採用花生粕同步酶解發酵生產高濃度d-乳酸的方法及其專用培養基的製作方法

2023-05-12 14:14:36 4

專利名稱：採用花生粕同步酶解發酵生產高濃度d-乳酸的方法及其專用培養基的製作方法
技術領域：
本發明屬於發酵工程技術領域，特別是涉及一種採用花生粕同步酶解發酵生產高 濃度D-乳酸的方法及其專用培養基。
背景技術：
乳酸(lacticacid)，學名為 α-羥基丙酸(d-hydroxy-propionic acid)，乳酸的 化學分子式子為C2H5OCOOH,是一種簡單的羥基酸。乳酸分子中有一個不對稱的碳原子，因此 乳酸具有旋光性。L-乳酸為左旋性，D-乳酸為右旋性，DL-乳酸為消旋性。近年來，乳酸的 衍生物聚乳酸引起了人們廣泛關注，其物理性能與聚苯乙烯非常相似，它除了具有以石油 化學品為原料的塑料材料的優異特性外，還有最大的特點是生物可降解性，即在自然界中 可自然降解，不造成環境汙染，解決了為世界環保所困擾的白色汙染問題。但是純聚L-乳 酸(PLLA)的許多性能不穩定，而加入適當比例的聚D-乳酸進行聚合，可以提高性能，拓寬 了聚乳酸的應用範圍。D-乳酸作為一個手性中心，是合成多種手性物質的前體，在低毒農 藥、除草劑和化妝品等領域的手性物質合成中具有重要的應用。丁子建等(丁子建等，生物加工過程，第2卷，第3期，30-36頁，2004)首次報導了 採用芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus sp.)從葡萄糖發酵製備D-乳酸，發酵72小時可 產40. 7克/升的D-乳酸，葡萄糖轉化率67. 8%。中國專利CN200610097453. 6公開了一 種組合發酵生產D-乳酸的工藝，產酸7. 5% 13. 1%。中國專利CN 200710176056. 2報導 了利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)半連續發酵生產D-乳酸，該發明 方法獲得的D-乳酸的濃度最高可達162克/升。中國專利CN200810098908. 5報導了芽 孢乳桿菌Sporolactobacillus sp. Y2-8菌株及其發酵生產D-乳酸的工藝，發酵液中D-乳 酸含量達9. 16. 5%，D-乳酸光學純度達99. 1%。中國專利CN200810116194. 6報 道了植物乳桿菌生產D-乳酸，發酵液中總乳酸濃度為18%，D-乳酸光學純度84 86%。 目前報導的發酵法生產L-乳酸濃度可達190克/升，光學純度可達99%以上(中國專利 CN200710176060. 9)。與L-乳酸相比，發酵法生產D-乳酸的濃度和光學純度還需要進一步 提尚。由於乳酸發酵生產通常採用酵母抽提物作為氮源，在一定程度上提高了乳酸的生 產成本。針對這一問題，目前國內有採用較為廉價的玉米漿、豆粕水解液等作為氮源替代酵 母抽提物。豆粕等廉價大分子蛋白通常不能直接用作乳酸發酵的氮源，而需經過酸解等預 處理，使大分子蛋白分解為短肽和胺基酸等小分子，以利於乳酸生產菌株的利用。酸解過程 不僅需要耐酸的設備，還需要在較高溫度下進行，消耗大量能量。同時高溫和酸性環境對氨 基酸等營養物質有一定的破壞作用。蛋白酶能夠將大分子蛋白降解為小分子肽和胺基酸。 與酸解過程相比，酶解過程條件更加溫和，有利於保存蛋白水解液中的有效成分。通常情況 下，作為發酵氮源的蛋白水解預處理過程與發酵過程分離，水解過程需要單獨的場地、設備 和操作，增加了整個發酵生產過程的設備投入和操作複雜程度。如果能將蛋白水解過程與
3發酵過程相整合，使蛋白酶解和乳酸發酵同時在發酵罐中進行，就能夠省去單獨的蛋白酶 解操作，從而節省場地和設備投資，有利於降低D-乳酸生產成本。花生粕是從花生仁經壓榨提煉油料後的產品，富含植物蛋白。我國花生的分布非 常廣泛，在世界上我國花生產量位居前列。花生粕作為另一種分布廣泛、高產量、含氮量豐 富的廉價氮源，還沒有用於D-乳酸發酵生產的報導。

發明內容
本發明提供了利用花生粕同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸的專用培養基。本發明所提供的專用培養基，是以花生粕作為有機氮源的發酵培養基。在所述專用培養基中還添加有蛋白酶，以將花生粕中的蛋白酶解為小分子肽和氨 基酸，並使花生粕酶解過程與發酵生產D-乳酸同步進行。具體來講，所述專用培養基包括工業葡萄糖135 150克/升，花生粕20 40 克/升，中性蛋白酶或風味蛋白酶或複合蛋白酶0 0. 5克/升，餘量為水；所述培養基的 pH 為 5. 5 6. 5。所述專用培養基中還可添加有PH調節劑，優選為碳酸鈣，其在發酵培養基中含量 為70士2克/升。本發明的第二個目的是提供一種操作簡便、純度較高的利用花生粕同步酶解發酵 生產高濃度D-乳酸的方法。本發明所提供的高濃度D-乳酸的生產方法，是將菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185 接種到上述發酵培養基中進行發 酵，得到高濃度D-乳酸。在上述採用花生粕同步酶解發酵生產D-乳酸的方法中，所述接種量為5 10 %體 積比；發酵條件為37 47°C培養42 70小時；優選為42°C培養48小時。在發酵培養進行到30 36小時，葡萄糖濃度降至約50克/升，還需補加葡萄糖， 使發酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。為提高發酵效率，所述發酵過程採用間歇攪拌，三角瓶中發酵，每隔8 12小時振 動攪拌一次；發酵罐中發酵，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉數優選為100
轉/分鐘。此外，為獲得更好的發酵效果，在上述發酵方法實施前，所述菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185菌種在發酵前還需進行斜面培養和
種子培養。所述斜面培養，是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASDCGMCC No. 2185接入斜面培養基中，在37 47°C下培養48 72小時；所述斜面培養基配方為葡 萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升，溶劑為水，所述斜面培 養基的PH為6. 5，初始pH為6 7。所述種子培養，是將經斜面培養的菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC No. 2185 再接入種子培養基中，在 37 47V 下培養30 36小時；所述種子培養基配方為所述種子培養基配方為葡萄糖40克/升， 酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，餘量為水；所述種子培養基pH為6 7。
用上述方法獲得的高濃度D-乳酸以及花生粕在同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸 中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明首次實現了將花生粕作為廉價氮源同步酶解發酵生產D-乳酸，本發明方 法與現有技術相比具有如下優點1.發酵培養基成分簡單，所選氮源花生粕為生產花生油的副產物，價格低廉，資源 豐富，大大降低了生產成本。2.酶解花生粕和發酵生產乳酸同時進行，省去了有機氮源預處理的步驟，有效的 節省了場地佔用和設備投入。3.採用本發明方法，可以顯著提高D-乳酸的產量，與目前報導(中國專利 CN200810116194.6報導發酵液中乳酸濃度為180克/升)相比，D-乳酸產量有了明顯的提 高，可達200克/升以上，糖酸轉化率達到98. 5% ( 丁子建等報導採用芽孢乳桿菌發酵製備 D-乳酸，糖酸轉化率67. 8% )，光學純度達到99. 3%0綜上所述，本發明高濃度D-乳酸的生產方法明顯優於現有的高濃度D-乳酸生產 方法，具有純度高、生產效率高、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，適合大面積推廣和 應用。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
具體實施例方式本發明所使用的菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD來源於 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯 路，中國科學院微生物研究所)，申請人先前已經保藏，保藏登記號為CGMCC No. 2185 ；該菌 株已在申請人發表的論文和申請的專利中公開。本發明發酵培養基中所使用的工業葡萄糖購自淄博虹宇工業糖有限公司，花生粕 購自北京康明威培養基技術有限責任公司，中性蛋白酶購自北京諾維信生物技術有限公司 (5萬活力單位/克，滅菌後添加)，風味蛋白酶購自北京諾維信生物技術有限公司(2萬活 力單位/克，滅菌後添加)，複合蛋白酶購自北京諾維信生物技術有限公司(2萬活力單位/ 克，滅菌後添加)。本發明所述利用花生粕同步酶解發酵生產D-乳酸的基本步驟如下(1)斜面培養將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No. 2185接入斜面培養基，將斜面放置在培養箱中培養，培養溫度37 47°C，培養時間 48 72小時，斜面培養基的初始pH值為6 7。(2)種子培養將培養好的菌種轉入種子培養基，在培養箱中進行靜置培養，培養 溫度37 47V，培養時間30 36小時，種子培養基初始pH值為6 7。(3)發酵培養以5 10%體積比的接種量，將培養好的種子液轉入發酵培養基進 行發酵培養。發酵溫度37 47°C，發酵時間42 70小時，發酵罐中發酵過程中可進行間 歇性攪拌，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉數優選100轉/分鐘。三角瓶 中發酵每隔8 12小時振動攪拌一次。(4)發酵罐葡萄糖補料上述步驟(3)中發酵培養進行到30 36小時，葡萄糖濃 度降至約50克/升，補加葡萄糖，使發酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。
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(5)樣品測定取發酵液以6，000轉/分鐘的速度離心5分鐘，取上清液稀釋適 當倍數，檢測葡萄糖含量，D-乳酸含量和L-乳酸含量。葡萄糖濃度用生物傳感分析儀 SBA-40C(山東省科學院生物研究所)測定。L-乳酸和D-乳酸含量採用Agilent 1100液 相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定，手性分離柱(日本三菱化學公司，MCI GEL-CRS10 W(3 μ ) 4. 6IDX 50mm,光學異體分離用)，0. 002mol/L硫酸銅為流動相，流量0. 5mL/min,進 樣量20 μ L，紫外檢測器，檢測波長254nm，操作溫度25°C。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich 公司產品，貨號為L0625，L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。在該 色譜條件下，D-乳酸標準品的保留時間為9. 724分鐘。D-乳酸光學純度計算方法D-乳酸光學純度(％) = (D-乳酸濃度(克/ 升)+ [D-乳酸濃度(克 / 升)+L-乳酸濃度(克 / 升)])X 100 % [Bioresource Technology 101(2010)6494 6498]糖酸轉化率計算方法轉化率(％ ) = (D-乳酸濃度(克/升)+葡萄糖消耗量 (克/升))X100%下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。其目的是為了更好的理解本 發明的內容，因此，所舉例的實例並不限制本發明的保護範圍。實施例1 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在37°C下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發酵時間42小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升， 溶劑為水，所述斜面培養基的PH為6. 5，121°C滅菌20分鐘。種子培養基葡萄糖40克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，溶劑為水，所述 種子培養基的PH為6. 5，121°C滅菌20分鐘。發酵培養基工業葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0. 1克/升， 碳酸鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No 2185接種於斜面培養基上，42°C培養72小時；(2)種子培養將步驟(1)培養的菌株在無菌條件下用接種環接2環於裝有30mL 種子培養基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養36小時，然後以10%體積比的接種量接種到 新的種子培養基中，42°C靜止培養36小時，即活化種子一次，製得種子培養液；(3)發酵培養將上述種子培養基以10%體積比的接種量接種到發酵培養基 (50mL發酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在37°C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養 42小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。 D-乳酸含量112 士 3克/升，葡萄糖含量20 士 1克/升，糖酸轉化率97.4%，D-乳酸光學純 度達到99. 2%。實施例2 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在42°C下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發酵時間42小時。
本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養將上述種子培養基以10%體積比的接種量接種到發酵培養基 (50mL發酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在42°C靜置培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養 42小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。 D-乳酸含量129士2克/升，葡萄糖含量0. 3士0. 2克/升，糖酸轉化率96. 0%，D-乳酸光 學純度達到99. 1%。實施例3 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在47°C下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發酵時間42小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基、種子培養基和發酵培養基同實施例1。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養將上述種子培養基以10%體積比的接種量接種到發酵培養基 (50mL發酵液/IOOmL三角瓶)中，放置在47°C靜置培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養 42小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複。 D-乳酸含量128士2克/升，葡萄糖含量3. 7士0. 6克/升，糖酸轉化率97. 5%，D-乳酸光 學純度達到99.3%。實施例4 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在20克/升花生粕濃度下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發 酵溫度42 °C，發酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例1 ；發酵培養基花生粕濃度為20克/升，同時添加工業葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養將上述種子培養基以10%體積比的接種量接種到發酵培養基 (50mL發酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜置培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時，結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複， 結果表明，D-乳酸含量102. 0士4克/升，葡萄糖含量30士2克/升，糖酸轉化率97. 0%， D-乳酸光學純度達到99. 4%。實施例5 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在30克/升花生粕濃度下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發 酵溫度42 °C，發酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例1。發酵培養基花生粕濃度為30克/升，同時添加工業葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養同實施例4。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複，結 果表明，D-乳酸含量128士5克/升，葡萄糖含量3士0. 5克/升，糖酸轉化率96. 5%,D-乳 酸光學純度達到99. 2%。實施例6 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在40克/升花生粕濃度下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，發 酵溫度42 °C，發酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例1。發酵培養基花生粕濃度為40克/升，同時添加工業葡萄糖135克/升，中性蛋白 酶0. 5克/升，碳酸鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養同實施例4。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複， 結果表明，D-乳酸含量129士5克/升，葡萄糖含量4士3克/升，糖酸轉化率97. 8%，光學 純度達到99. 2%。實施例7 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185添加不同種類的蛋白酶發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角瓶，溫度
842°C靜置發酵60小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例1。發酵培養基設計3種培養基，分別添加中性蛋白酶0. 5克/升，風味蛋白酶0. 5 克/升，複合蛋白酶0. 5克/升，同時添加工業葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸 鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養將上述種子培養基以5%體積比的接種量接種到發酵培養基(50mL 發酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜置培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養60小時，結束 發酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複， 結果表明，添加風味蛋白酶，複合蛋白酶，中性蛋白酶的培養基分別產D-乳酸108士 1克/ 升，112士 1克/升，129士3克/升，糖酸轉化率最高達98. 0%，D-乳酸光學純度最高達到 99. 2%。實施例8 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCCNo. 2185在不添加中性蛋白酶的情況下發酵生產D-乳酸，50mL發酵液/IOOmL三角 瓶，溫度42 V，發酵時間48小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下斜面培養基和種子培養基同實施例1。發酵培養基工業葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸鈣70克/升，餘量為 水，所述發酵培養基的PH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養同實施例1 ；(3)發酵培養將上述種子培養基以10%體積比的接種量接種到發酵培養基 (50mL發酵液/IOOmL三角瓶)中，42°C靜止培養，每隔12小時振蕩攪拌一次，培養48小時 結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵結束後 發酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率、D-乳酸光學純度。該實驗共設3次重複， 結果表明，D-乳酸含量58士3克/升，葡萄糖含量75士3克/升，糖酸轉化率96. 6%，D_乳 酸的光學純度99.3%。實施例9 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo. 2185在5升全自動發酵罐中發酵生產D-乳酸，發酵溫度42 V，發酵時間66小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下(1)斜面培養基同實施例1 ；(2)種子培養基同實施例1 ；
(3)發酵培養基工業葡萄糖150克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0. 5克/ 升，碳酸鈣70克/升，餘量為水，所述發酵培養基的pH為6. 5，115°C滅菌20分鐘。再配製 糖母液和碳酸鈣粉末，115°C滅菌20分鐘。該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養將步驟1培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環於裝有30mL種 子培養基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養36小時，然後將30mL種子培養液接種到300mL 新的種子培養基中，42°C靜置培養36小時，製得種子培養液；(3)發酵培養將300mL步驟⑵製得的種子培養液在無菌條件下接入裝有3. 7 升發酵培養基的5升全自動發酵罐(上海保興BIOTECH)中，42°C靜置培養，每隔6小時攪 拌一次，每次以100轉/分的轉速攪拌5分鐘，培養30小時，此時發酵液中葡萄糖濃度約為 50克/升，補加葡萄糖280克，補加碳酸鈣160克，使發酵液中葡萄糖濃度達到120 130 克/升。66小時結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵液中 D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率和D-乳酸光學純度。結果表明D-乳酸含量205士3 克/升，葡萄糖含量1. 0士0. 6克/升，糖酸轉化率98. 5%，D-乳酸的光學純度99. 3%。實施例10 利用菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No 2185在50升全自動發酵罐中發酵生產D-乳酸，發酵溫度42V，發酵時間70小時。本實施例中所使用的各培養基的組成如下(1)斜面培養基同實施例1 ；(2)種子培養基同實施例1 ；(3)發酵培養基同實施例9 ；該發酵生產D-乳酸的方法包括以下步驟(1)斜面培養同實施例1 ；(2)種子培養將步驟1培養的菌株，在無菌條件下用接種環接2環於裝有30mL種 子培養基的IOOmL三角瓶中，42°C靜置培養36小時，然後將30mL種子培養液接種到300mL 新的種子培養基中，42°C靜置培養36小時，然後將300mL種子培養液接種到3000mL新的種 子培養基中，42°C靜置培養36小時，製得種子培養液；(3)發酵培養將3000mL步驟2製得的種子培養液在無菌條件下接入裝有37升 發酵培養基的50升全自動發酵罐(上海保興BIOTECH)中，42°C靜置培養，每隔8小時攪拌 一次，每次以100轉/分的轉速攪拌5分鐘，培養36小時，此時發酵液中葡萄糖濃度約為50 克/升，補加葡萄糖2800克和1600克碳酸鈣，使發酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/ 升。70小時結束髮酵。發酵結束後，根據上述具體實施方式
中所述的檢測和計算方法，檢測發酵液中 D-乳酸含量、葡萄糖含量，計算轉化率和D-乳酸光學純度。結果表明D-乳酸含量203士3 克/升，葡萄糖含量2士 1克/升，糖酸轉化率97.8%，D-乳酸的光學純度99. 2%。
權利要求
利用花生粕同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸的專用培養基，是以花生粕作為有機氮源的發酵培養基。
2.根據權利要求1所述的專用培養基，其特徵在於所述培養基中還添加有蛋白酶。
3.根據權利要求2所述的專用培養基，其特徵在於所述培養基包括工業葡萄糖 135 150克/升，花生粕20 40克/升，中性蛋白酶或風味蛋白酶或複合蛋白酶0 0. 5 克/升，餘量為水；所述培養基的pH為5. 5 6. 5。
4.根據權利要求1或2或3所述的專用培養基，其特徵在於所述培養基中還添加有 PH調節劑，優選為碳酸鈣，其在發酵培養基中含量為70士2克/升。
5.一種利用花生粕同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸的方法，是將菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus) CASD CGMCC No. 2185 接種到權利 1-4 任一項所述的專用 培養基中進行發酵，得到高濃度D-乳酸。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述接種量為5 10%體積比；所述發酵 條件為37 47°C培養42 70小時；優選為42°C培養48小時。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於在發酵培養進行到30 36小時，葡萄糖 濃度降至約50克/升，還需補加葡萄糖，使發酵液中葡萄糖濃度達到120 130克/升。
8.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述發酵過程採用間歇攪拌，三角瓶中發 酵，每隔8 12小時振動攪拌一次；發酵罐中發酵，每6 8小時攪拌一次，每次攪拌5 10分鐘，轉數優選為100轉/分鐘。
9.根據權利要求5-8任一項所述的方法，其特徵在於所述菊糖芽孢乳桿菌 (Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No. 2185 菌種在發酵前還需進行斜面培養 和種子培養；所述斜面培養，是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC No. 2185接入斜面培養基中，在37 47°C下培養48 72小時；所述斜面培養基配 方為葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸鈣1克/升，瓊脂20克/升，溶劑為水，所述 斜面培養基的PH為6. 5，初始pH為6 7 ；所述種子培養，是將經斜面培養的菊糖芽孢乳 桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No. 2185 再接入種子培養基中，在 37 47°C下培養30 36小時；所述種子培養基配方為所述種子培養基配方為葡萄糖40克/ 升，酵母粉5克/升，碳酸鈣3克/升，餘量為水；所述種子培養基pH為6 7。
10.花生粕在同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種採用花生粕同步酶解發酵生產高濃度D-乳酸的方法及其專用培養基。所述專用培養基是以花生粕作為有機氮源的發酵培養基。此外，所述專用培養基中還添加有蛋白酶。所述高濃度D-乳酸的生產方法是將菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185接種到所述專用培養基中進行發酵，得到高濃度D-乳酸。本發明高濃度D-乳酸的生產方法明顯優於現有的高濃度D-乳酸生產方法，具有純度高、生產效率高、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，適合大面積推廣和應用。
文檔編號C12R1/01GK101886095SQ201010208148
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者唐鴻志, 李峰嵩, 李慶剛, 王麗敏, 許平, 趙博, 馬延和, 馬翠卿 申請人:天津工業生物技術研究所