一種用於EB病毒衣殼抗原和核抗原1蛋白抗體聯合檢測的蛋白質晶片及其製備和應用的製作方法
2023-05-13 03:51:11
本發明涉及一種用於愛潑斯坦一巴爾病毒(Epstein一Barr virus，簡稱EB病毒)衣殼抗原和核抗原1蛋白抗體聯合檢測的蛋白質晶片，屬於生物技術領域。
背景技術：
EB病毒是一種普遍存在的人類γ皰疹病毒，主要通過唾液傳播感染人的上皮細胞和B細胞，與許多疾病的發生都有著密切的關係，威脅著人類的健康。EB病毒是傳染性單核細胞增多症(IM)的病原體，30–70％在青春期獲得的原發感染會發展為IM。而EB病毒潛伏性感染則存在於90％以上的世界人口，與多種惡性腫瘤的病因相關，包括鼻咽癌(NPC)、淋巴惡性腫瘤、移植後淋巴組織增生性疾病(PTLD)、系統性紅斑狼瘡(SLE)和胃癌(GC)等。EB病毒相關腫瘤的發病率約每年200000例，是一種廣泛有用的腫瘤標誌物。
目前EB病毒的檢測，臨床上常用Real-time PCR檢測病毒載量(VL)、ELISA/IIF分析血清學抗體來反映病毒感染階段和發展風險，但存在病毒載量沒有標準臨界值和ELISA/IIF檢測靈敏度較低的缺陷。間接化學發光法(CLIA)是廣泛使用的自動化EB病毒血清學檢測平臺，敏感性高於ELISA，但特異性稍差。ELISA和CLIA每次一般只能對一種抗體進行分析，而單個指標對感染狀態不足以進行有效診斷。對多種抗體進行檢測時，工作量也會增大。因而，研發一種簡單易行的、以高特異性和敏感性為目標的新型生物晶片進行集成檢測，將很有意義。
血清學檢測是常用的診斷工具，可以檢測EB病毒感染的不同階段。病毒衣殼抗原(VCA)具有很強的免疫原性，最初感染EBV的患者血清中可檢測到VCA-IgM抗體，是EB病毒近期感染的標誌，對於免疫活性人群來說是診斷IM的最重要方法。VCA-IgG抗體隨後出現。EBV核抗原1蛋白(EB病毒EBNA-1)是唯一一個在所有EB病毒相關腫瘤細胞中都表達的病毒蛋白，其IgG陽性結果可以排除急性EB病毒感染，是既往感染的標記。
本發明的檢測指標是基於共識的EBV抗體譜：原發感染以VCA IgM抗體陽性和EBNA-1 IgG抗體陰性為特徵，而既往感染的以VCA IgM抗體陰性和VCA IgG、EBNA-1IgG抗體陽性為特徵。聯合檢測可進一步提高其檢測性能，且聯合檢測方便省時,有利於檢測晶片的應用推廣。
技術實現要素：
本發明的目的之一在於提供一種用於EB病毒衣殼抗原和核抗原1蛋白聯合抗體檢測的蛋白質晶片及其製備方法和使用方法，以用於人血清中EB病毒衣殼抗原IgM抗體、衣殼抗原IgG抗體和核抗原1蛋白IgG抗體的聯合檢測。
本發明的另一個目的在於提供一種基於上述蛋白質晶片的蛋白質晶片試劑盒。
本發明解決技術問題採用如下技術方案：
一、本發明首先公開了一種用於EB病毒衣殼抗原和核抗原1蛋白聯合抗體檢測的蛋白質晶片，其特點在於：所述蛋白質晶片用於人血清中EB病毒衣殼抗原IgM抗體、衣殼抗原IgG抗體和核抗原1蛋白IgG抗體的聯合檢測；所述蛋白質晶片是在固相載體表面點陣固定有EB病毒衣殼抗原探針和EB病毒核抗原1蛋白探針；所述固相載體為S-S-PEG-COOH化學修飾的金箔晶片，在所述S-S-PEG-COOH上用EDC和NHS活化羧基以固定特異性抗原為探針。
二、本發明同時公開了上述蛋白質晶片的製備方法，包括如下步驟：
步驟1：對金箔晶片進行表面化學修飾，獲得固相載體
以濃度為2mM的DT2的乙醇溶液為修飾液1；將NHS和EDS溶於0.1M的MES緩衝液中作為修飾液2，在所述修飾液2中NHS濃度為50mM、EDC濃度為200mM；
對金箔晶片進行清洗後，浸入所述修飾液1中，黑暗條件下室溫搖蕩孵育3小時，S-S-PEG-COOH通過Au-S鍵組裝到金晶片，二硫鍵使結合穩定性更好；取出後用無水乙醇溶液清洗、氮氣吹乾；DT2修飾的晶片可保存數月。
固化探針前，再以所述修飾液2點樣孵育0.5小時活化(活化的羧基可通過醯胺反應穩定結合蛋白質探針)，取出後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾，獲得固相載體待用；
步驟2：固定EB病毒抗原探針
將衣殼抗原溶於PBST-BSA溶液中，配製濃度不低於50μg/mL的衣殼抗原溶液；
將核抗原1蛋白溶於PBST-BSA溶液中，配製濃度不低於6.25μg/mL的核抗原1蛋白溶液；
將所述衣殼抗原溶液點樣孵育於固相載體的奇數行，將核抗原1蛋白溶液點樣孵育於固相載體的偶數行，室溫孵育2h，使固相載體的奇數行包被EB病毒衣殼抗原探針、偶數行包被EB病毒核抗原1蛋白探針；取出後將晶片浸沒在1M乙醇胺中15分鐘，以封閉剩餘的已活化羧基，進一步有效避免實驗的非特異性吸附；最後再用PBST溶液清洗、氮氣吹乾，即獲得用於EB病毒衣殼抗原和核抗原1蛋白聯合檢測的的蛋白質晶片。
其中：步驟1對金箔晶片進行清洗的方法為：將NH3、H2O2及H2O按體積比1：1：5混合構成TL1清洗液，將金箔晶片浸入盛有TL1清洗液的不鏽鋼清洗盒內，82℃水浴6分鐘，清洗2次，取出之後用超純水衝洗，再用無水乙醇清洗，最後用氮氣吹乾。
三、本發明還進一步公開了上述蛋白質晶片的使用方法，具體為：
將Cy3標記驢抗人IgG抗體溶於PBST-BSA溶液中，構成濃度2.5μg/mL的IgG螢光二抗溶液；將Cy5標記羊抗人IgM抗體和Cy3標記驢抗人IgG抗體共同溶於PBST-BSA溶液中，構成濃度各為2.5μg/mL的IgM+IgG螢光二抗溶液；
將待檢測患者血清稀釋10～80倍，然後分別點樣於所述蛋白質晶片任意一個奇數行的EB病毒衣殼抗原探針和一個偶數行的EB病毒核抗原1蛋白探針上，常溫條件下孵育抗體1小時，取出後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾；
將所述IgM+IgG螢光二抗溶液和所述IgG螢光二抗溶液分別點樣於孵育有抗體的EB病毒衣殼抗原探針和EB病毒核抗原1蛋白探針之上，室溫孵育1小時，然後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾；
若EB病毒衣殼抗原探針處呈現螢光色，則待測患者血清中含有衣殼抗原IgM抗體和/或衣殼抗原IgG抗體，若EB病毒衣殼抗原探針處無螢光色，則待測患者血清中不含有衣殼抗原IgM抗體和衣殼抗原IgG抗體；
若EB病毒核抗原1蛋白探針處呈現螢光色，則待測患者血清中含有核抗原1蛋白IgG抗體，若EB病毒核抗原1蛋白探針處無螢光色，則待測患者血清中不含有核抗原1蛋白IgG抗體；
在使用時，還應同時將抗原抗體全陰性的健康人血清同時點樣於同一蛋白質晶片的其他抗原探針上，作為陰性對照。
四、本發明還進一步公開了一種用於EB病毒衣殼抗原和核抗原1蛋白聯合檢測的試劑盒，其包含有：上述的蛋白質晶片；PBST-BSA溶液；將Cy3標記驢抗人IgG抗體溶於PBST-BSA溶液中，構成的濃度2.5μg/mL的IgG螢光二抗溶液；將Cy5標記羊抗人IgM抗體和Cy3標記驢抗人IgG抗體共同溶於PBST-BSA溶液中，構成的濃度各為2.5μg/mL的IgM+IgG螢光二抗溶液。
上述技術方案中：
所述PBST溶液是由濃度0.01M、pH＝7.4的磷酸緩衝液PBS與Tween 20混合配置而成的，在所述PBST溶液中Tween20的體積濃度為0.1％；
所述PBST-BSA溶液是由濃度0.01M、pH＝7.4的磷酸緩衝液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合構成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的體積濃度為0.1％，胎牛血清BSA的質量濃度為0.1％。
與已有技術相比，本發明的有益效果體現在：
一方面，本發明製備S-S-PEG-COOH新型化學修飾的金箔晶片作為基底。金箔與化學物質的結合與傳統玻璃片和矽片相比更加牢固，並且金箔的生物親和度較低，不易與基因或者蛋白質等物質產生非特異性吸附。S-S-PEG-COOH新型化學修飾利用活化的羧基末端與蛋白質結合，結合穩定且具有高敏感性。
另一方面，本發明具有高通量、聯合檢測三個抗體指標和僅需微量已稀釋血清樣本的顯著優勢。適用於EB病毒感染率高、臨床檢測樣本量大且不止檢測單一抗體的情況。本發明以高靈敏度和特異性(SE/SP)為目標，檢測時間短，簡便易行，可對有疑似EB病毒近期感染的患者進行原發感染的確認和排除。
附圖說明
圖1為原子力顯微鏡掃描化學修飾前後金箔晶片平面表徵；
圖2為EBNA-1抗原在晶片上包被濃度對螢光強度的影響；其中，圖2(a)為不同濃度的EBNA-1抗原在晶片上包被所得螢光掃描圖；圖2(b)為所得螢光強度曲線圖；
圖3為EBV-VCA抗原在晶片上包被濃度對螢光強度的影響；其中，圖3(a)為不同濃度的EBV-VCA抗原在晶片上包被所得螢光掃描圖；圖3(b)為所得螢光強度曲線圖。
圖4為EBNA-1抗體檢測實驗中，血清稀釋度對螢光強度的影響；
圖5為EBV-VCA抗體檢測實驗中，血清稀釋度對螢光強度的影響；
圖6為EBNA-1抗體和EBV-VCA抗體阻斷的特異性實驗；
圖7為生物晶片和CLIA檢測EB病毒抗體結果的相關性；
圖8為組合晶片檢測EB病毒相關疾病。其中，圖8A為IgM抗體掃描結果，圖8B為IgG抗體掃描結果。
具體實施方式
本發明各實施例中所用材料和試劑的來源與準備如下：
1、金箔晶片：
以玻璃片為基底、覆蓋一層0.1μm厚度的純金(純度99.9％)的金箔晶片來自Interactiva公司(德國，烏爾姆)，其上為區域化的50μm的TEFLON膜的陣列(96孔*2，8行*12列)，陣列孔徑為1.25mm。
2、表面化學修飾：
22-(3,5-bis((6-mercaptohexyl)oxy)phenyl)-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxadocosanoic acid(DT2)購自Sensopath(美國)。N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)購自Sigma-Aldrich公司(西班牙)，乙醇胺和2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸一水(MES)緩衝液購自生工(上海，中國)。
以濃度為2mM的DT2的乙醇溶液為修飾液1；將NHS和EDS溶於0.1M的MES緩衝液中作為修飾液2，在所述修飾液2中NHS濃度為50mM、EDC濃度為200mM。
3、抗原、抗體、螢光素類
EBV-VCA天然抗原購自Mybiosource(聖地牙哥，美國)，EBNA-1抗原購自Abcam(USA)。Cy3標記驢抗人IgG抗體購自Sangon公司；Cy5標記羊抗人IgM抗體購自KPL公司；磷酸緩衝液(PBS)、Tween20及胎牛血清(BSA)均購自SIGMA-ALDRICH公司。
4、PBST溶液：
將商品化PBS粉末溶解在去離子水中，形成濃度0.01M、pH＝7.4的磷酸緩衝液PBS；然後加入Tween-20，混勻，獲得PBST溶液，在所述PBST溶液中Tween20的體積濃度為0.1％。
5、PBST-BSA溶液：
配製：取BSA(200mg/mL)溶於PBST溶液中，震蕩，靜置，得PBST-BSA溶液(BSA質量濃度為0.1％)。
6、所用血清樣本
本發明研發中，化學發光免疫分析法(CLIA)被選為參考方法，收集臨床上有CLIA檢測數據的EB病毒抗體的患者血清樣本用於研發，並收集門診CLIA檢測結果陰性樣本作為對照組。此外，收集相關疾病血清：傳染性單核細胞增多症15例、系統性紅斑狼瘡25例、鼻咽癌36例用於篩查。所有血清分裝並儲存在-80℃以保持蛋白活性，避免反覆凍融。
實施例1、分子自組裝單層形成和探針固化
由NH3：H2O2：H2O＝1：1：5的體積比例混合獲得TL1清洗液。將金箔晶片置於盛有TL1清洗液的不鏽鋼清洗盒內，82℃水浴6分鐘，清洗2次，取出之後用超純水衝洗2分鐘，2次，再用無水乙醇清洗2分鐘，2次，之後用氮氣吹乾，置於乾淨密閉晶片盒中，待用
清洗後的金箔晶片浸沒在修飾液1中，在室溫用黑盒搖晃孵育3小時，封口膜封口。S-S-PEG-COOH通過Au-S鍵組裝到金晶片，二硫鍵使結合穩定性更好；取出後用無水乙醇溶液清洗、氮氣吹乾；DT2修飾的晶片可保存數月。
固化探針前，再以修飾液2點樣孵育0.5小時活化(活化的羧基可通過醯胺反應穩定結合蛋白質探針)，取出後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾，獲得固相載體待用。
圖1(a)、(b)為2μm視野下原子力顯微鏡觀察修飾後金箔晶片(即所得固相載體)的表面形貌，圖1(c)、(d)為未修飾金箔晶片(清洗後的金箔晶片)的表面形貌。用Nanoscope分析軟體進行AFM離線數據分析(Rq是軟體中顯示粗糙度的參數)，可知DT2修飾的金表面(Rq＝1.90nm)比未修飾表面粗糙(Rq＝0.922nm)。表明修飾後化學基團共價連接到金表面上，使其更易於蛋白質連接，增加了檢測靈敏度。
實施例2、質控實驗
在下述所有實驗中，以pH為7.4的0.01M PBST-0.1％BSA作為抗原、抗體及血清稀釋的溶劑。晶片在溼盒中室溫孵育，每一步驟結束後，未結合的物質都會被PBST溶液清洗掉，並用氮氣乾燥晶片以便下一步孵育。
1、EBNA-1抗原探針包被濃度質控
為了優化EBNA-1抗原包被濃度，將100-0.097μg/mL梯度稀釋的EBNA-1抗原溶液(共11個濃度)和空白對照PBST-BSA緩衝液分別點樣孵育於實施例1所獲得的固相載體上(每點1μL，每個濃度點樣4個復孔)，室溫孵育2h，使固相載體上包被EBNA-1抗原探針；取出後將晶片浸沒在1M乙醇胺中15分鐘，以封閉剩餘的已活化羧基，進一步有效避免實驗的非特異性吸附；最後再用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。
選擇一例由CLIA測得EBNA-1抗體為466U的臨床血清樣本(≥20U是陽性)按經驗比例1：20稀釋後，依次點樣於EBNA-1抗原探針上，常溫條件下孵育抗體1小時，取出後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。用PBST-BSA緩衝液的平均螢光強度作為背景值。
將2.5μg/mL的Cy3驢抗人IgG螢光二抗溶液點樣與上述孵育有抗體的EBNA-1抗原探針之上，並避光孵育0.5小時，用於捕獲特異性目的檢測抗體產生的螢光信號，取出用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。通過晶片掃描儀LuxscanTM 10K-A(博奧有限公司，中國)對以上蛋白質晶片進行掃描檢測，結果顯示於圖2(a)。圖2(b)是以圖2(a)中每一列同一濃度所得4個螢光強度的平均值為縱坐標、以抗原濃度為橫坐標繪製的螢光強度曲線圖。從圖中可以看出，隨著抗原濃度的降低，螢光值也降低。當EBNA-1抗原孵育濃度在6.25μg/mL以上時，所產生的螢光信號強度與陰性對照組產生的螢光信號強度有明顯的差異。故顯示孵育EBNA-1抗原最優濃度應在6.25μg/mL以上。
2、EBV-VCA抗原探針包被濃度質控
類似的，EBV-VCA抗原優化也被實現。200μg/mL至0.19μg/mL梯度稀釋的EBV-VCA抗原溶液(共11個濃度)和空白對照PBST-BSA緩衝液分別點樣孵育於實施例1所獲得的固相載體上(每點1μL，每個濃度點樣4個復孔)，室溫孵育2h，使固相載體上包被EBV-VCA抗原探針；取出後將晶片浸沒在1M乙醇胺中15分鐘，以封閉剩餘的已活化羧基，進一步有效避免實驗的非特異性吸附；最後再用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。
選擇一例由CLIA測得VCA-IgG抗體為640U的臨床血清樣本(≥20U是陽性)按經驗比例1：20稀釋後，依次點樣於EBV-VCA抗原探針上，常溫條件下孵育抗體1小時，取出後用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。用PBST-BSA緩衝液的平均螢光強度作為背景值。
由於VCA有IgM和IgG抗體兩個檢測指標，Cy3標記的驢抗人IgG抗體和Cy5羊標記的抗人IgM抗體共同溶於PBST-BSA溶液中，配成濃度皆為2.5μg/mL的IgM+IgG螢光二抗溶液用於檢測。
將IgM+IgG螢光二抗溶液點樣與上述孵育有抗體的EBV-VCA抗原探針之上，並避光孵育0.5小時，用於捕獲特異性目的檢測抗體產生的螢光信號，取出用PBST溶液清洗、氮氣吹乾。通過晶片掃描儀LuxscanTM 10K-A(博奧有限公司，中國)對以上蛋白質晶片進行掃描檢測，結果顯示於圖3(a)。圖3(b)是以圖3(a)中每一列同一濃度所得4個螢光強度的平均值為縱坐標、以抗原濃度為橫坐標繪製的螢光強度曲線圖。從圖中可以看出，孵育EBV-VCA抗原最優濃度應在50μg/mL以上。
3、血清稀釋度質控
任意取臨床確診抗體陽性和臨床確診抗體陰性的血清樣本各三例。三例臨床結果陽性血清等量混勻和三例臨床結果陰性血清等量混勻後，分別以不同比例稀釋(1:2.5、1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280和1:2560)，然後點樣到含有核抗原1蛋白探針的晶片和衣殼抗原探針的晶片上，PBST-BSA緩衝液作為空白對照。常溫條件下孵育一小時，然後用PBST清洗氮氣吹乾。避光孵育對應的螢光二抗0.5小時，用於捕獲目的抗體產生的螢光信號，並通過與晶片掃描儀掃描檢測。
圖4和圖5分別是EBNA-1和EBV-VCA實驗的血清稀釋度優化結果。圖中(a)：上面3排是陽性組(任取3例陽性病例)，下面3排是對照組(任取3例陰性對照)；圖中(b)是以病例組螢光平均值與對照組螢光平均值的比值作為縱坐標、以稀釋度作為橫坐標繪製的曲線圖，設定比值大於3的稀釋度可以用於實驗檢測。從圖中可以看出，血清最佳稀釋度應在稀釋10倍到80倍之間。
實施例3、抗體阻斷試驗和晶片特異性
在基於抗原的生物晶片免疫實驗中，用過量抗原飽和血清抗體結合位點進行阻斷的預處理，來檢測抗體結合的特異性。
任意取三例臨床CLIA診斷抗體陽性的EBNA-1抗體血清按質控優化條件混勻稀釋，分裝於5個PCR管。其中四管在孵育前，預先與0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的對應抗原充分反應1小時。餘下一管作陽性對照。
此外，混勻稀釋三例確定抗體陰性的血清作為陰性對照。
EBV-VCA實驗也進行相似處理。
圖6為兩個抗體阻斷的結果，第一列為陰性對照，第二列為陽性對照，後四列為不同濃度抗原block的陽性血清，顯示陽性EBNA-1和EBV-VCA血清可以被相應抗原完全阻斷，特異性抗原為探針的生物晶片對血清抗體的結合檢測是特異性的。
實施例4、生物晶片和CLIA檢測EB病毒結果的相關性
CILA是發展起來的一項最新免疫測定技術，具有高敏感性和特異性，是一個可定量檢測的方法。EBNA-1IgG抗體在3U到600U可以檢測，但超出範圍的檢測結果被描述為「>600U」和「<3U」，且這種情況不在少數。因此本實施例隨機選擇四例EBNA-1陽性抗體、臨床CLIA檢測值分別為244U、321U、373U與433U的血清，分別梯度稀釋(單位U，從1：2.5計算)以分析晶片檢測與CLIA檢測結果的相關性。
相對U值和對應螢光值的散點圖及相關結果顯示於圖7，由圖7A可以看出，幾乎任一例樣本在1:80(3～5U)處可檢測到可見螢光。由生物晶片檢測的螢光值與由CLIA檢測的U值有較好的相關係數，R2＝0.83(圖7B)。
實施例5：組合晶片檢測EB病毒相關疾病
在同一張晶片上，以收集的15例傳染性單核細胞增多症(IM)、25例系統性紅斑狼瘡(SLE)、36例鼻咽癌(NPC)EB相關疾病血清樣本為檢測對象，同時篩查VCA IgM/IgG和EBNA-1IgG三個抗體指標。
在晶片第1、3、5、7行包被EB病毒衣殼抗原探針，2、4、6、8行包被EB病毒核抗原1蛋白探針。不同EB病毒血清模式的樣本同時檢測，按比例稀釋後每一例分別孵育上下兩孔。臨床CLIA診斷陰性抗體結果的血清用作陰性對照，PBST-BSA緩衝液用作空白對照。清洗乾燥後，第1、3、5、7行避光孵育2.5μg/mL的抗人IgG+IgM螢光二抗0.5小時，第2、4、6、8行避光孵育2.5μg/mL的的Cy3驢抗人IgG螢光二抗0.5小時，用於捕獲的特異性目的抗體產生的螢光信號，並通過與晶片掃描儀掃描檢測，結果顯示於圖8。