從產朊假絲酵母細胞和蓖麻子獲得的糖綴合物的製作方法

2023-05-13 02:21:46 1

專利名稱：從產朊假絲酵母細胞和蓖麻子獲得的糖綴合物的製作方法
近幾年，對於免疫系統功能和調節機制的不斷增加的認識已提高了出於治療目的調製其功能的可能性。
能夠調製一些免疫機制的不同來源的天然與合成物質的非常多樣性部分是由於存在能夠識別非生物體自身的外來物質的巨大可能性。在(GH Werner，P Folles「免疫刺激劑下一個是什麼？。它們目前和潛在醫療應用的綜述。」Eur.J.Biochem 242，1-19(1996))中描述了一些最近開發的產物及它們可能的治療應用。
在各種內源性介質當中，有一種使得人們面臨最重要的治療挑戰之一，這就是腫瘤壞死因子(TNF)。該分子表現出一些特殊的獨特特徵(R Ksontini，SLD MacKay，LL Moldawer「腫瘤壞死因子α的作用和對手術損傷和炎症反應的回顧」Arch.Surg.133，558-567(1998).JL Alonso「La compleja fisiologia del factor denecrosis tumoral.」Inmunologia 8，(3)73-94(1989)；T.Calandra「Importance des cytokines dans les syndromesseptiques.」Med.Hyg.49，609-614(1991)；A Eigler，B.Sinha，G Hartman，S Endres「Taming TNF抑制該促炎性細胞因子的方法」Immunology Today 18，487-492(1997)；R González-Amaro，C Garcia-Monzón，L Garcia-Buey，R Moreno-Otero，JLAlonso，E Yague，JP Pivel，M Lopez-Cabrera，E Fernández-Ruiz，F Sanchez-Madrid「在慢性病毒性肝炎中誘導人肝細胞產生腫瘤壞死因子α」J.Exp.Med 179，841-848(1994).)腫瘤壞死因子(TNF)是多向性細胞因子，有大量細胞可產生反應。TNF通常是由單核細胞產生的，其表現出兩種活性形式，一種結合在分泌性細胞膜上，另一種游離形式是腫瘤壞死因子或TACE的轉化酶，它們衍生自金屬蛋白酶對前者的加工。
還有人在文獻中提出，除了單核細胞以外的其它細胞也參與TNFα的合成，例如例如淋巴細胞(AG Santis，MR Campanero，JLAlonso，F Sanchez-Madrid「在淋巴細胞中通過CD2激活途徑調節腫瘤壞死因子(TNF)-α合成和TNF受體表達.」Eur.J.Immunol.22，3155-3160(1992)；AG Santis，MR Campanero，JL Alonso，ATugores，MA Alonso，E Yague，JP Pivel，F Sánchez-Madrid「在T淋巴細胞中經由AIM/CD69激活途徑誘導腫瘤壞死因子-α的生成」Eur.J.Immunol 22，1253-1259(1992).)和NK細胞(I Melero，MA Balboa，JL Alonso，E Yague，JP Pivel，F Sánchez-Madrid，M Lopez-Botet「在天然殺死細胞中經由LFA-1白細胞整合蛋白的信號傳導積極地調控細胞間粘著和腫瘤壞死因子-α的產生」Eur.J.Immunol.23，1859-1865(1993).)。
有一些誘導TNF產生的分子，例如細菌內毒素或脂多糖(LPS)，源自細菌、病毒或上細胞的超級抗原，和甚至其它細胞因子。
類似於其它細胞因子，TNF以毫微摩爾至毫微微摩爾濃度的順序，以非酶促方式在分泌細胞自身(自分泌活性)水平上、在相鄰細胞(並列分泌活性)上、以及在鄰近組織(旁分泌活性)或遠距離組織(內分泌活性)上起作用。這意味著該分子的活性以及其它細胞因子的活性受受體細胞的「位置」以及其與細胞外基質的相互作用的影響非常大。
因此，在各種情況下，已發現循環的TNF不總是基本參數，因為雖然其可能是正常的，但是該細胞因子可能有非常高的局部水平。
已經在不同細胞類型中描述了兩種受體，即TNF受體p55(TNFRp55)和75(TNFR p75)。
這些受體與游離或結合的THF的相互作用產生了各種各樣的反應譜，這些反應可分成三大組一方面，炎性級聯的激活證明TNF屬於一組與此有關的蛋白，其中有IL1、IL6、GM-CSF等。另一方面，激活細胞介導的抗致病攻擊、尤其是抗細胞內病原體引起的攻擊反應。在第三個方面，細胞程序死亡或編程性細胞死亡，特別是在腫瘤細胞中表現出的細胞程序死亡。此外，在細胞程序死亡反應中，TNF表現出了雙重反應，這是因為一方面TNF對NFkB轉錄因子的激活可在急性感染期間保護一些細胞群體不死亡，而另一方面TNF的過度產生可導致細胞程序死亡。作為前者的後果，TNF參與到各種病理過程中。其局部和/或系統過度產生與許多病理過程的爆發和不良進展之間的關係得到了充分證明(R Ksontini，SLD MacKay，LL Moldawer「腫瘤壞死因子α的作用以及對手術損傷與炎症反應的回顧」Arch.Surg.133，558-567(1998).JL Alonso「La compleja fisiologia delfactor de necrosis tumoral.」Inmunologia 8，(3)73-94(1989)；T.Calandra「Importance des cytokines dans lessyndromes septiques.」Med.Hyg.49，609-614(1991)；AEigler，B Sinha，G Hartman，S Endres「Taming TNF抑制該促炎性細胞因子的方法。」Immunology Today 18，487-492(1997).RGonzalez-Amaro，C Garcia-Monzon，L Garcia-Buey，R Moreno-Otero，JL Alonso，E Yague，JP Pivel，M Lopez-Cabrera，EFernandez-Ruiz，F Sanchez-Madrid「在慢性病毒性肝炎中誘導人肝細胞產生腫瘤壞死因子α」J.Exp.Med 179，841-848(1994).)。各種類型細胞產生TNF還有助於該細胞因子在多種病理狀態的發展中起作用，所述病理狀態包括例如與宿主移植反應有關的皮膚和腸損傷(PF Piguet，GE Grau，B Allet，P Vassalli.「腫瘤壞死因子/惡液質素是GRAFT-VS-HOST疾病急性期皮膚和腸損傷的影響因素」J.Exp.Med.166，1280-1289(1987).)、肺炎(CE Reed.「高敏感性肺炎和吸入內毒素所致的職業性肺病」Immunology andAllergy Clinics of North America.12 N°4(1992))或神經疾患(SW Barger「腫瘤壞死因子.好、壞和陰影。」NeuroprotectiveSignal Transduction.M.P.Mattson Humana，Press Inc.Totowa NJ.編寫)、肺疾病、慢性疾患(例如腸炎性疾病和類風溼性關節炎)以及膿毒症。該細胞因子還在兩種具有高發病率的疾患中起著非常重要的作用哮喘和慢性堵塞性肺病(P.Norman「肺病.疾趨向和市場機會」Financial Times Pharmaceuticals ManagementReports(1999))。
該背景信息給根據TNF在多種病理狀態中的控制來設計有效治療帶來了困難。
設計新的藥物需要建立和詳細說明能再現處於爭論中的疾病最重要方面的實驗藥理模型。在尋找能控制TNF生成的藥物的過程中，最有用的模型之一是通過細菌內毒素(LPS)系統誘導TNF的鼠模型。其它廣泛使用的模型是其中研究體外刺激屬於粒細胞巨噬細胞系的細胞以生成所述細胞因子的模型。
從科學的角度來看，一個最突出的方面是產品的很大化學多樣性，這些產品在各種體內和體外實驗模型中與控制TNF過度生成的能力相一致。在這些產品當中，可提及的有抗氧化劑(N Satomi，ASakurai，R Haranaka，K Haranaka。「幾種化學物質抗重組人腫瘤壞死因子的致死性的預防作用。」Journal of BiologicalResponse Modifiers.7，54-64(1988).)、大麻生物鹼(RGallily，A Yamin，Y Waksmann，H Ovadia，J Weidenfeld，ABar-Joseph，A Biegon，R Mechoulanm，E Shohami.「Dexanabinol(HU-211)，一種非精神病治療性大麻生物鹼抗膿毒性休克和抑制腫瘤壞死因子-α及一氧化氮生成的保護作用」The Journalof Pharmacol.and Experimental Therapeut.283，918-924(1997).)、ILI0(SR Smith，C Terminelli，G Denhardt，SNarula，G Jeanette Thorbecke「施用白介素-10和the Time ofPriming保護小棒桿菌致敏的小鼠抗LPS-和TNF-α-誘導的死亡。」Cellular Immunology 173，207-214(1996).)、沙利度胺(ALMoreira，J Wang，EN Sarno，G Kaplan.「沙利度胺保護小鼠抗LPS誘導的休克。」Brazilian Journal of Medical andBiological Research 301199-1207(1997).SM McHugh，TLRowland「沙利度胺和衍生物腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抑制的免疫研究提出能選擇性地進行基因調控的藥物。」Clin Exp.Immunol 110151-154(1997).JD Klausner，VH Freedman，G Kaplan「沙利度胺用作抗TNF-α抑制劑與臨床應用有關。」Clinical Immunologyand Immunopathology.81，219-223(1996).)、氯丙嗪(M.Gadina，R.Bertini，M.Mengozzi，M.Zandalasini，A.Mantovani and P.Ghezzi.「在內毒素性休克糖皮質激素敏感性和糖皮質激素抗性模型中氯丙嗪對內毒素的毒性和TNF生成的保護作用。」J.Exp.Med.273，1305-1310(1991).)、苄達明(A.Guglielmotti，L.Aquilin，M.T.Rosignoli，C.Landolfi，L.Soido，I.Coletta和M.Pinza「在內毒素血症小鼠模型中苄達明的保護作用。」Inflamm.Resp.46，332-335(1997).)、硫酸肼(R.Silverstein，B.R.Turley，C.A.Christoffersen，D.C.Johnson和D.C.Morrison「硫酸肼保護D-半乳糖胺致敏的小鼠抗內毒素和腫瘤壞死因子/惡液質素的致死性腦垂體作用的證據.」J.Exp.Med.173，357-365(1991).)以及天然提取物(H.Ueda和M.Yanazaki「口服施用紫蘇葉提取物抑制腫瘤壞死因子-α的生成。」Biosci.Biotech.Biochem.61，1292-1295(1997).)。
同樣，已經在患有已知TNF在其發展中起作用的疾病的患者的臨床模型中，在體外用分離的外周血液的單核細胞研究了多種活性成分在調節TNF生成方面的作用。在這些活性物質當中，可提及的有ciplofloxacina(S Bailly，M Fay，B Ferrua，MA Gougerot-Pocidalo「體內Ciprofloxacin治療增加脂多糖體外刺激的人單核細胞產生IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α的能力.」Clin.Exp.Immunol.85，331-334(1991).)、rolipram(J Semmler，H Wachtel，SEndres「特異型IV磷酸二酯酶抑制劑rolipram抑制人單核細胞產生腫瘤壞死因子-α」Int.J.lmmunopharmac.15，409-413(1993).)、維納啉酮(T Kambayashi，N Mazurek，ChO Jacob，NWei，M Fong和G Strassmann.「作為巨噬細胞TNF-α選擇性抑制劑的維納啉酮的釋放」Int.J.Immunopharmac.18，371-378(1996).)、前列腺環素類似物(A Jorres，H Dinter，N Topley，GM Gahl，U Frei，P Scholz.「前列腺環素類似物伊洛前列抑制內毒素刺激的人單核白細胞中腫瘤壞死因子的生成細胞機制。」Cytokine 9，119-125(1997).)、己酮可可鹼(BJ Dezube，MLSherman，JL Fridovich-Keil，J Allen-TiRyan，A B Pardee.「在癌症患者中己酮可可鹼下調腫瘤壞死因子的表達一項引導性研究。」Cancer Immunol Immunother 3657-60(1993).)。就其已知的與TNF基因抑制的關係而言需要提及的一個特殊實例是腎上腺皮質激素，(S Abe，T Yamamoto，S lihara，M Yamazaki，D Mizuno.「糖皮質激素的可能作用腫瘤壞死因子細胞毒害活性的內在抑制劑。」Jpn.J.Cancer Res.(Gann)79305-308(1988).J Han，PThompson，B.Beutler「地塞米松和己酮可可鹼在信號傳導路徑的獨立位點抑制內毒素誘導的惡液質素/腫瘤壞死因子合成」J.Exp.Med.172，391-394(1990).IMH Debets，TJM Ruers，MPMH VanDer Linden，CJ Van den Linder，WA Buurman.「皮質類固醇抑制單核細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)的作用取決於誘導TNF合成的刺激。」Clin Exp.Immunol.78224-229(1989).)。值得提及的是，細胞因子水平的調節已經作為新藥設計的「靶」被提及過(KCooper，H Masamune「作為藥物化學靶的細胞因子調節。」AnnualReports in Medicinal Chemistry-27，Chapter 22.)。為了治療膿毒病以及潰瘍性結腸炎和類風溼性關節炎，控制該細胞因子作用的其它嘗試涉及單克隆抗TNF抗體(A Trilla，P Alonso「Anticuerpos monoclonales en el tratamiento del shockseptico.」Med.Clin.99778-780(1992).JG Sinkovics「治療內毒素性休克的單克隆抗體」Acta Microbiologica Hungarica37(1990).SB Porter「抗-TNF臨床試驗的目前狀況」Chest 1126(1997).JR O』Dell「抗細胞因子治療。治療類風溼性關節炎的新時代」New Eng.J.Med.340，310-312(1999).RA vanHogenzand，HW Verspaget「抗腫瘤壞死因子-α產品在節段性迴腸炎治療中的前景」Drugs 56，299-305(1998).F Mackay，JLBrowning，P Lawton，SA Shah，M Comiskey，AK Bhan，EMizoguchi，C Terhorst，SJ Simpson「淋巴毒素和腫瘤壞死因子途徑都涉及結腸炎的實驗鼠模型」Gastroenterology 115，1464-1475(1998))。此外，儘管對該細胞因子、包括其分子生物學有了充分認識，但是並沒有開發出能安全有效地控制其過度生成的治療劑。
對所有這些可能的治療選擇所作的關鍵分析表明，例如就單克隆抗TNF而言，對於急性疾病沒有有效的單克隆抗TNF，並且單克隆抗TNF在其對細胞因子的親和力方面表現出很大的變化性，儘管後來據報導對類風溼性關節炎和潰瘍性結腸炎有一些成功的實例(JRO』Dell「抗細胞因子治療。治療類風溼性關節炎的新紀元」New Eng.J.Med.340，310-312(1999).RA van Hogenzand，HWVerspaget「抗腫瘤壞死因子-α產品在節段性迴腸炎治療中的前景」Drugs 56，299-305(1998))；其它產品表現出很強的毒性，例如沙利度胺，或者表現出使其難以運用的主要活性，例如ciplofloxacina或rolipram。對於其它情況，缺乏化學定義、和由此所致的批與批之間的再現性，例如提取物。最後，對於TNF基因表達抑制劑腎上腺皮質激素，它們表現出一組重要的禁忌症。
在近幾年，關於免疫系統功能機制的知識已使得人們開發出了稱為免疫調節劑的物質。存在著其中利用免疫調節劑變得特別重要的疾病，例如具有下述病因的自身免疫性疾病免疫系統失衡、醫原性免疫抑制(例如在移植物、抗腫瘤治療或尤其是創傷手術中發生的免疫抑制)或環境因素(由壓力或汙染引起的)。另一方面，現在有許多治療方案使用免疫調節劑來作為抗癌或抗感染治療的輔藥(E Garaci，F Pica，G Rasi，AT Palamara，C Favalli「在癌症和感染性疾病中使用BRMs的聯合治療」Mechanisms of Ageing and Development96，103-116(1997)。
一組重要的免疫調節劑是其設計目標為刺激天然免疫機制，特別是NK活性或單核噬細胞系統的吞噬細胞和殺微生物活性的免疫調節劑。在這些免疫調節劑當中，可提及的有細菌提取物、BCG、小棒桿菌、胞壁醯二肽衍生物、以及多糖、尤其是從酵母中提取的葡聚糖(AAszalos「天然來源的抗腫瘤化合物」中的「微生物來源的免疫刺激劑」CRC Press(1982))。雖然上述分子已表現出作為單核細胞-巨噬細胞系統激活劑的有效性，以及作為抗腫瘤化合物的一些效力，但是施用它們會產生兩種不利的副作用一方面，它們阻斷肝臟代謝系統—它們與其它免疫調節物質共同具有的、且阻礙用其它治療劑例如抗生素或細胞抑制劑進行輔助治療的特性，另一方面，非常特殊的是，它們變得對細菌內毒素敏感，並且可能發生這樣的情況，即在免疫輔劑存在下，由於抗生素作用所導致釋放的內毒素對患者有更大的毒性(M Trautmann，R Zick，T Rukavina，AS Cross，R Marre「抗生素誘導的內毒素釋放體外比較美羅匹寧與其它抗生素」J.Antimicr.Chemother.41，163-169(1998))。
因此，根據上述現有技術狀況我們推斷，有很窄的下述治療窗口即這些治療窗口由找到能夠選擇性地抑制一些TNF作用，同時又不阻斷或者甚至是刺激免疫反應的產品構成。
肽型免疫調節劑是其應用已引起更大爭議的分子。之所以產生爭議是由於下述事實，即雖然這類分子表現出非常有希望的活性，例如與受體特異作用、特異性地抑制其它蛋白(象蛋白酶抑制劑一樣)等，但是它們存在生物利用度問題、尤其是口服生物利用度問題、短的半衰期以及引起變態反應或過敏反應。最近發表的肽和蛋白類免疫調節劑的綜述著重強調了這些特徵(JE Talmadge「施用肽類生物反應調節劑的藥動學特徵」Advanced Drug Delivery Reviews33，241-252(1998))各種範例表明蛋白的治療活性與低分子量傳統藥物不同。這些不同主要是由於蛋白的藥動學性質所致。因此，了解這些藥物的藥理特徵以及將其治療活性最佳化，或者鑑定其治療活性非常重要。這些範例包括蛋白具有短的半衰期，為了獲得最大活性需要皮下或連續輸注。
明顯的「鐘形」反應。
由於所認識的所述分子的作用機制，需要長期給藥。
與化療和/或放療聯合施用的所述治療劑作為輔助治療的最佳活性，和在具有最小殘餘疾病的患者中發現了最大的輔助免疫治療活性」。
本發明的目的是，由精確結構要求所限定的具有特殊物化特徵的一些肽或蛋白能夠與多糖類特異分子形成非共價綴合物，其中所述多糖分子是由能夠使其形成這些綴合物的結構特徵限定的，並且這些綴合物口服給藥後表現出人或動物免疫反應調節活性。該調節轉化成對在一些實驗條件下誘導的TNF生成的下調，還能夠刺激單核-噬細胞系統，擴大粒細胞-巨噬細胞能力，並不表現出抑制肝臟代謝系統的作用。
為了使具有特別的重要性需要強調兩點第一點是，經口服給藥所形成的非共價綴合物有活性，因此在口服給藥生物活性肽領域有新穎性，並克服了這種給藥途徑原有的缺陷。這些缺陷描述在下述文獻中BL Ferraiolo，LZ Benet「用作藥物的肽和蛋白」Pharmaceutical Research 4，151-194(1985)；FM Rollwagen，S Baqar「口服給藥細胞因子」Immunol.Today 17，548-550(1996)；Solis Pereyra，N Aattouri，D Lemonnier「食物在刺激細胞因子生成中的作用」Am.J.Clin.Nutr.66，521S-525S(1997)；A Fasano「口服遞送藥物和肽的創新策略」Trends in Biotech.16，152-157(1998)；GM Pauletti，SGangwar，TJ Siahaan，J Aube，RT Borchardt「改善口服肽生物利用度肽模擬和前藥策略」Adv.Drug Deliv.Rev.27，235-256(1997)；JJ Hols，C Deacon，MB Toft-Nielsen，LBjerre-Knudsen「用胰高血糖素樣肽-1治療糖尿病」Ann.NewYork Acad.865，336-343(1998))。在這個意義，應當指出，這不是口服給藥的肽活性的唯一實例(Y Nagao，K Yamashiro，NHara，Y Horisawa，K Kato，A Uemera「口服施用IFN-α增強了小鼠中的免疫反應」J Interferon and Cytokine Res.18，661-666(1998)；S Kaminogawa「食物變態反應，口服耐受以及免疫調節。它們的分子和細胞機制」Biosci.Biotec.Biochem.60，1749-1756(1996)；H Utwata，T-T Yip，K Yamauchi，S Teraguchi，H Hayasawa，M Tomita，T.W.Hutchens「給成年小鼠胃腸道攝取乳鐵蛋白後的存活率」Biochem J.334，321-323(1998)；J Xu-Amano，WK Aicher，T Taguchi，H Kiyono，JR McGhee「通過口服免疫接種在鼠Peyer’s斑中選擇性地誘導Th2細胞」Internat.Immunol.4，433-445(1992))。
第二點是，現有技術中已經描述了具有生物活性但是與本發明目的相反的共價或非共價多糖-蛋白複合物，它們通常相互關聯，在這樣的關聯體中加入一些肽使得弱免疫原性多糖的抗原反應增強，由於該關聯，獲得了抗多糖抗原的T依賴型反應，而抗多糖抗原的反應本身僅是T獨立型的，並且反應很弱(H-K Guttormsen，LM Wetzler，RW Finberg，DL Kasper「在採用的鼠淋巴細胞轉移模型中通過複合糖疫苗誘導免疫記憶」Infection and Immunity 66，2026-2032(1998)；MA Avanzini，AM Carre，R Macario，M Zecca，GZecca，A Pession，P Comoli，M Bozzola，A Prete，REsposito，F Bonetti，F Locatelli「在進行骨髓移植的兒童中用流感嗜血桿菌b型綴合疫苗進行免疫接種與健康的年齡相當的對照進行比較」J.Clin.Immunol.18，193-301(1998)；EFEBabiker，A Hiroyuki，N Matsudomi，H Iwata，T Ogawa，NBando，A Kato「多糖綴合或轉谷醯胺酶處理對大豆蛋白的變應原性和功能特徵的影響」J.Agric.Food Chem.46，866-871(1998))。應當指出，與本發明不同，對於所述具有免疫調節活性的多糖-蛋白關聯體，這些關聯體是共價結合的並且來自相同天然來源(K Noda，N Ohno，K Tanaka，M Okuda，T Yadomae，K Nomoto，Y Shoyama「得自需要蛋白部分來表現出抗腫瘤活性的普通小球藻的新型生物反應調節劑」Phytotherapy Res.12，309-319(1998)；D Sabolovic，L Galoppin「在脾切除的大鼠和小鼠中蛋白結合多糖(PS-K對腫瘤生長和感染的影響」Int.J.Immunopharmac.8，41-46(1986))。
為了更好地理解本發明，進行下述詳細描述。
附

圖1是糖綴合物的紅外光譜的實例。
本發明描述了基本上純的特殊多肽與特殊多糖的綴合物的形成和藥理特徵，用於治療免疫機能異常、感染和/或腫瘤的治療組合物的製備。這些綴合物具有藥理活性，而其組成部分(多肽或多糖)都不表現出綴合物的藥理活性。這些綴合物也表現出不同的關於多糖多肽的化學計量，藥理活性取決於這些化學計量。
本發明的技術描述由下述部分組成a)本發明多糖分子性質必須符合的要求；b)本發明多肽分子性質必須符合的要求；c)這些要求的結果形成多糖多肽綴合物；d)多糖多肽綴合物的生物活性。A)本發明多糖分子性質必須符合的要求本發明多糖分子性質必須符合下述要求它們的來源必須是微生物，而不是病毒，特別是來源於酵母壁。它們的平均分子量必須為5-250Kda；這些多糖必須溶於水或鹽水介質，所述鹽水的離子強度類似於濃度為0-250mM的氯化鈉溶液所產生的離子強度，在這些條件下的溶解度至少為0.1mg/mL。在中性介質的溶液中，它們必須表現出負電荷，這主要是由賦予了抗aa T細胞的特殊反應活性的磷酸根基團所致(A Salerno，F Dieli「T淋巴細胞在人和小鼠的免疫反應中的作用」Criticai Rev.Immunol 18，327-357(1998))，磷酸根殘基與單糖的數目比為1∶5-1∶25；它們必須既不顯示出硫酸根基團，也不顯示出羧酸根基團。至於它們的單糖組成，甘露糖必須是主要的單糖(至少40％)，其它是葡萄糖和/或半乳糖；氮單糖含量必須不超過總量的5％。主要骨架必須由1-6個鍵形成，優選具有1-2個支鏈，支鏈中的單糖不超過60％。它們必須不顯示出結合的脂基。
至於它們的物理化學性質，它們必須顯示出能夠在水介質中與十八烷基矽烷相互作用的區域，並且必須在水或鹽水介質中不能凝膠化，尤其是當存在濃度小於或等於2mM的鈣時更是如此。它們必須能夠與具有在下述部分中描述的特徵的多肽或肽形成綴合物，所形成的綴合物在生理條件下必須穩定。
它們必須表現出非抗凝活性。它們必須能夠耐受胃腸道的物化和酶條件，以由此保證口服施用的綴合物的活性；該活性是通過綴合物與腸淋巴組織的相互作用和通過aa T細胞橋產生系統作用而產生的(AK Abbas，AH Lichtman，JS Pober「細胞和分子免疫學」W.B.Saunders Co.Philadephia，pp 232-236(1994).TW Mak，DAFerrick「aa T細胞橋先天連接和所獲得的免疫」Nature Med.4,764-765(1998))，在老年人中表現出特異衰退的橋(G Pawelec，R Solana，E Remarque，E Mariani「年齡對先天免疫的影響」J.Leu k.Biol.64，703-712(1998))。B)本發明多肽分子性質必須符合的要求本發明目標多肽分子性質必須符合下述式樣它們必須能抵抗胃腸道的物化和酶條件，以由此保證口服施用的綴合物的活性。
它們必須能夠與具有在上述部分中描述的特徵的多糖形成綴合物，所形成的綴合物在生理條件下必須穩定。
通過二硫橋穩定或者通過導致形成二亞甲基橋的化學操作穩定的多肽有特別價值。
這類結構同時代表著具有低分子量藥物的化學穩定性特徵的多肽的立體定向特徵。
這類分子的可能來源是植物種子儲藏多肽、植物防禦多肽、植物甜料多肽等。
為了達到這點，它們必須符合下述要求分子量4-30KDa。
溶解性以等於或大於0.1mg/ml的濃度溶於水或鹽水介質，所述鹽水的離子強度類似於濃度為0-0.25M的氯化鈉溶液所產生的離子強度。
在其自然條件下，它們在下述酶的最佳工作條件下必須抵抗胰蛋白酶型蛋白酶、化學胰蛋白酶和/或胃蛋白酶；在其自然條件下，它們必須在不少於1小時的時間內抗酸性pH(在與胃類似的條件下)。
它們必須能夠抵抗胃腸道的物化和酶條件，以由此保證口服施用的綴合物的活性；該活性是通過綴合物與腸淋巴組織的相互作用和通過aa T細胞橋產生系統作用而產生的(AK Abbas，AH Liehtman，JSPober「細胞和分子免疫學」W.B.Saunders Co.Philadephia，pp 232-236(1994).TW Mak，DA Ferrick「aa T細胞橋先天連接和所獲得的免疫」Nature Med.4，764-765(1998))，在老年人中表現出特異衰退的橋(G Pawelec，R Solana，E Remarque，EMariani「年齡對先天免疫的影響」J.Leuk.Biol.64，703-712(1998))。
當在二硫橋的還原劑例如6.4mM濃度的二硫蘇糖醇或氫硫基乙醇存在下通過試劑例如8M鹽酸胍或6M脲將它們變性時，它們必須能恢復到其天然形式，通過將變性劑進行簡單稀釋，在280-200nm的區間從分圓二色譜開始進行測定。
優選非糖基化。
通過二硫或二亞甲基橋的穩定，它們可以是寡聚體，尤其是二聚體，並且對於這種情況它們必須具有最少兩個二硫或二亞甲基鏈間橋。
序列為了符合上述要求，本發明多肽必須在其序列中包含下述共有序列Z3-48CZ9-13C(Q，E，R，K)Z(Z疏水性)(LIVM)Z15-39CC(Z親水性)(Q，E，H)(L，V)Z6CZCZ2(L，I)Z13-56GZ15-26CZ(V，I，L，M)Z1-8CZ1-12(是指在該圓括號內的1個胺基酸，即在優選順序中的一個可能的胺基酸。Zn是指n個胺基酸，無論它們是什麼胺基酸。該序列具有CZnC結構域(Tamaoki等人「通過不同胱氨酸構架誘導和穩定的摺疊基元」Protein engineering 11，649-659(1998))。
對於二聚多肽，共有序列可分布在兩個亞單位之間，這意味著存在著一個水解點，該水解點必須在由該序列的Zn所示的一個區域中。
它們必須對鼠脾細胞模型，具有顯著的增殖作用。在體外，評價了多肽對小鼠Balb/c脾細胞的影響。在微板中進行測定，並通過比色法定量測定增殖(T Mosmann「細胞生長和存活的快速比色法測定在增殖和細胞毒性分析上的應用」J.Immunol.Methods 65，55-63(1983)。C)形成多糖多肽綴合物多糖多肽綴合物的形成是在室溫從兩種組分在水或其離子強度不超過0.15M氯化鈉溶液的鹽水溶液中的溶液開始的自發現象。多糖多肽綴合物可以在1/1-1/19mol/mol範圍內。綴合物是這樣形成的在15-40℃，將分別含有所需量的多肽和多糖(這樣它們符合所指定的mol/mol比例)的溶液混合併以1-100rpm輕微振搖。將所述溶液的混合物在振搖狀態下保持5-60分鐘。一旦形成了綴合物，它就可以以適當蓋侖製劑的形式給藥，當將其無菌過濾後，其可通過非胃腸道、肌內或皮下途徑使用。
也可以形成一種多糖與兩種多肽的綴合物，只要其保持上述多糖/總多肽比例，並且除了符合上述條件以外它們還符合下述條件即可a)這兩種多肽的mol/mol比例為1/3-3/1；b)這兩種多肽具有相同生物來源；c)這兩種多肽表現出不小於25％的序列同源性(並且絕對同源性和所容許的替換之和不小於50％)。D)蓋侖製劑形式可注射的藥物劑型用不致熱的無菌鹽水溶液將綴合物透析或滲濾，並通過在不致熱的無菌條件下經由0.22i過濾進行滅菌。
口服劑型綴合物可以在由冷凍乾燥的綴合物在水中臨時配製的溶液獲得或開始的溶液中給藥，也可以在任意常規藥物蓋侖製劑形式例如片劑、丸劑、或膠囊，糖漿劑或採用所需賦形劑的任意口服液體藥物劑型中給藥。
局部給藥用藥物劑型可用常規藥物賦形劑將綴合物以1-5％(w/w)的濃度在常規劑型例如凝膠劑、霜劑、膏劑中配製成局部給藥用製劑。
由此獲得的多糖具有通過下述方法測定的150KDa±30KDa的平均分子量即在TSK40柱中進行的分子排除高效液相色譜法，使用10mM磷酸緩衝液，0.3M NaCl，pH7.4作為洗脫液，通過折射指數檢測，使用Fluka葡聚糖標記物作為分子量標記物。依據Hess和Deer的方法(HH Hess，JE Deer「在0.1-5納摩爾範圍內測定無機和有機磷.」Anal Bioehem 63607-613(1975))測定的其磷酸含量為1個磷酸/15個單糖殘基。通過水解、還原、乙醯化和糖醇乙醯化衍生物的氣相色譜分析測定單糖中的組成(依據在A Novotny「免疫化學基本操作」S.Verlag Ed.Berlin，Heidelberg，New York pp.127-131(1979)；G Keleti，WH Lederer「生物科學微量方法手冊」Ed.Van Nostrand Reinhold.New York.pp.55-57.和HPBurchfield，EE Storrs「氣相色譜法的生物化學應用」AcademicPress.New York(1962)中描述的方法)，結果發現其含有84±6％甘露糖、7±3％葡萄糖、和1±1％半乳糖。通過Smith降解法(F Smith，R Montgomery Meth Biochem Anal 3153(1956))進行結構分析，結果證實了所述多糖呈現出可在45±5％單糖中發現的直線骨架1-6和可在45±5％單糖中發現的支鏈。所述多糖對於羧酸根或硫酸根沒有任何陽性反應。由此獲得的多糖與十八烷基矽烷相互作用，當注射到這些特徵物在水介質中的柱(C18 Vydac)內時，需要至少25％濃度的乙腈進行洗脫。由此獲得的多糖在不完全胃液(2g/L NaCl，7mL/L濃鹽酸)中於37℃、以50-100rpm振搖條件下培養1小時後既沒有改變其在上述TSK柱中的色譜特性，也沒有改變其磷酸含量。由此獲得的多糖在濃度低於10mM的氯化鈣存在下不凝膠化。由此獲得的多糖在體外不表現出任何抗凝活性(TA Harper「止血紊亂的實驗室指導」pp 76-77 Butterworths(1970))。2.獲得多肽依據FS Sharief，SSL Li「從蓖麻子獲得的蛋白小和大亞單位的胺基酸序列」J.Biol.Chem.257，14753-14759(1982)；JGodinho da Silva Jr，OLT Machado，C Izumi，JC Padovan，BTChait，UA Mirzaa，LJ Geene「作為29-KDa前體蛋白一部分的新2S白蛋白的胺基酸序列」Arch.Biochem.Biophys.336，10-18(1996)；GM Neumann，R Condron，GM Polya「從苦瓜和蓖麻子獲得的napin狀蛋白小和大亞單位的純化和其序列測定以及被植物Ca2+-依賴性蛋白激酶磷酸化的位點的確定」Biochem.Biophys.Acta1298，223-240(1996)；MEH Bashir，I Hubatsch，HPLeinenbach，M Zeppezauer，RC Panzani，IH Hussein「Ricc1和Ricc3，蓖麻的變應原性2S白蛋白儲藏蛋白完全初始結構和種系關係」Int.Arch.Allergy Immunol.115，73-82(1998)描述的方法以下述手段獲得了多肽在本實施例中，作為本發明綴合物整體一部分的多肽是由未發芽的蓖麻子通過下述方法獲得的2.1.研磨預先在水中洗滌過的100g完整蓖麻子直至獲得不緻密的糊狀物。2.2.通過用500ml水將該糊狀物在4℃磁攪拌18小時獲得提取物。2.3.然後通過依次經由孔徑為0.2mm的不鏽鋼濾器，Hyflo超細胞包被，聚丙烯預濾器，和直徑為40mm且孔徑為80im、8im、5im、0.45im和0.22im的硝基纖維素濾器或類似物來除去蓖麻子殘餘物。2.4.用濃度為50％(v/v)的用水MilliQ稀釋的磷酸將濾液酸化至pH1.5。2.5.在輕微的磁攪拌下，將其在具有電熱板的水浴中於56℃加熱120分鐘。2.6.將其在室溫以2300×g離心15分鐘。小心地分離出上清液，以使其不被沉澱汙染。2.7.用20％(w/v)氫氧化鈉溶液將上清液中和至pH7.0-7.5。2.8.在室溫以2300×g離心15分鐘。小心地分離出上清液，以使其不被沉澱汙染。2.9.通過5000Da分子截留膜將該上清液超濾直至達到大約其1/2體積。加入水MilliQ至初始體積，並超濾至其1/2體積。該操作重複4次。2.10.通過反相柱(Vydac C4)色譜法測定上一步驟所得濃縮的洗滌上清液，用18-22％乙腈洗脫以純化多肽。2.11.通過冷凍乾燥將溶劑蒸發，並通過滲濾或者在BioGel P10或類似物中進行的色譜純化來除去過量的鹽。2.12.如果需要的話可將其冷凍乾燥。2.13.通過該方法，以0.2-1.0g多肽/100g蓖麻子的收率獲得了純產物，該收率使得其能以工業規模實施。
經質譜法測定，由此獲得的多肽具有12KDa±0.5KDa的分子量。通過在變性和還原條件下進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(H Schagger，G von Jagow「用於分離1-100KDa蛋白質的麥黃酮-十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳」Anal.Biochem.166，368-379(1987))，測定了其為二聚體，該二聚體是通過二硫橋結合的，這可從對於電泳解析需要使用還原條件來推斷出；其能抵抗胰蛋白酶(在0.1M Tris-HCl pH8.5中以30∶1的多肽∶蛋白酶比例於37℃培養24小時)、胃蛋白酶(在0.01M HCl中以25∶1的多肽∶蛋白酶比例於37℃培養24小時)，並符合在本發明說明書一般描述部分中所述的其餘要求。通過Edman降解測定的其序列如下次要亞單位ESKGEREGSSSQQCRQEVQRKDLSSCERYLRQSSSRR主要亞單位QQQESQQLQQCCNQVKQVRDECQCEAIKYIAEDQIQQGQLHGEESERVAQRAGEIVS SCGVRCMRQTR(其中下劃線表示的是在共有序列中存在的特定胺基酸)由此獲得的多肽在3μg/ml的濃度下能誘導脾細胞增殖，最大增殖指數為5。3.形成綴合物使用以1mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為50ml的如本實施例要點1所述製得的多糖，和以1mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為10ml的如本實施例要點2所述製得的多肽。在室溫下，將34ml多糖溶液和6.5ml多肽溶液倒入玻璃杯中，加入水至終體積為300ml，加入磁體，並以50rpm振搖30分鐘。然後取出1ml等分試樣，並保持在凍結狀態直至施用給實驗動物。4.生物活性在BalB/c小鼠血清中抑制細菌內毒素(LPS)誘導的腫瘤壞死因子(TNF)生成將在0.5ml如要點3所述製得的溶液中的多糖-多肽綴合物通過口服途徑施用給Balb/c小鼠，連續給藥6天，然後給每隻動物靜脈內注射25μg血清型大腸桿菌內毒素055B5。該治療所獲得的結果是，施用LPS 90分鐘後，TNF血清水平被抑制了65％。
在該測定中，當多糖-多肽綴合物的兩種構成部分以類似於綴合物的劑量單獨施用時，它們都沒有表現出活性。
TNF是通過其中測定血清對L929細胞系的細胞毒性的生物分析法測定的(T Mosmann「細胞生長和存活的快速比色法測定在增殖和細胞毒性分析上的應用」J.Immunol.Methods 65，55-63(1983)。
經質譜法測定，由此獲得的多肽具有11KDa±0.5KDa的分子量。通過在變性和還原條件下進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(H Schagger，G von Jagow「用於分離1-100KDa蛋白的麥黃酮-十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳」Anal.Biochem.166，368-379(1987))，測定了其為二聚體，該二聚體是通過二硫橋結合的，這可從對於電泳解析需要使用還原條件來推斷出；其能抵抗胰蛋白酶(在0.1MTris-HCl pH8.5中以30∶1的多肽∶蛋白酶比例於37℃培養24小時)、胃蛋白酶(在0.01M HCl中以25∶1的多肽∶蛋白酶比例於37℃培養24小時)，並符合在本發明說明書一般描述部分中所述的其餘要求。通過Edman降解測定的其序列如下次要亞單位PSQQGCRGQIQEQQNLRQCQEYIKQQVSGQGPRR主要亞單位QERSLRGCCDHLKQMQSQCRCEGLRQAIEQQQSQGQLQGQDVFEAFRTAANLPSMCGVSPTECRF(其中下劃線表示的是在共有序列中存在的特定胺基酸)由此獲得的多肽在6μg/ml的濃度下能誘導脾細胞增殖，最大增殖指數為4。3.形成綴合物使用以1mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為50ml的如實施例1要點1所述製得的多糖，和以1mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為10ml的如本實施例要點2所述製得的多肽。在室溫，將34ml多糖溶液和6.5ml多肽溶液倒入玻璃杯中，加入水至終體積為300ml，加入磁體，並以50rpm攪拌30分鐘。然後取出1ml等分試樣，並保持在凍結狀態直至施用給實驗動物。4.生物活性在BalB/c小鼠血清中抑制細菌內毒素(LPS)誘導的腫瘤壞死因子(TNF)生成將在0.5ml如要點3所述製得的溶液中的多糖-多肽綴合物通過口服途徑施用給Balb/c小鼠，連續給藥6天，然後給每隻動物靜脈內注射25μg血清型大腸桿菌內毒素055B5。該治療所獲得的結果是，施用LPS 90分鐘後，TNF血清水平被抑制了55％。
在該測定中，當多糖-多肽綴合物的兩種構成部分以類似於綴合物的劑量單獨施用時，它們都沒有表現出活性。
TNF是通過其中測定血清對L929細胞系的細胞毒性的生物分析法測定的(T Mosmann「細胞生長和存活的快速比色法測定在增殖和細胞毒性分析上的應用」J.Immunol.Methods 65，55-63(1983)。
在本實施例中，作為本發明綴合物整體一部分的多肽是由未發芽的蓖麻子通過下述方法獲得的2.1.研磨預先在水中洗滌過的100g完整蓖麻子直至獲得不緻密的糊狀物。2.2.通過用500ml水將該糊狀物在4℃磁攪拌18小時獲得提取物。2.3.然後通過依次經由孔徑為0.2mm的不鏽鋼濾器，Hyflo超細胞包被，聚丙烯預濾器，和直徑為40mm且孔徑為80im、8im、5im、0.45im和0.22im的硝基纖維素濾器或類似物來除去蓖麻子殘餘物。2.4.用濃度為50％(v/v)的用水MilliQ稀釋的磷酸將濾液酸化至pH1.5。2.5.在輕微的磁攪拌下，將其在具有電熱板的水浴中於56℃加熱120分鐘。2.6.將其在室溫以2300×g離心15分鐘。小心地分離出上清液，以使其不被沉澱汙染。2.7.用20％(w/v)氫氧化鈉溶液將上清液中和至pH7.0-7.5。2.8.在室溫以2300×g離心15分鐘。小心地分離出上清液，以使其不被沉澱汙染。2.9.通過5000Da分子截留膜將該上清液超濾直至達到大約其1/2體積。加入水MilliQ至初始體積，並超濾至其1/2體積。該操作重複4次。2.10.然後，用低於總體積的洗脫液通過BioGel P10進行分子滲透層析純化，省略掉對Lowry反應呈陽性的區域(OH Lowry，HJRosenbrough，AL Parr，RJ Randall「用福林苯酚試劑測定蛋白.」J.Biol.Chem.193，265-275(1951))，並棄去體積等於或大於總層的洗脫液。2.11.如果需要的話可將其冷凍乾燥。2.12.通過該方法，獲得了上述兩種多肽(實施例1和實施例2)的混合物，多肽1/多肽2的比例為35/75-75/35，並且收率為0.4-1.2g兩種多肽/100g蓖麻子，該收率使得其能以工業規模實施。
當以所得比例(2/1 12kDa多肽/11kDa多肽)聯合施用時，由此獲得的多肽在3μg/ml的濃度下能誘導脾細胞增殖，最大增殖指數為6。3.形成綴合物使用以3.75mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為150ml的如實施例1要點1所述製得的多糖，和以0.75mg/ml濃度溶解在水中的、總體積為10ml的如本實施例要點2所述製得的多肽。在室溫，將這兩種溶液倒入玻璃杯中，加入磁體，並以50rpm攪拌30分鐘。然後凍結、冷凍乾燥，並保持在凍結狀態直至施用給實驗動物，給藥時，將該凍結物以適於所需劑量的濃度溶解在蒸餾水中。
由此獲得的糖綴合物的紅外光譜如附圖1所示。紅外光譜在溴化鉀片中進行，其中糖綴合物濃度為0.2％，採用紅外分光光度計Perkin-Elmer型881，用可變狹縫在6分鐘內從4000變化到600cm-1，在1000cm-1分辨，光譜噪音為0.5％T，通過Savitzky/Golay法進行電子調節，並讓吸收度自動擴大。4.生物活性在BalB/c小鼠血清中抑制細菌內毒素(LPS)誘導的腫瘤壞死因子(TNF)生成將多糖-多肽綴合物以3mg/kg的劑量在0.5ml體積中通過口服途徑施用給Balb/c小鼠，連續給藥6天，然後給每隻動物靜脈內注射25μg血清型大腸桿菌內毒素055B5。該治療所獲得的結果是，施用LPS 90分鐘後，TNF血清水平被抑制了65％。
TNF是通過其中測定血清對L929細胞系的細胞毒性的生物分析法測定的(T Mosmann「細胞生長和存活的快速比色法測定在增殖和細胞毒性分析上的應用」J.Immunol.Methods 65，55-63(1983)。在小鼠中多次劑量的多糖-多肽綴合物對血清誘導的TNF生成的影響用與上述相同的治療方案給小鼠施用多次劑量的綴合物。結果表明在TNF的抑制與綴合物的劑量之間有劑量-作用關係。劑量-作用曲線呈鐘形，在48mg/Kg劑量達到90％的最大抑制。通過粒細胞-巨噬細胞系中前體細胞(CFU-GM)的增加評定造血活性的增加給C57BI/6小鼠靜脈內施用在0.25ml體積中的2mg/Kg單劑量的多糖-多肽綴合物，施用5天後經測定發現誘導了粒細胞-巨噬細胞系中的前體細胞形成。
靜脈內施用劑量類似於綴合物的多肽使得前體細胞CFU-GM的數目增加了227％。在該測定中，通過靜脈內途徑單獨施用劑量等於綴合物的多糖沒有產生任何作用。當以上述劑量施用綴合物時，該活性增加了最高達3763％。用單核細胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)感染和免疫抑制的小鼠存活率的增加在感染前，將3mg/Kg綴合物以0.5mL的體積施用給Swiss小鼠，連續施用6天，結果在用二氧化矽免疫抑制和用單核細胞增多性李司忒氏菌感染的小鼠中產生了保護作用。免疫抑制是通過在引起感染的前一天腹膜內施用120mg/Kg二氧化矽二氧化矽來誘導的。保護作用表現為致死劑量50的增加，施用綴合物達到了與未免疫抑制的動物類似的值。在免疫損害的動物中恢復NK細胞的抗腫瘤細胞毒害活性用在0.5mL體積中的3mg/Kg綴合物連續治療4天提高了正常小鼠脾細胞的NK活性，並且如果該活性下降的話，例如在老年小鼠和施用180mg/kg單劑量環磷醯胺的免疫抑制小鼠中發生的NK活性下降，可用綴合物治療將其恢復至正常水平。對小鼠巨噬細胞功能的影響將綴合物以0.9mg/Kg的劑量在0.2mL體積中通過口服途徑施用給Balb/c小鼠，連續給藥6天，結果增強了腹膜巨噬細胞抗金黃色釀膿葡萄球菌(Staphilococcus aureus)的噬細胞和殺細菌能力，並且觀察到了治療時間與反應之間的清楚關係。
當巨噬細胞抗細胞內病原體吉利蒙氏念珠菌(Candidaguilliermondi)時，觀察到了噬細胞值和殺微生物能力的提高。對鼻內內毒素引起的肺水腫的活性通過滴注400ig大腸桿菌的LPS 055B5(Sigma)來誘導肺水腫，施用3天後通過目測檢查肺表面評價肺水腫。從施用LPS的當天開始到動物死亡時為止，每天腹膜內施用溶於0.5ml不致熱的無菌水中的各種劑量的(0.9-4.5mg/Kg)綴合物，結果使水腫明顯減輕，有效劑量50為1.67mg/Kg。在小鼠中的急性毒性測定給CD1株小鼠口服施用在1ml體積中的200mg/Kg多糖-多肽綴合物沒有檢查出毒性，因為其不引起死亡或體重改變，也不引起主要生命器官的目視和顯微鏡檢查的重量以及外觀的改變。對肝臟水平上的代謝過程的影響將綴合物以3mg/Kg的劑量在0.5mL體積中通過口服途徑施用給Sprague-Dowley大鼠，結果不妨礙安替比林的清除。在0.5mL體積中通過口服途徑給相同株大鼠施用比上述劑量大3倍的劑量，連續施用6天，結果沒有改變細胞色素P450、細胞色素b5和NADPH細胞色素c還原酶的含量，也沒有改變涉及細胞色素P450(Phase I)的生物轉化酶活性，在大鼠肝臟微粒體中的Phase II的Phase II綴合酶也沒有改變。
權利要求
1.通過多糖與多肽的非共價結合而形成的糖綴合物，其特徵在於，對於多糖部分，其分子量為50-250DKa，含有支持磷酸根官能團，磷酸根的含量為1個磷酸根/5-25個多糖殘基，含有40％甘露糖，其餘是葡萄糖和/或半乳糖，主要骨架由1-6個鍵組成，具有1-2個支鏈，支鏈不超過60％；多肽部分的特徵是包含Z3-48CZ9- 13C(Q，E，R，K)Z(Z疏水性)(LIVM)Z15-39CC(Z親水性)(Q，E，H)(L，V)Z6CZCZ2(L，I)Z13-56GZ15-26CZ(V，I，L，M)Z1-8CZ1-12所示共有序列，其中符號代表胺基酸，圓括號是指優先順序，且Zn是指n個任意胺基酸。
2.上述權利要求的糖綴合物，其特徵在於，多肽部分是由一種或兩種多肽組成的，條件是兩種多肽的mol/mol比例為1/3-3/1。
3.權利要求1的糖綴合物，其特徵在於，多肽部分是具有選自下述的胺基酸序列的分子量為12±0.5Kda的二聚體次要ESKGEREGSSSQQCRQEVQRKDLSSCERYLRQSSSRRPSQQGCRGQIQEQQNLRQCQEYIKQQVSGQGPRR主要QQQESQQLQQCCNQVKQVRDECQCEAIKYIAEDQIQQGQLHGEESERVAQRAGEIVSSCGVRCMRQTRQERSLRGCCDHLKQMQSQCRCEGLRQAIEQQQSQGQLQGQDVFEAFRTAANLPSMCGVSPTECRF其中下劃線表示的是共有序列的特定胺基酸。
4.權利要求1的糖綴合物，其特徵在於，多肽部分的結構是由二硫或二亞甲基橋穩定的，並且可以是寡聚體或優選是二聚體，並且在這種情況中它們具有至少兩個二硫或二亞甲基鏈間橋。
5.具有藥理活性的權利要求1的糖綴合物，及其在治療免疫系統疾病藥物中的應用。
6.權利要求1的糖綴合物及其在製備常用蓋侖劑型中的應用。
全文摘要
本發明涉及糖肽糖綴合物,其中多糖是從產朊假絲酵母獲得的,肽是從蓖麻子獲得的。所述糖綴合物可用於製備控制腫瘤壞死因子(TNF)生成的免疫調節藥物。
文檔編號C12P21/00GK1344169SQ9981652
公開日2002年4月10日 申請日期1999年10月21日 優先權日1999年2月26日
發明者A·布裡瓦德伽多, V·伽茨雅維拉盧比亞, A·蓋利洛格美茲－帕默, J·P·匹維爾拉尼爾, G·吉米尼茲伽雷格, J·A·瑪緹圖杜利 申請人:坎塔布連製藥工業股份有限公司