用於將細胞種植到三維支架上的系統的製作方法

2023-05-12 17:47:41

專利名稱：用於將細胞種植到三維支架上的系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種系統，包括在準備用於植入時從來源(例如個體)收集、分離細胞和將細胞直接種植到生物相容性支架上的裝置和方法。
背景技術：
血管和心胸外科醫生使用血管移植物修復或替換因外傷或疾病(例如動脈瘤、動脈粥樣硬化和感染)而被削弱、損壞或阻塞的動脈和靜脈血管部段。歷史上，血管移植物已經為同種移植物例如患者自身的大隱靜脈或乳內動脈，由合成材料例如聚酯(例如，滌綸)、擴展特氟龍(ePTFE)和其它複合材料製成的假體移植物，或者新鮮的或固定的生物組織移植物。但是，合成移植物通常具有對很多用途的不足的通暢率，而收穫同種移植物需要費時的、昂貴的和創傷患者的漫長手術。固定的組織移植物不容許由宿主細胞滲透和佔據，而宿主細胞滲透和佔據對於重塑和組織維護而言是重要的。因此，固定的組織移植物隨著時間退化並且最終將導致故障。由於這些目前可得的合成和生物移植物的不足以及同種移植物的高成本和有限供給，正開發組織工程移植物，其被滅菌、隨後在體外使用細胞進行種植和培養。這些組織工程移植物可以顯示天然動脈和血管的長期尺寸穩定性和通暢性而具有正常的生理功能，優於用於在替換療法中使用的其它移植物。歷史上，除了培養組織工程移植物以外，細胞的分離和種植通常需要使用無菌環境，例如罩或專用設施例如ISO第7類室。但是，在這種環境中存在種植和培養組織的缺點。例如，這些系統可能對於使用者而言是繁瑣的、不方便的、使用起來耗費時間、並且構建和維護起來非常昂貴。由此，本領域中存在對於容許方便的、無菌分離、收集和種植組織工程移植物和其他假體裝置的組成和方法的需求。

發明內容
本文所述的是一種系統，優選地，封閉的無菌系統，所述系統包括裝置和方法，以用於從來源優選地從目標分離和收集細胞(例如源自骨髓的祖細胞例如單核細胞)，並且隨後將這些細胞種植到生物相容性的三維支架或組織移植物上。所述支架或移植物能夠在用於培養、輸送、存儲、測試的系統內例如作為組織移植物(例如血管移植物)培育和/或植入到目標內，以在體內、體外或離體地再生和/或修復組織。根據本發明，提供了一種用於分離和種植、培養、存儲、運輸和測試在封閉和無菌系統內的血管移植物的裝置和方法，其不需要專用罩或潔淨室。在某些方面，本發明提供了用於使用人類細胞種植和培養血管移植物的裝置和方法，從而得到由活性人類細胞佔據的組織工程血管移植物。在某些方面，本發明提供了一種封閉的、一次性系統，所述系統使用過濾/洗脫技術分離期望的細胞類型，並且使用真空種植將細胞種植到三維生物相容性支架上。所述被種植的支架隨後能夠被培育，並且當準備使用時從所述系統中移除。因此，在一個方面，提供了一種用於種植細胞的系統，包括細胞分離流體容器；設置在所述細胞分離流體容器與收集流體容器、洗脫流體容器以及種植容器之間的流動通道，其中，所述流動通道包括入口、出口和介於所述入口和所述出口之間的過濾器，其中，所述過濾器適於容許沿至少兩個方向的流動，並且其中，所述流動通道分別與所述細胞分離流體容器、所述收集流體容器、所述洗脫流體容器和所述種植容器中的每一個選擇性地流體連通。在某些實施例中，所述種植容器包括多孔管或穿孔管(例如穿孔芯棒)以及設置在所述管的至少一部分附近的生物相容性三維支架。在某些另外的實施例中，所述系統包括與所述種植容器流體連通的殘留種植細胞流體容器以及與所述殘留種植細胞流體容器流 體連通的真空源。在另一方面，提供了用於使用如本文所述的用於種植細胞的系統的方法。本發明還提供了本文所述的任意發明。前面的實用性的常見領域僅作為示例給出而非意為限制本公開和所附權利要求的範圍。鑑於示例實施例、描述和示例，本領域的技術人員將明白本發明的另外的目的和優點。例如，本發明的各個方面和實施例可以利用為多種組合，所有這些均由本說明書明確地構想。這些另外的優點、目的和實施例明確地包括在本發明的範圍內。


結合到說明書內且形成說明書的一部分的附示了本發明的若干實施例，並且連同描述一起用來解釋本發明的原理。附圖僅僅用於圖示本發明的實施例的目的而非意為理解為限制本發明。從下面的詳細說明，結合示出了本發明的示例性實施例的附圖，本發明的另外的目的、特徵和優點將變為明顯，在附圖中圖I展示了如本文所述的示例系統。簡要地，(i)骨髓抽吸物(例如，5cc/kg體重)被無菌收集且注入細胞分離流體容器(3)內；(ii)利用重力，使骨髓抽吸物穿過包括過濾器的流動通道(7)，所述過濾器在所述抽吸物從所述過濾器介質的上遊表面流動通過所述濾器介質的下遊表面時捕獲源自骨髓的單核細胞；(iii)所述骨髓抽吸物的剩餘部分(其典型地主要包括血漿，但是可以包括紅血細胞和/或血小板)被收集在收集流體容器(13)中；(iv)位於洗脫流體容器(9)中的洗脫溶液穿過流動通道(7)，其中，所述洗脫溶液從所述過濾器介質的下遊表面流動通過所述介質的上遊表面，並且進入種植容器(18)內，使得所述過濾器釋放收集在所述種植容器中的源自骨髓的單核細胞；(V)所述種植容器(18)包括插入到穿孔芯棒(20)上的支架；(vi)源自骨髓的單核細胞懸浮液填充所述種植容器,從而完全覆蓋被插入到所述穿孔芯棒(20)上的支架；(vii)真空(例如，-20mmHg)被施加，直到所有細胞懸浮液已經穿過支架且被收集在至少一個殘留種植細胞流體容器(35a,35b)中為止；以及(viii)被過濾的骨髓吸出物(典型地主要包括血漿)經由重力的作用從所述收集容器(13)流動到種植容器(18)內，所述種植容器(18)包括所述被種植的支架』由此衝洗所述被種植的支架。圖IA為在圖I中所示的種植容器(18)的立體圖，圖示了位於種植容器中的細胞懸浮液，其中，懸浮液與支架相接觸。圖2展示了用於與本文所述的示例性系統一起使用的示例性芯棒設計。簡要地，
(i)所述穿孔芯棒(20)的敞開端部(126)被插入到抽吸杆(23)上；(ii)所述合適尺寸的聯接環(123)隨後被插入到所述穿孔芯棒上；以及(iii)所述合適尺寸的支架隨後被插入到所述裝置上並且被固定。圖3圖示了能夠根據本發明的實施例使用的另一種植容器(18)。
具體實施方式
下面是提供用於幫助本領域的技術人員實施本發明的對本發明的詳細描述。本領域的普通技術人員可以在不偏離於本發明的精神或範圍的情況下對本文所述的實施例進行修改和改變。除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與由本發明所屬領域的技術人員共同理解的相同含義。在本文的發明的描述中使用的術語僅僅用於描述特定實施例，而非旨在限制本發明。本文提及的所有公布、專利申請、專利、附圖和其他參考文獻的全部內容通過參引的方式明確併入本文。本文描述的是一種系統，優選地，封閉的無菌系統，所述系統包括用於分離和收集細胞(例如源自骨髓的祖細胞例如單核細胞)的裝置和方法，這些細胞被種植到生物相容性三維支架上、被培育並且隨後能夠例如被植入以例如作為組織移植物(例如血管移植物)。在某些實施例中，所述系統利用過濾/洗脫技術以用於無菌分離細胞、將細胞種植和培育到三維支架上。佔據生物相容性支架的無菌分離細胞能夠被培養並且在存儲、運輸和/或測試來自個體的細胞中被採用。可選地，由活性分離細胞佔據的支架能夠被培養，並且用作例如可植入移植物(例如血管移植物)，以在體內、體外或離體地再生和/或修復組織。由此，本發明的一個優點在於其提供了一種方便的、較低成本的系統，所述系統用於無菌分離細胞、將細胞種植且培養到支架上而不需要罩或專用設施例如ISO第7類室。另一優點在於所述方法能夠比使用罩或專用設施的常規方法更快地執行。有利地，例如，所述方法能夠在幾小時內執行，例如大約5小時或更少，優選到，大約3小時或更少，甚至更優選地，大約兩(2)小時或更少。當提供數值範圍時，應當理解的是，介於該範圍的上限與下限之間的每個中間值(除非上下文另外清楚地指出，到下限的單元的十分之一)以及在所述範圍中的任意其他表述或中間值包括在本發明內。這些更小範圍的上限和下限(其可以獨立地包括在更小範圍內)也包括在本發明內，除所述範圍內的任意專門排除的極限。當所述範圍包括這些極限中的一個或兩個時，排除那些被包括在內的極限中的任一個或兩個的範圍也包括在本發明中。現在描述優選的方法和材料，但與本文所述的那些相似或等同的任意方法和材料也能夠在本發明的實施或測試中使用。本文提及的所有公布通過參與的方式併入本文，以公開和描述與所引述的公布相關的方法和/或材料。必須注意的是，如本文和所附權利要求中所用，單數形式「一個」、「和」、以及「該」包括複數引用，除非上下文清楚地另外表述。本文所用的所有技術和科學術語具有相同的含義。I.示例性定義除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與由本發明所屬領域的技術人員共同理解的含義。下面的參考文獻(其所有公開內容通過參引的方式併入本文)向技術人員提供了在本發明中所用的很多術語的一般定義辛格爾頓等人，微生物學和分子生物學詞典(第二版，1994 年)(Singleton et al. , Dictionary of Microbiology andMolecular Biology (2nd ed. 1994));劍橋科技詞典(沃克編著，1988 年)(The CambridgeDictionary of Science and Technology (Walker ed.，1988));遺傳學詞彙，第 5 版，R. HH格等(編著)，施普林格出版社(1991 年)(The Glossary of Genetics, 5th Ed. , R. Rieger etal. (eds.), Springer Verlag (1991));以及黑爾&馬漢姆,哈拍柯林斯生物學詞典(1991年)(Hale&Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology(1991))。如本文所用，除非另有規定，下面的術語可以具有以下含義。但是，應當理解的是，由本領域的普通技術人員 已知或理解的其他含義也是可能的，並且落在本發明的範圍內。本文所提及的所有公布、專利申請、專利和其它參考文獻的全部內容通過參引的方式併入本文。在衝突的情況下，包括定義的本說明書優先。另外，材料、方法和示例僅僅是說明性的而非意為限制性的。為了可以更容易地理解本發明，首先定義特定的術語。術語「芯棒」可以指的是但不限於圓筒形裝置或管，例如金屬棒，其用作芯部，圍繞該材料，例如用於種植和生長細胞的基體支架可以鑄造、模製成型、鍛造、彎曲、或另外地定形。在某些實施例中，本文所述的芯棒在至少一個端部上為敞開的。在另外的實施例中，本文所述的芯棒也可以包括沿著其軸線(即，沿著其長度)的孔或穿孔。術語「閥」可以指的是但不限於一種裝置或裝置的一部分，通過所述裝置，液體、氣體或鬆散材料的流動可以例如通過活動部件而被起動、停止或調節，所述活動部件打開、關閉或部分地阻塞一個或多個埠(例如，入口或出口)或通路。術語「生物相容性的」可以指的是但不限於身體通常在不出現大的免疫反應的情況下接受的材料，所述材料能夠在不導致過多纖維化或排斥反應的情況下被植入到生物系統中，例如組織植入物。術語「可生物降解的」可以指的是但不限於由活有機體的作用將物質或材料分解成無害物質的能力。術語「聚合物」可以指的是但不限於由五個或更多個相同組合單元(稱為單體)的化學結合形成的大分子。在大多數情況下，單體的數目很大並且常常不能精確地知道。在合成聚合物中，該數目可以被控制到預定的程度。組合兩個、三個、或四個單體被分別稱為二聚體、三聚體、和四聚體，並且被統稱為低聚物。聚合物可以為無機的(例如，矽氧烷、鏈硫、黑磷、硼-氮、聚矽氧烷)或有機的(指的是含有碳)。有機聚合物可以為天然的(例如，多糖類，例如澱粉、纖維素、果膠、海藻膠、植物膠；多肽，例如酪蛋白、白蛋白、球蛋白、角蛋白、胰島素、DNA;以及烴類，合成的(例如，熱塑性塑料(例如，未硫化的彈性體、尼龍、聚氯乙烯、線性聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯、丙烯酸樹脂)；熱固性塑料(例如，硫化彈性體、交聯聚乙烯、酚醛樹脂、醇酸樹脂、聚酯)，和半合成的(例如，纖維素例如人造絲、甲基纖維素、醋酸纖維素；以及改性澱粉)。
術語「均聚物」可以指的是但不限於源自單一單體的天然或合成聚合物。術語「雜聚物」可以指的是但不限於源自多於一種的單體亞單元的天然或合成聚合物(即，共聚物)。除非另有說明，術語「聚合物」通常用來指代如本文所述的均聚物和雜聚物(即，共聚物)。術語「水溶性纖維素化合物」可以指的是但不限於纖維素化合物系，其是由陰離子硫酸鹽基團(其能夠由-SO3-表示)替代到不同程度的重複葡萄糖單元的長鏈大分子。由本發明包括的水溶性纖維素化合物的分子量典型地在從大約5X 105g/mol到大約3X IO6g/mol的範圍中。每個葡萄糖單元的羥基基團能夠以一個至三個硫酸基團替代。磺化使得不溶性纖維素具有水溶解度。未替代的羥基基團的存在提供了用於水溶性纖維素硫酸鹽的交聯的反應活性部位。硫酸基團的負電荷由陽離子種類的正電荷平衡，陽離子典型地為鹼金屬陽離子，並且優選地為鈉陽離子。在某些實施例中，形成支架的該聚合物基體能夠另外地
包括水溶性纖維素化合物,例如NaCS。術語「膠原蛋白」可以指的是但不限於細胞外的、緊密相關的蛋白質系中的任一個，其發生作為結締組織的主要成分，從而向其提供強度和柔性。存在至少十四(14)種類型，每種包括原膠原蛋白單元，其與局部化於不同的組織、階段或功能的類型共享共同的三重螺旋形狀，但是其在不同類型之間的組合略有不同。在某些類型中，包括最常見的I型，原膠原蛋白杆相關聯以形成原纖維或纖維；在其他類型中，杆不是纖維狀的而與纖維狀膠原蛋白相關聯，而在其他類型中它們形成非纖維狀的、非周期性的但結構化的網。膠原蛋白的基本結構單元、原膠原蛋白包括由三個多肽鏈構成的螺旋形結構，每個鏈包括大約一千個胺基酸，圍繞彼此纏繞以形成螺旋且通過鏈間和鏈內共價鍵穩定。其富含甘氨酸(作為三個中的近一個殘基發生)、以及三脯氨酸、羥脯氨酸和羥基賴氨酸；後兩個很少在其他蛋白中發生。術語「微米級纖維」或「微米尺度纖維」可以指的是但不限於直徑在從大約I微米(I(T6HI)至大約1000微米的範圍中的纖維。術語「納米級纖維」或「納米尺度纖維」可以指的是但不限於直徑範圍為從大約I納米(10_9m)至大約1000納米的纖維。在某些實施例中，可降解聚合物從由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、或聚(己內酯)、聚醯胺、多糖和膠原蛋白構成的組中選取。在優選實施例中，該聚合物為聚(乳酸-乙醇酸)。如本文所用，術語「聚(乙醇酸)」、聚乙交酯和「PGA」在本文互換地使用以指代可生物降解的熱塑性聚合物和最簡單的線性脂肪族聚酯。PGA也可以例如從Sigma-Aldrich公司商業上獲得。「聚乳酸」是源自乳酸的可生物降解聚合物。聚(丙交酯)或PLA以兩種立體形式存在，由D或L象徵右旋或左旋，或由DL象徵外消旋混合物。術語「PLLA」指的是可生物降解的脂肪族聚酯均聚物的聚L-乳酸。PLLA可以例如從Alkermes公司商業上獲得。術語聚(乳酸-乙醇酸)、聚(D，L-丙交酯-C-糖苷)以及PLGA互換地使用以指代聚乳酸和乙醇酸的共聚物。PLGA可以例如從Alkermes公司商業上獲得。如本文所用，術語「多糖」是由連結的單糖(單糖)(例如葡萄糖)和密切相關的分子製成的長鏈天然或合成聚合物。兩個單糖分子可以通過糖苷鍵接合以形成二糖，例如在葡萄糖和果糖聯接以生成蔗糖時。更複雜的多糖例如澱粉、糖原、纖維素或甲殼質包括通過糖苷鍵接合的多個單糖單元。如本文所用，術語「多孔的」涉及具有可以由液體和/或氣體填充或灌注或者容許液體和/或氣體穿過其中的流動的一個或多個開口、孔、穿孔或洞孔。術語「生長因子」通常指的是生物活性細胞信號轉導分子，包括細胞因子和趨化激素，其已知為通過它們與細胞上的細胞表面受體(典型地受體酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、免疫球蛋白或GPCR)的相互作用引致生理學效果。結合到其受體上的生長因子的生理學效果包括例如在基因表達中的變化和/或細胞增殖、分化、激活、靜止、或細胞凋亡。在某些情況下，生長因子是多效性的，即，取決於濃度、細胞類型和/或細胞狀態，它們可以誘導不同的生理作用。在本文所提供的任一實施例中，纖維、基體和/或支架可以另外地包括一個或多個生長因子以增強例如細胞或組織的生長、分化和/或修復。
術語「生物活性的」和「生物活性」可以指的是但決非限於對與活體組織的相互作用或來自活體組織的響應的任意影響。如本文所用，術語「流體」可以指的是但決非限於能夠流動的材料和/或材料的組合。例如，用於在本文所述的任一實施例中使用的流體可以包括例如在溶液、懸浮液、分散體或其組合中的液體成分和/或非液體成分(例如，氣體、固體、半固體、顆粒狀、膠體)。作為進一步示例，短語「細胞分離流體」包括液體成分和源自細胞或組織的材料的組合。本發明的下面的實施例將在系統的上下文中說明，所述系統包括用於種植、培養、存儲、運輸和測試血管移植物的裝置和方法，但本領域的技術人員將認識到，所公開的方法和結構很容易地適於更廣泛的應用。注意，只要相同的附圖標記在不同的附圖中重複，其就指的是在每張這種附圖中的對應結構。II.示例性系統圖I圖示了由本發明提供的用於種植、培養、存儲、運輸和/或檢測細胞和/或移植物(例如組織移植物)的示例性封閉系統1000。在某些實施例中，所述系統包括用於容納細胞分離物(例如細胞分離流體)的裝置。在某些實施例中，所述裝置為容器3，例如能夠被滅菌和/或密封的介質袋或任意柔性或剛性容器。例如，能夠使用Gibco-BFL IL介質袋。在某些實施例中，細胞分離流體容器3可以包括能夠被滅菌的任意生物相容性的、剛性材料，例如特氟龍、聚碳酸酯、PVC或不鏽鋼。容器3能夠具有用於容納細胞分離流體的任意合適的體積。在優選實施例中，容器3具有適於流體(例如骨髓抽吸物)的無菌灌裝和/或分配的至少一個埠。例如,骨髓抽吸物(例如，5cc/kg體重)被無菌收集且流動例如經由埠 I或埠 2注入容器3內。在另一優選實施例中，容器3具有至少一個入口和一個出口。在又一實施例中，容器3包括具有一個或多個閥以容許流體或氣體的單向流動的埠。例如，使用圖I中所示的實施例作為參考，埠 I能夠包括和/或採取swabbable閥(例如無針接入埠)的形式。該閥能夠使用本領域的技術人員已知的任意合適的聯接件或緊固裝置(例如夾具、螺釘或魯爾接頭、壓力配合、摩擦配合、聯接件等)連接到容器3上和/或能夠與流體線路(與容器3連通)相關聯。根據圖I中圖示的系統1000的實施例，閥5與導管例如流體線路51相關聯，從而與容器3連通。可選地，容器3包括預過濾元件4，該預過濾元件4例如包括例如絲網元件或機織元件(具有例如範圍為從大約40微米至大約150微米的開口或孔結構)。這種預過濾元件能夠當流體從容器中通過時用來移除非期望的材料(例如骨碎片、血塊和/或脂肪沉積)。在某些實施例中，用於容納細胞分離流體的裝置包括本體，所述本體限定能夠保持流體或氣體的無菌和/或密閉容器，其中，所述本體也限定適於流體的填充和/或分配的一個或多個埠。在某些實施例中，所述本體限定一個或多個埠，其中，至少一個埠具有閥，例如單向閥。在又一實施例中，所述本體限定有包括閥的出口埠。可以在系統中使用的流體的示例包括但不限於消毒流體、造影介質流體、生物流體、含有細胞的流體、血液、血清、骨髓抽吸物、或含有培養基的流體。應當理解的是，在優選實施例中的測試、種植和培養期間，流體可以有利地保持在人體溫度，並且可以包括接近人體血液粘度的流體。接近血液粘度的溶液的一個示例性示例為帶有甘油的生理鹽水。容納在容器3中的流體從容器流過流體線路51 (圖I中)。在優選實施例中，流體通過重力的作用而遠離於容器3被引導。但是，本領域的技術人員容易理解，也能夠使用流體泵(例如，由Cole-Palmer公司製造的Masterflex L/S數字驅動式螺動泵,但本領域的技 術人員能夠從多種可商業獲得的泵中選取)。流體線路51以及系統中的所有其他流體線路(例如，線路52、53、54、55、56、57、58a-58d和59)可以由適於在使用時運輸流體或氣體的醫用級的、可消毒的、耐用的管件中的任一種類型製成。例如，流體線路能夠為柔性或剛性塑料。所述系統還包括流動通道7，所述流動通道7包括至少一個入口、至少一個出口和至少一個過濾器，所述至少一個過濾器包括介於所述至少一個入口與所述至少一個出口之間的至少一個過濾器介質(例如，設置在過濾器殼體中)。在優選實施例中，過濾器以大致垂直於流過流動通道7的方向的角度設置(在一些實施例中，過濾器能夠以大致平行於流動方向的角度設置，例如，涉及切向流動過濾)。在優選實施例中，過濾器適於容許沿至少兩個方向的穿過其中的流動，例如，當第一和第二方向大致相反時，例如，其中流體能夠沿第一方向從過濾器的上遊表面流過下遊表面，並且流體能夠沿第二方向從過濾器的下遊表面流過上遊表面。在該實施例的示例中，細胞分離流體沿第一方向流過具有合適孔徑(或網目尺寸)的過濾器，其中，過濾介質處於大致垂直於流動方向的角度，使得過濾器保持太大而不能穿過過濾器的細胞核/或生物材料。第二流體隨後沿第二方向穿過過濾器，其能夠從過濾器介質上清洗所保持的細胞核/或生物材料。能夠用於在流動通道中利用的過濾器在本領域中是已知的，並且包括例如Pall公司。在又一另外的實施例中，過濾器(例如，至少一個過濾器介質)具有適於保持細胞(例如源自骨髓的單核細胞)的孔隙率。在某些實施例中，過濾器包括設計用於基於例如配體-受體相互作用而可逆地結合且保持所關注的細胞的基體。在又一另外的實施例中，多個過濾器能夠串聯或並聯地組裝以用於在如本文所述的系統中使用。構想的是，所述系統和方法能夠具有任意數目的期望的流道和截止閥。流體或氣體能夠以至少三種方式通過系統供給重力，例如聯接到過濾器上的IV型袋；例如經由注射器、泵或真空源獲得的正壓力或負壓力，所有這些都由本發明明確地包括和構想。能夠以本領域中眾所周知的任意數量的方式進行與過濾器和/或系統的任意其他部件的連接，例如，無菌對接、在接頭上的扭轉(例如魯爾接頭、卡扣或摩擦配合)和緊固件等。由此，將可能的是使用多種標準聯接技術進行連接，並且其構想的是標準連接件的任意組合是可能的。所有組合均由本發明包括和構想。在某些實施例中，所述系統包括用於容納收集流體的裝置。在某些實施例中，所述裝置是容器13，例如能夠被滅菌和/或密封的介質袋或任意柔性或剛性容器。例如，能夠使用Gibco-BFL IL介質袋。在某些實施例中，收集容器13可以包括能夠被滅菌的任意生物相容性的剛性材料，例如特氟龍、聚碳酸酯、丙烯酸類、PVC或不鏽鋼。容器13能夠具有用於容納收集流體的任意合適的體積。在優選實施例中，容器13具有適於流體的無菌灌裝和/或分配(例如骨髓抽吸物濾過或流過)的至少一個埠。例如，骨髓抽吸物(例如，5cc/kg體重)被無菌收集且流動(例如注入)進入容器3內並且隨後流動(例如，通過可選的預過濾器4且經由流體流動線路 51和52)通過包括過濾器的流動通道7。過濾器保留所關注的細胞和/或生物材料，從而使濾液能夠流過流體線路53和54以及入口埠 11而流入容器13內。在另一優選實施例中，容器13具有至少一個流動埠，例如雙向流動埠 ；但是，典型地，容器13具有至少兩個埠。在某些實施例中，容器13包括入口埠和/或出口埠(在圖I中圖示的實施例中，容器13包括入口埠 11和出口埠 14)。在又一實施例中，容器13包括具有一個或多個閥以容許流體或氣體的單向流動的埠。所述閥能夠使用對本領域技術人員公知的任意合適的聯接件或緊固裝置(例如夾具、螺釘或魯爾接頭、壓力配合、摩擦配合等)連接到容器13上和/或與流體線路(與容器13連通)相關聯。根據圖I中圖示的實施例，系統1000包括與流體線路54相關聯的閥10。在某些實施例中，用於容納收集流體的裝置包括本體，所述本體限定能夠保持流體或氣體的無菌和/或密閉容器，其中，所述本體還限定適於流體的填充和/或分配的一個或多個埠。在某些實施例中，所述本體限定一個或多個埠，其中，至少一個埠具有閥，例如單向閥。在又一實施例中，所述本體限定包括閥的出口埠。在某些實施例(例如，在下面更詳細地指出的，在洗脫流體流過流動通道7並且細胞流入種植容器18內之後)中，容納在容器13中的收集流體或濾液流過流體管路59和57而流入種植容器18 (圖I中)內。在優選實施例中，流體通過重力的作用遠離於容器13被引導。但是，如本領域的技術人員將容易理解的，也能夠使用流體泵(例如，由Cole-Palmer公司製造的Masterflex L/S數字驅動式螺動泵,但本領域的技術人員能夠從多種商業上獲得的泵中選取)。在某些實施例中，所述系統包括用於容納洗脫流體的裝置。在某些實施例中，所述裝置為容器9，例如能夠被滅菌和/或密封的介質袋、注射器、或者任意柔性或剛性容器。例如，能夠使用Gibco-BFL IL介質袋。在某些實施例中，洗脫流體容器9可以包括能夠被滅菌的任意生物相容性的剛性材料，例如特氟龍、聚碳酸酯、丙烯酸類、PVC或不鏽鋼。容器9能夠具有用於容納洗脫流體的任意合適的體積。在優選實施例中，容器9具有適於流體(例如洗脫流體或洗滌流體)的無菌灌裝和/或分配的至少一個埠。在某些實施例中，洗脫流體能夠為細胞培養介質、鹽水(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水、包括葡聚糖的生理鹽水)、或者由本領域的技術人員已知的用於收穫或培養細胞的任意其他合適的流體(例如乳酸鈉林格溶液、常規生理鹽水、Delbecco公司的改進Eagles培養基、如在國際公布WO 98/045413和WO 05/094914等中所公開的流體等)。在另一優選實施例中，容器9具有至少一個流動埠，例如雙向流動埠。在某些實施例中，容器9包括入口和/或出口。在又一實施例中，容器9包括具有一個或多個閥以容許流體或氣體的單向流動的埠，和/或一個或多個閥的埠與流體線路(與容器9連通)相關聯。根據圖I中圖示的實施例，系統1000包括與流體線路55相關聯的閥8。該閥能夠使用本領域的技術人員已知的任意合適的聯接件或緊固裝置(例如夾具、螺釘或魯爾接頭、壓力配合、摩擦配合、聯接件等)連接到容器9上和/或與流體線路相關聯。洗脫流體或清洗流體流過閥8和流體線路53、流動通道7、流體線路52、56和57並且流入種植容器18 (圖I中)內。在某些實施例中，用於容納洗脫流體或清洗流體的裝置包括本體，所述本體限定能夠保持流體或氣體的無菌和/或密閉容器，其中，所述本體還限定適於流體的填充和/或分配的一個或多個埠。在某些實施例中，所述本體限定一個或多個埠，其中，所述至少一個埠具有閥，例如單向閥。在又一實施例中，所述本體限定包括閥的出口埠。在一個實施例中，容器9是由無菌洗脫流體或清洗流體填充的注射器。洗脫流體或清洗流體流過流動通道7並且流過閥8、流體線路53、52、56和57 (圖I中)而流入種植 容器18內。在本實施例中，流體由於通過按壓注射器柱塞(例如手動地或者經由機械裝置和/或電子裝置)施加到流體上的壓力而被引導遠離容器9。可選地，例如，容器9能夠為可壓縮的柔性容器。但是，如本領域的技術人員將容易理解的，也能夠使用流體泵(例如，由Cole-Palmer公司製造的Masterflex L/S數字驅動螺動泵,本領域的技術人員能夠從多種商業上獲得的泵中選取)。在某些實施例中，所述系統包括用於容納細胞種植組件的裝置。在某些實施例中，所述裝置為種植容器18，例如能夠被滅菌和/或密封的介質袋或任意柔性或剛性容器。例如，能夠使用Gibco-BFL IL介質袋。在某些實施例中，容器18可以包括能夠被滅菌的任意生物相容性的剛性材料，例如特氟龍、聚碳酸酯、丙烯酸類、PVC或不鏽鋼。種植容器18能夠具有任意合適的體積。在某些實施例中，種植容器18可以包括通過任意標準裝置(例如內螺紋和外螺紋)或使用粘接劑被固定且形成防漏的兩個或更多個部段。例如，根據圖I中圖示的實施例，種植容器18包括剛性材料(包括主體部段(包括螺紋)以及螺紋帽17。可選地，根據圖IA中所示的種植容器18的實施例，種植容器包括柔性材料例如袋。為了觀察位於容器18內的支架或移植物(例如血管移植物)，觀察埠可以布置在容器上的任意點或位置處，或者可選地，容器可以由光學透明材料例如聚碳酸酯或PVC製成。在優選實施例中，種植容器18具有適於流體(例如洗脫流體或清洗流體和/或如本文所述的收集或過濾流體)的無菌灌裝和/或分配的至少一個埠。在某些實施例中，容器18包括入口和/或出口。在又一實施例中，容器18包括至少一個入口和出口埠(在圖I和圖3中圖示的實施例中，種植容器18包括入口埠 16、出口埠 24、取樣埠 19 (例如，用於流體樣品從種植容器中的無菌採集，以確定例如微生物汙染和/或幹細胞計量)、以及排放埠 26，其中，所述蓋17 (僅僅圖I)包括埠)。使用圖I和圖3中所示的實施例作為參照，埠 19可以包括swabbable閥，例如無針接入埠。在特別優選的實施例中，出口埠適於細胞種植組件100 (參見圖3)。在某些實施例中，容器18包括具有一個或多個閥以容許流體或氣體的單向流動的入口埠。可選地，或另外地，一個或多個閥能夠與一個或多個流體線路(與種植容器連通)相關聯。該閥能夠使用本領域的技術人員已知的任意合適的聯接件或緊固裝置(例如夾具、螺釘或魯爾接頭、壓力配合、摩擦配合、聯接件等)連接到容器18上和/或與流體線路(與種植容器18連通)相關聯。在優選實施例中，種植容器18包括容許流體灌注和/或循環到容器內且穿過容器的入口埠 16和出口埠 24。入口埠 16和出口埠 24也用來將容器18分別附接到流體線路57和58a上。流體線路58a將種植容器18連接到一個或多個殘留種植細胞流體容器35a和35b上，同時維持封閉系統。應理解，儘管圖I中示出了僅僅一個種植容器18，但是流體線路(例如流體線路57或58a)可以分叉以便將多於一個的種植容器並聯地連接到系統上。可選地，種植容器18還能夠包括至少一個排放口，例如包括如例如在國際公布WO91/017809中公開的至少一個疏水性微孔膜(優選地，設置在殼體中)。例如，在圖I和圖3中圖示的實施例中，排放口 26 (優選地,提供細菌阻擋孔隙等級(pore rating))能夠布置為與至少一個種植容器埠 25連通。在沒有約束到任意特定的理論或機制的情況下，排放口可以容許例如氣體交換，同時衝洗被種植的支架。 在某些實施例中，用於容納種植組件的裝置包括本體，所述本體限定能夠保持流體或氣體的無菌和/或密閉容器，其中，所述本體還限定適於流體的填充和/或分配的一個或多個埠、以及種植組件。在某些實施例中，所述本體限定一個或多個埠，其中，至少一個埠具有閥，例如單向閥。在又一實施例中，所述本體限定出口埠。在某些實施例中，用於容納殘留種植細胞流體的裝置為至少一個殘留種植細胞流體容器35a、35b，例如能夠被滅菌和/或被氣密密封的介質袋或任意柔性或剛性容器。例如，能夠使用Gibco-BFL IL介質袋。在某些實施例中，容器35a、35b可以包括能夠被滅菌的任意生物相容性的剛性材料，例如特氟龍、聚碳酸酯、PVC或不鏽鋼。在優選實施例中，通過使用包括真空源(例如泵)以及調節器28的真空組件，流體經由埠 25和流體線路58a被抽出容器18而進入殘留種植細胞流體容器35a內，其中，來自泵的負壓力通過連接到殘留種植細胞流體容器35a、35b和種植容器18上的流體線路傳輸。在某些實施例中，種植容器18容置包括多孔管20和支架21 (例如，諸如血管移植物支架的細胞或組織支架或移植物)的種植組件100。多孔管20可以包括可以使流體可滲透的任意合適的剛性材料，例如特氟龍、PVC、聚碳酸酯、塑料、金屬例如不鏽鋼。合適多孔管的一個示例性示例為由Porex技術公司製造的多孔塑料管。可選地，多孔管20可以包括能夠擴展和收縮且可以使流體可滲透的任意合適的彈性材料，例如PET或血管成形術球囊。種植容器18和管20均可以形成為任意長度或直徑，以便保持任意長度或直徑的血管移植物支架21。這由於該系統可以用來消毒、種植、培養、存儲、運輸、和測試任意尺寸的血管移植物而是有利的。一個或多個保持元件(例如夾具、ο形環、或扣眼)也可以例如在支架21的兩個端部處布置在管20上，以在種植、培養、存儲、運輸或治療期間將支架保持在管上的位置中。在某些實施例中，多孔管20包括芯棒120a。圖2中圖示了示例性芯棒。參照圖2 :芯棒歧管120的敞開端部126被插入到抽吸杆23上，具有在抽吸杆的封閉端部附近的孔隙124。芯棒隨後例如附著有合適尺寸的聯接環123，其隨後被插入到穿孔芯棒上，並且示例性地，芯棒120a經由一個或多個ο形環22 (圖I中所示)摩擦地保持在種植容器18中。該組件容許流體運動通過芯棒歧管120而進入孔隙124內和離開開口 125。如本文所述，經由與殘留種植細胞流體容器35a、35b連通的真空裝置(例如，泵)，流體經由抽吸杆23從種植容器18中通過芯棒引出，並且通過流體線路58a-58d引導至芯棒120a。在優選實施例中，芯棒120a包括多個孔或穿孔121。但是,應當理解的是,所述穿孔可以為任意所需的尺寸、形狀和/或構型，其能夠以技術人員鑑於本說明書而顯而易見的任意數目的方式變化且由本發明包括和構想。還構想的是，多孔管20能夠為任意期望的長度和/或直徑。例如，直徑可以根據不同的移植物尺寸和/或應用而變化，其由本發明明確地包括和構想。在某些實施例中，種植容器18容納包括多孔管18和支架21的種植組件100。支架能夠為源自自然的，例如胎盤組織，或者合成的。例如，合成細胞和/或組織支架在本領域中是已知的並且是市售的。國際公布WO 09/019995中公開了支架的一個合適示例。在某些實施例中，待使用的支架能夠為由聚合物(均聚物和/或共聚物)纖維形成的三維基體，其以織造或非織造網、以隨機或對齊構型的方式組裝。在優選實施例中，支架的纖維基體包括 合適尺寸的孔，以使細胞能夠附著和生長和/或分化。由於細胞的直徑為大約10 μ m至大約20 μ m，因此在該範圍內的孔徑在某些實施例中是期望的。另外，由本發明提供的聚合物支架能夠被產生或製造，以更緊密地模仿天然的細胞外基體的結構和組合物以促進種植細胞的生長和分化，並且促進支架或在支架上生長的細胞的運輸和/或植入。包括支架基體的纖維能夠為任意期望的尺寸，但是通常介於大約I. 5mm與Inm之間。在某些實施例中，纖維為納米級(即，從大約Inm至大約IOOOnm)和/或微米級(從大約I μ m至大約1000 μ m)。在某些實施例中，本發明的支架另外地包括能夠促進細胞的生長和/或分化的一個或多個生長因子。用於對生成在本發明中使用的支架有用的聚合物可以為無機的(例如，矽氧烷、鏈硫、黑磷、硼-氮、聚矽氧烷)或有機的(指的是含有碳)。有機聚合物可以是天然的[例如，多糖，例如澱粉、纖維素、果膠、海藻膠、植物膠；多肽，例如酪蛋白、白蛋白、球蛋白、角蛋白、膠原蛋白、胰島素、DNA ;和烴類]，合成的[例如熱塑性塑料(未硫化的彈性體、尼龍、聚氯乙烯、線性聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚氨酯、丙烯酸酯樹脂)；熱固性的(例如，硫化彈性體、交聯聚乙烯、酚醛樹脂、醇酸樹脂、聚酯)，以及半合成的(例如，纖維素，如人造絲、甲基纖維素、醋酸纖維素；以及改性澱粉)]。另外，本發明中有用的支架可以包括由水溶性或水不溶性的纖維素化合物形成的水凝膠。如將由技術人員容易理解的，支架的特定類型和構成將取決於期望的應用而變化。但是，通常優選的是包括支架的聚合物材料為生物相容性的(即，將不會引起不期望的免疫反應)。在某些實施例中，支架是可生物降解的。在任一實施例中，可降解的聚合物從由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、或聚己內酯、聚醯胺、多糖和膠原蛋白構成的組中選取。在優選實施例中，該聚合物為聚(乳酸-乙醇酸)。在本文所述的任一實施例中，支架能夠布置到位於種植組件中的多孔管(例如如本文所述的芯棒)的附近。例如，構想的是支架可以與多孔管的僅僅一部分相接觸。可選地，構想的是支架可以基本上包圍多孔管中的一些或全部。通常，優選的是所述支架與多孔管的穿孔部分並列或相鄰，使得流體儘可能多地流過支架，以有利於種植儘可能多的細胞。
根據本發明的實施例，例如包括種植組件(包括多孔管((優選地，芯棒和支架))的多個種植容器能夠被預組裝，例如用於不同尺寸的移植物和/或不同的應用，並且當需要時組裝為系統的一部分。典型地，例如，種植容器被預組裝和消毒，並且能夠例如通過無菌對接而無菌連接到系統的其餘部分上。因此，最佳系統能夠在需要時被快速地設置。在另一優選實施例中，流動通道設置在細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫或清洗流體容器與種植容器之間。這種構型由圖I示例。在又一實施例中，流動通道與上述中的每一個選擇性地流體連通。在實施例中，殼體包括流動通道，包括入口、出口、和過濾器，所述過濾器包括至少一個過濾器介質，例如，多孔白細胞去除介質(例如，在優選實施例中，流動通道包括過濾器裝置，其包括殼體，所述殼體具有入口和出口，並且限定介於入口與出口之間的流體流動路徑；以及過濾器，所述過濾器包括設置在所述殼體中的橫過流體流動路徑的至少一個多孔過濾器介質。在另一實施例中，所述殼體包括流動通道、入口、出口和介於它們之間的過濾器、以及閥。在某些實施例中，閥具有至少一個敞開位置和至少一個封 閉位置。在任意優選實施例中，由本發明所提供的系統包括容許流體和/或氣體流過其中的流動線路。因此，在優選實施例中，本發明提供了用於種植、培養、存儲、運輸和/或測試細胞或組織移植物的系統，所述系統包括細胞分離流體容器、設置在所述細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫流體容器和種植容器之間的流動通道，其中，所述流動通道包括入口、出口和介於它們之間的過濾器，其中，所述過濾器適於沿至少兩個方向流動，並且其中，所述流動通道分別與細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫流體容器和種植容器中的每一個流體連通；並且其中，所述種植容器包括種植組件。在一個實施例中，所述種植組件包括穿孔芯棒和設置在所述芯棒的至少一部分附近的生物相容性三維支架。在又一實施例中，所述系統包括至少一個殘留種植細胞流體容器，其中，所述殘留種植細胞流體容器與所述種植容器選擇性地流體連通。在另一實施例中，所述系統包括與所述殘留種植細胞流體容器流體連通的真空源。如本文所述的系統的示例性實施例(參見圖I、圖2和圖3)容許源自骨髓的單核細胞的分離，並且，在維持無菌系統的同時，或者在維持封閉無菌系統的同時，將細胞種植在生物相容性的三維支架上，其在短暫時段的潛育期(例如，大約三(3)小時或更少，更優選地，大約兩(2)小時或更少)後能夠用作組織工程血管移植物。如將由本領域的技術人員根據本發明的實施例理解的，能夠在維持無菌系統的同時使用所述系統，其中，無菌種植容器能夠使用在無菌領域中的無菌技術例如手術室(使用無菌手套以處理部件)進行組裝(例如，使用期望的多孔管和支架)。被組裝的種植容器能夠連接到所述系統的其他部件上，例如，其中細胞分離流體容器、洗脫容器和收集容器已經以封閉無菌方式預組裝。可選地，且優選地，能夠在維持無菌系統的同時使用所述系統，其中，所述系統已經在使用之前預組裝且被消毒。在某些實施例中，所述系統是一次性的。封閉的一次性系統容許用於構建組織工程移植物(例如血管移植物)的手術，當與先前所述方法進行比較時，其能夠在實現相似的種植效率的同時被快速地執行。參見例如松村G (Matsumura G)、日比野N (Hibino N)、Ikada Y、黑澤明H (Kurosawa H),Shinoka T。組織工程血管自體移植物的成功應用臨床經驗。生物材料2003; 24:2303-8 JPFDA IDE 14127，其全部的內容通過參引的方式併入本文。另外，如本文所述的系統的使用提供了在護理點(即，在手術室中)構建組織工程移植物(例如血管移植物)的機會，從而排除了用於支架運輸的需求。如本文所述的用於將細胞種植到三維支架上的無菌或封閉系統結合細胞分離過濾器、真空種植和容器(例如，袋)技術以用於以先前未描述的方式在組織工程中使用。這種技術的優點包括其容許在不需要無菌罩或ISO第7類室的情況下組裝組織工程構造，通過排除對這種設備或設施的需求而顯著減小用於生成組織工程產品的成本，同時增大組織工程產品的使用的臨床效用。另一優點是其以比先前可能的更短時間提供移植物。III.示例性方法 可以根據本公開的示例性方法獲得具有源自骨髓的單核細胞的組織工程血管移植物。參照圖1，在另外的方面，本發明提供了用於將細胞種植到支架上的方法，所述方法包括例如設置根據本文所述的任一方法的細胞種植系統，其中，至少一個閥分別設置在細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫流體容器和種植容器中的每一個與流動通道之間，並且其中，第一階段由僅與所述細胞分離流體容器和所述收集流體容器流體連通的流體通道限定，將流體流動沿第一方向從所述細胞分離流體容器引導到收集流體容器中，其中，將來自細胞分離流體的細胞保持在過濾器上，封閉至少一個閥，使得流動通道不與所述收集流體容器或所述細胞分離流體容器流體連通，其中，第二階段由僅與所述洗脫流體容器和所述種植容器流體連通的流動通道限定；將洗脫溶液的流動沿與所述第一方向大致相反的方向從所述洗脫流體容器引導通過流動通道過濾器，使得細胞基本上從過濾器中移除並且流入種植容器內；並且通過將流動引導通過生物相容性的三維支架和穿孔芯棒而進入殘留種植細胞流動容器內將流體從種植容器中移除，從而，位於種植容器中的細胞的至少一部分被種植到支架上。在一個實施例中，流體通過例如_20mmHg(或者比位於流動通道2中的過濾器的起泡點小的另一合適的值)的真空從種植容器中移除，所述真空被應用直到所有細胞懸浮液已經流過支架並且收集在殘留種植細胞流體容器35a、35b中為止。在另一實施例中，所述殼體包括流動通道，包括入口、出口和過濾器。在另一實施例中，所述殼體包括流動通道、入口、出口和介於它們之間的過濾器、以及閥。在某些實施例中，所述閥具有至少一個敞開位置和至少一個閉合位置。因此，在另一實施例中，並且總體參照圖I中所示的示例性系統1000 (其中，圖3中所示的種植組件18也能夠在系統中使用),所述方法包括將骨髓抽吸物(例如，5cc/kg體重)無菌地收集到容器3內，其中，至少閥51是關閉的(典型地，一個或多個閥6、7、8、10和15也被關閉)。夾具5和10被打開，並且利用重力的作用，使骨髓抽吸物流動(經由流體線路51和52)通過流動通道7的過濾器，過濾器捕獲源自骨髓的單核細胞。骨髓抽吸物的剩餘部分(典型地，主要包括血漿)被收集(經由流體線路53和54以及埠 11)在收集流體容器13中。接著，夾具5和10被關閉，閥8和6被打開，並且洗脫溶液流動(經由流體線路55和53)通過過濾器7，從而釋放源自骨髓的單核細胞，這些細胞流過流體線路52、56和57以及埠 16，並且被收集在種植容器18中。種植容器18容納種植組件100，包括被插入到穿孔多孔管20/芯棒120a上的支架21。在優選實施例中，源自骨髓的單核細胞懸浮液填充種植容器18，從而完全覆蓋被插入到穿孔芯棒20上(圖IA示出了與支架相接觸的細胞懸浮液)的支架21。接著，閥6和10被關閉，並且閥27被打開，並且使用真空組件(包括調節器28)的真空(例如，-20mmHg)被施加，直到所有細胞懸浮液已經流過支架並且經由埠 24和流體線路58a收集在殘留種植細胞流體容器35a中(如果存在過多的流體，則經由流體線路58b將另外的細胞懸浮液收集在殘留種植細胞容器35b中)。在真空停止之後，閥27優選地被關閉，閥15被打開，並且容許容器13中的血清通過重力的作用經由流體線路59和57以及埠 16排放到種植容器18內，從而衝洗所種植的支架。如果可選的排放口 26被包括作為種植容器18的一部分，則可以例如在衝洗期間發生氣體交換。若需要，例如，為了在細胞被衝洗的同時易於處理種植容器和/或種植容器部件(例如，芯棒和/或支架)，位於種植容器18上遊的一個或多個系統部件，例如過濾器7、 洗脫容器9、收集容器13和/或細胞分離流體容器3能夠被移除(例如，在熱密封適當流體線路之後)且被棄用。作為另外的選項，整個裝置被布置在培育箱中(例如大約10%-100%的溼度、35°C 37°C的溫度、具有3%-5%的CO2)大約兩小時，在此之後，被種植的支架能夠從容器中被無菌地移除(例如，在移除蓋17 (圖I)之後或者在切開柔性容器(圖3)之後)並且用作組織工程血管移植物。IV.示例性套件在另外的方面，本發明提供了套件，所述套件包括至少一個容器，其包括根據本文所述實施例中的任一個的系統或裝置；以及其使用的指示。V.示例應當理解的是，本發明的示例性實施例不應當理解為限制於在本文所述的示例；事實上，本發明的示例性實施例應當理解為包括本文所提供的任一個和所有應用，並且包括在技術人員的技術領域內的所有改變。VI.通過參引的方式併入在本申請中前後引述的所有參考文獻、專利、待審專利申請、公布的專利申請和公布的專利的全部內容通過參引的方式明確併入本文。VII.等同本領域的技術人員使用不多於常規的實驗將理解或能夠確定本文所述發明的具體實施例的很多等同。這些等同意為由下面的權利要求包括。應當理解的是，本文所述的詳細示例和實施例作為用於僅示例性目的的示例給出，並且絕非視為限制本發明。對於其的多種修改或變化對本領域的技術人員是顯而易見的並且被包括在本申請的精神和和範圍內，並且視為落在所附權利要求的範圍內。例如，成分的相對量可以變化以優化期望的效果，另外的成分可以被添加，和/或相似的成分可以被替代用於所述成分中的一個或多個。另外的優點和特徵以及與本發明的系統、方法和過程相關聯的功能從所附權利要求中變為明顯。此外，本領域的技術人員使用不多於常規的實驗將認識到或能夠確定本文所述發明的具體實施例的很多等同。這些等同意為由下面的權利要求包括。
權利要求
1.一種用於種植細胞的系統，包括 細胞分離流體容器； 流動通道，所述流動通道設置在細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫流體容器以及種植容器之間，其中，所述流動通道包括入口、出口和介於所述入口和所述出口之間的過濾器； 其中，所述過濾器適於容許沿至少兩個方向的流動，並且其中，所述流動通道分別與所述細胞分離流體容器、所述收集流體容器、所述洗脫流體容器和所述種植容器中的每一個選擇性地流體連通；並且其中，所述種植容器包括細胞種植組件。
2.如權利要求I所述的系統，其中，殼體包括所述流動通道、入口、出口和介於所述入口和所述出口之間的過濾器。
3.如權利要求I所述的系統，其中，所述種植容器還包括排放口。
4.如權利要求3所述的系統，包括封閉系統，其中，所述系統還包括至少一個殘留種植細胞流體容器，其中所述殘留種植細胞流體容器與所述種植容器選擇性地流體連通；以及真空源，所述真空源與所述殘留種植細胞流體容器流體連通。
5.如權利要求I所述的系統，其中，所述種植容器包括螺紋本體和螺紋帽。
6.如權利要求I所述的系統，其中，所述種植容器包括柔性袋。
7.如權利要求I所述的系統，包括封閉系統。
8.如權利要求I所述的系統，其中，所述種植容器包括穿孔芯棒以及設置在所述芯棒的至少一部分附近的生物相容性三維支架。
9.如權利要求8所述的系統，其中，所述生物相容性三維支架為可生物降解的。
10.如權利要求9所述的系統，其中，所述生物相容性三維支架包括聚合物纖維基體。
11.如權利要求10所述的系統，其中，所述纖維包括從由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚(聚己內酯)、聚醯胺、聚乙烯基聚合物或共聚物、多糖、膠原蛋白及其組合構成的組中選取的至少一種聚合物。
12.如權利要求11所述的系統，其中，所述纖維包括聚-I-(丙交酯酸)。
13.如權利要求I所述的系統，其中，所述系統包括多個種植容器。
14.如權利要求13所述的系統，所述多個種植容器與歧管選擇性地流體連通，所述歧管與所述流動通道選擇性地流體連通，並且包括入口、閥、和多個出口，並且其中，所述歧管適於將流體和/或氣體基本等同地分布到每個種植容器中。
15.如權利要求8所述的系統，其中，所述支架為組織移植物，所述組織移植物能夠促進在移植物上的三維組織生長。
16.如權利要求15所述的系統，其中，所述組織移植物為可植入的血管組織移植物。
17.如權利要求16所述的系統，其中，所述血管組織移植物包圍所述芯棒的至少一部分。
18.如權利要求I所述的系統，包括封閉系統，其中，所述細胞分離流體為無菌的。
19.如權利要求I所述的系統，包括封閉系統，其中，所述洗脫溶液為無菌的。
20.如權利要求4所述的系統，其中，所述細胞分離流體容器、所述洗脫流體容器、所述收集流體容器、所述種植容器和所述殘留細胞流體容器中的每一個包括入口和出口。
21.一種用於將細胞種植到支架上的方法，包括設置如權利要求4所述的系統，其中，至少一個閥分別設置在細胞分離流體容器、收集流體容器、洗脫流體容器和種植容器中的每一個與流動通道之間，並且其中，第一階段由僅與所述細胞分離流體容器和所述收集流體容器流體連通的流體通道限定； 將流體的流動沿第一方向從所述細胞分離流體容器引導到所述收集流體容器，其中，來自所述細胞分離流體的細胞被保留在所述過濾器上； 關閉至少一個閥，使得所述流動通道不與所述收集流體容器或所述細胞分離流體容器流體連通，其中，第二階段由僅與所述洗脫流體容器和所述種植容器流體連通的流動通道限定； 將所述洗脫溶液的流動沿與所述第一方向大致相反的方向從所述洗脫流體容器引導通過所述流動通道過濾器，使得細胞被基本從所述過濾器中移除並且流入所述種植容器內；並且 通過將流動通過所述生物相容性三維支架和所述穿孔芯棒引導到所述殘留細胞流體容器內而將流體從所述種植容器中移除，其中位於所述種植容器中的細胞的至少一部分種植到所述支架上。
22.如權利要求21所述的方法，其中，所述方法在移除位於所述種植容器中的流體之前包括 關閉介於所述流動通道與所述洗脫流體容器之間的閥，其中，第三階段由僅與所述流動通道和/或所述種植容器流體連通的所述收集流體容器限定；以及將流體的流動從所述收集流體容器引導到所述種植容器。
23.如權利要求22所述的方法，其中，在所述第一階段、所述第二階段或所述第三階段的至少一個中的流體的流動是由於重力的作用。
24.如權利要求21所述的方法，其中，所述流體通過真空從所述種植容器中移除。
25.如權利要求21所述的方法，其中，殼體包括所述流動通道、入口、出口、和介於所述入口和所述出口之間的過濾器。
26.—種用於培養細胞的封閉系統,包括 用於容納細胞分離流體的第一裝置； 用於引導流體流動的設置在所述第一裝置之間的第二裝置； 用於收集流體的第三裝置； 用於容納洗脫流體的第四裝置；以及 用於容納細胞種植組件的第五裝置，其中，所述第二裝置包括過濾器； 其中，所述過濾器適於容許沿至少兩個方向的流動，並且其中，所述第二裝置分別與所述第一裝置、所述第三裝置、所述第四裝置和所述第五裝置中的每一個選擇性地流體連通，並且其中，生物相容性三維支架設置在所述第六裝置的至少一部分的附近； 用於容納殘留種植細胞流體的第七裝置，所述第七裝置與所述第五裝置流體連通；以及 用於移除殘留種植細胞流體的第八裝置，所述第八裝置與所述第七裝置流體連通，並且其中，所述第一裝置、所述第二裝置、所述第三裝置、所述第四裝置、所述第五裝置、所述第六裝置、所述第七裝置和所述第八裝置中的每一個通過第九裝置相連以促進流體流動。
27.如權利要求26所述的封閉系統，其中，所述第一裝置、所述第三裝置、所述第四裝置、所述第五裝置、所述第七裝置、所述第八裝置或其組合中的至少一個為柔性或剛性塑料容器。
28.如權利要求26所述的封閉系統，其中，所述第九裝置包括柔性或剛性流體線路，以及容許介質穿過其中的選擇性流動的至少一個閥。
29.如權利要求26所述的封閉系統，其中，所述第六裝置為穿孔芯棒。
30.如權利要求29所述的封閉系統，其中，所述生物相容性三維支架為可生物降解的。
31.如權利要求28所述的封閉系統，其中，所述生物相容性三維支架包括聚合物纖維基體。
32.如權利要求29所述的封閉系統，其中，所述纖維包括由聚(乳酸-乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(原酸酯)、聚(磷腈)、聚(聚己內酯)、聚醯胺、聚乙烯基聚合物或共聚物、多糖、膠原蛋白、以及其組合構成的組中選取的至少一種聚合物。
33.如權利要求32所述的封閉系統，其中，所述纖維包括聚-I-(丙交酯酸)。
全文摘要
提供了用於便利的和無菌分離、收集細胞和將細胞種植到支架或組織移植物上的系統。所述系統可以為封閉的。還提供了用於使用用於分離、收集和種植細胞的公開系統的方法以及產生組織工程血管移植物的方法。所述系統可以以套件被提供以用於有效的和迅速的使用。
文檔編號C12N1/12GK102884172SQ201080066662
公開日2013年1月16日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者C·布魯爾, E·L·斯奈德, K·沙菲, M·A·史密斯 申請人:耶魯大學, 帕爾公司