菌液體培養基，置37度溫箱培養2周左右時，收集培養上清。(2)將上述結核桿菌的早期培養上清經過超濾柱(截留分子量3kDa)離心收集截留物， 即為濃縮的結核桿菌分泌性蛋白，是刺激α βT細胞增殖的蛋白抗原。(3)將上述離心沉澱的結核桿菌加入含有5 15%動物血清的結核桿菌液體培養基， 或將菌體接種於適合於培養結核桿菌的固體培養基，置於37度溫箱培養4周 6周時收集菌體。(4)將上述收集的結核桿菌菌體加入1至3倍體積純水，在高壓滅菌器設置於105°C至 123°C處理10至30分鐘，離心收集上清液，即為含有刺激α β T細胞和、δ T細胞的蛋白抗原。(5)將上述高溫處理的結核桿菌上清液先經超濾柱(截留分子量30kDa)離心過濾，收集的截留物為富含刺激α βT細胞的大分子蛋白抗原。(6)經上述超濾柱(30kDa)離心過濾後的濾過物，再經超濾柱(截留分子量3kDa)離心後，收集截留物，即為濃縮的富含低分子蛋白多肽組分，是特異性刺激Y S T細胞活化增殖的耐熱的低分蛋白抗原。
2.根據權利要求1所述的用於製備刺激兩類T細胞抗原的結核分枝桿菌，是指各種來自人型或者其他動物(如牛型)結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。
3.根據權利要求1中所述的兩類T細胞，來是指人類或者其他哺乳類動物的兩類T淋巴細胞，即α β T細胞和γ δ T細胞。α β T細胞是指其抗原識別受體，或稱T細胞受體 (TCR)由α鏈和β鏈組成，而γ δ T細胞是指其TCR由、鏈和δ鏈組成。
4.根據權利要求1中(1)和( 所述的結核桿菌液體培養，是指不含血清或其他蛋白成分的特別適合於培養結核桿菌的培養液，如(但不僅限於)蘇通氏培養基和Middlebrook 7H9 等。
5.根據權利要求1中(3)所述的適合於培養結核桿菌的固體培養基，是指類似於(但不僅限於)羅-琴氏培養基和Middlebrook 7H10和7H11等固體培養基。
6.根據權利要求1中(3)所述的「含有5 15%動物血清」，通常為(但不僅限於)小牛血清，新生牛或胎牛血清，合適的血清濃度是10%。
7.根據權利要求1中(1)所述的「培養2周左右」，合適的時間是培養14 16天。(3) 中所述的「培養4 6周」，合適的時間是5周左右，或32天至38天。
8.根據權利要求1中(4)所述的「1至3倍體積純水」，其合適的體積是壓積菌體的2 倍體積；「高壓滅菌器於105°C至123°C處理10至30分鐘」，其合適的條件是115°C至121°C， 20分鐘至30分鐘。
9.根據權利要求1中(2)和(5)所述的「經過超濾柱......離心收集「，其離心條件根據生產超濾柱廠家的使用說明操作，通常的離心條件是4000r/min，30分鐘至60分鐘。
10.根據權利要求1中O)、(5)和(6)所述的「經過超濾柱......離心，收集截留物」，是指經過離心後留在超濾柱膜表面的少量液體，含有濃縮的蛋白組分，並可在取出後再加適量(如0. 2至0. 5ml)純水洗滌超濾膜後，以收穫殘留的濃縮蛋白組分。這兩部分截留物兩者合併一起即為濃縮的蛋白組分。
全文摘要
本發明屬於抗結核感染免疫的技術領域，具體說是從結核桿菌同時提取可刺激αβT細胞和γδT細胞的蛋白類抗原的方法。本發明包括以下步驟(1)將結核桿菌接種在蘇通培養基培養2周後收集上清，經超濾柱(截留分子量3kDa)離心濃縮獲取早期分泌蛋白，為刺激αβT細胞的抗原；(2)結核桿菌用含10％小牛血清蘇通培養基再培養4周後收集菌體，加水高溫處理後離心收集上清，先經超濾柱(截留分子量30kDa)離心，濾過液再經超濾柱(截留分子量3kDa)離心濃縮，獲取截留的低分子蛋白成分為刺激γδT細胞的抗原。本發明的優點是培養條件和操作較簡便，能在短期內同時製備可刺激αβT細胞和γδT細胞的蛋白抗原。
文檔編號C12P21/02GK102304556SQ20111007247
公開日2012年1月4日 申請日期2011年3月24日 優先權日2011年3月24日
發明者彭美玉, 李柏青, 胡中浩, 陳勇, 馬飛 申請人:蚌埠醫學院