一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法
2023-05-12 23:21:36 2
專利名稱：一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法
技術領域：
本發明涉及一種分離植物根系木質部薄壁細胞原生質體的方法，尤其涉及一種水稻根系 木質部薄壁細胞原生質體的分離方法。
背景技術：
1960年Cocking用酶法首次分離出了有活性的原生質體。1971年Takebe等從菸草葉片 分離原生質體，經培養獲得再生植株，原生質體的研究和應用進入了新的階段。原生質體是 去除了細胞壁被質膜所包圍的、具有生活力的"裸露細胞"，是基因轉化的理想受體。植物 原生質體培養是細胞融合的前提，可以被用來克服遠緣雜交中的某些障礙，更廣泛地組合植 物的各種有利的遺傳性狀。並且可用於細胞器移植和細胞突變體篩選，是植物生物技術研究 的重要組成部分和基礎性工作，已成為植物品種改良的新途徑。這一技術己經被成功地用於 植物品種改良，比如提高作物的抗病性、抗冷性和抗凍性。由於原生質體本身所具有的特點 及其培養技術與有關的細胞、分子和遺傳等學科的交叉滲透，使植物原生質體的研究越來越受 到重視。研究領域也從分離原生質體進行的生理生化和利用不同材料的原生質體得到再生植 株的階段轉到原生質體的應用(尤其是遺傳性狀改良)方面。
原生質體不僅可以作為一個單細胞系統來研究細胞壁再生、細胞分裂與分化、攝入細胞 器、病毒侵染機理、膜透性及離子轉運等基礎理論研究的理想材料；而且,近年來以原生質體 為材料利用膜片鉗技術研究離子通道及原生質體在受光、脅迫和激素作用後的調劑機制已經 成為人們所熱切關注的問題。與此同時，原生質體也被用來作為研究植物細胞鈣信號轉導及其 調節機制的理想材料。
水稻是我國一種重要的糧食作物，其原生質體在細胞融合、轉基因雜交育種等方面被廣 泛研究，但有關其原生質體質膜特性，尤其是根系細胞原生質體質膜的研究卻鮮有報導。植 物的細胞膜有一層主要成分是纖維素和果膠的高分子物質所包裹，給其游離帶來了困難，所 以其研究遠遠不及動物細胞膜起步早和透徹。
發明內容
本發明提供一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法。 本發明的具體技術方案如下
1、 分離酶液和基本液配製
基本液10mmol/LKCl、 2mmol/LMES、 2mmol/LCaC12、 20mmol/L蔗糖、20mmol/L 葡萄糖，調pH至5.7，山梨醇調滲透勢至580mosmo1。
中柱木質部薄壁細胞原生質體分離酶液"/。纖維素酶-RS、 0.02%果膠酶、0.02%BSA，
用基本溶液配置。
2、 材料培養在潤溼的濾紙兩層中均勻適當間隔鋪一層水稻種子，無光照條件下放置 24 h。種子萌發後，播種於裝滿石英砂的培養缽中，培養條件為25.5'C、溼度60%、日光照 10 h，培養一周後取出。將幼苗根系清洗乾淨，取根系中較粗壯的，去除尖端lcm長度及上 部長有側根的部分，剩下的2 3cm作為材料來源。
3、 中柱分離將根斷(步驟(2)中所得材料)置於0.2%。3(:12溶液中，用小鑷子輕輕 敲擊，致根系呈扁平狀，用鑷子尖端輕輕劃開根系，將皮層部分從中剝落下來(中柱部分因 木質化而與皮層部分區分開來)，從而獲得水稻根系中柱。獲得的中柱置於0.2%CaC12溶液 中。
4、 中柱木質部薄壁細胞原生質體製備取適量中柱用剪刀剪至lmm長切段，置於小三 角瓶中，加中柱原生質體分離酶液4 ml， 3(TC低速振蕩水解40 min加6 ml基本液終止水解， 細胞篩過濾，濾液100r/min離心7 min，保留下層約4ml溶液，力n 6ml胞外液相同條件離心， 保留下層約4ml溶液，倒於小平皿中，4'C靜置2h。
本發明選取了水稻Oryza sativa L.幼苗根部伸長及成熟區未著生側根的部位2~3 cm為材 料，使用不同組分的水解酶液，找出最佳的分離條件，並成功得到了完好的中柱木質部薄壁 細胞原生質體。目前，國內外尚無相關報導。
植物細胞原生質體的分離是研究質膜性質尤其是後續對離子通道研究的第一步，如何分 離出細胞膜結構和功能完整的原生質體是關鍵。
通過實驗確定了水稻OryzasativaL.幼苗根系中柱木質部薄壁細胞原生質體的分離條件。 中柱主要由導管和篩管等輸導組織構成，起到向上輸送水分和鹽分的作用。由於導管是死細 胞，木質化程度很高，當用機械方法分離出中柱後，在特定組分的水解酶作用下，導管可以 從中游離出來，從而釋放出環繞在周圍的木質部薄壁細胞。
具體實施例方式
1、 中柱原生質體分離材料培養-
取大小培養皿各一隻，在小培養皿中鋪以濾紙兩層，潤溼，均勻適當間隔鋪一層水稻種 子，蓋上大培養皿，無光照條件下放置24h。
種子萌發後，播種於裝滿石英砂的培養缽中，培養條件為25 5'C、溼度60%、日光照 10 h。 一周後取出幼苗，洗淨石英砂。
2、 中柱分離
將水稻幼苗根系清洗乾淨，取根系中較粗壯的，去除尖端lcm長度及上部長有根毛的部 分，剩下的2 3cm作為中柱材料的來源。
將根斷置於0.2%(:&(:12溶液中，用小鑷子輕輕敲擊，致根系呈扁平狀，用鑷子尖端輕輕 劃開根系，將皮層部分從中剝落下來(中柱部分因木質化而與皮層部分區分開來)，從而獲得 水稻根系中柱。
獲得的中柱置於0.2%CaC12溶液中。
3、 酶液的配製
中柱原生質體分離酶液P/。纖維素酶-RS、 0.02%果膠酶、0.02%BSA，用基本溶液配置。 基本液10mmol/LKCl、 2mmol/LMES、 2 mmol/L CaC12、 20mmol/L蔗糖、20mmol/L 葡萄糖，調pH至5.7，山梨醇調滲透勢至580mosmo1
4、 中柱細胞原生質體的製備
取適量中柱用剪刀剪至1 mm長切段，置於小三角瓶中，加1%纖維素酶-RS 4ml， 30 'C低速振蕩水解40min加6ml基本液終止水解，細胞篩過濾，濾液100r/min離心7 min，保 留下層約4ml溶液，加6ml胞外液相同條件離心，保留下層約4ml溶液，倒於小平皿中，4 'C靜置2h。
通過以上步驟成功得到了完好的水稻根系木質部薄壁細胞原生質體。
權利要求
1、一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法，其特徵在於，所述方法由以下幾個步驟組成1)基本液和分離酶液配製基本液10mmol/L KCl、2mmol/L MES、2mmol/L CaCl2、20mmol/L蔗糖、20mmol/L葡萄糖，調pH至5.7，山梨醇調滲透勢至580mosmol中柱木質部薄壁細胞原生質體分離酶液1％纖維素酶-RS、0.02％果膠酶、0.02％BSA，用基本溶液配置；2)材料培養在潤溼的濾紙兩層中均勻適當間隔鋪一層水稻種子，無光照條件下放置24h；種子萌發後，播種於裝滿石英砂的培養缽中，培養條件為25.5℃、溼度60％、日光照10h，培養一周後取出；將幼苗根系清洗乾淨，取根系中較粗壯的，去除尖端1cm長度及上部長有側根的部分，剩下的2～3cm作為材料來源；3)中柱分離將根斷置於0.2％CaCl2溶液中，用小鑷子輕輕敲擊，致根系呈扁平狀，用鑷子尖端輕輕劃開根系，將皮層部分從中剝落下來，從而獲得水稻根系中柱；獲得的中柱置於0.2％CaCl2溶液中；4)中柱木質部薄壁細胞原生質體製備取適量中柱用剪刀剪至1mm長切段，置於小三角瓶中，加中柱原生質體分離酶液4ml，30℃低速振蕩水解40min加6ml基本液終止水解，細胞篩過濾，濾液100r/min離心7min，保留下層約4ml溶液，加6ml胞外液相同條件離心，保留下層約4ml溶液，倒於小平皿中，4℃靜置2h。
2、 根據權利要求1所述一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法在水稻細胞膜 性質和功能研究中的應用。
全文摘要
本發明提供一種水稻根系木質部薄壁細胞原生質體的分離方法。本發明選取了水稻Oryzasativa L.幼苗根部伸長及成熟區未著生側根的部位2～3cm為材料，使用不同組分的水解酶液，找出最佳的分離條件，並成功得到了完好的中柱木質部薄壁細胞原生質體。目前，國內外尚無相關報導。
文檔編號C12N5/04GK101358181SQ20081019642
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者 張, 隼 李, 趙福庚 申請人:南京大學