一種獲得栽培菊花與近緣屬間遠緣雜種的方法

2023-05-12 14:07:01 2

專利名稱：一種獲得栽培菊花與近緣屬間遠緣雜種的方法
技術領域：
本發明一種獲得栽培菊花與近緣屬間遠緣雜種的方法，涉及原產中國的栽培 菊花品種和近緣屬物種用於菊花種質創新、品種改良和新品種選育的方法，屬於 生物技術育種領域。二、 背景技術菊花IX)em/raW/zewa won/o"w附]又名鞠秋、鞠、菊華、女華、黃花、茱英、 金英、帝女花等，原產我國，是中國十大傳統名花和世界四大切花之一，也是世 界上最重要的觀賞花卉之一，距今已有1600多年的栽培歷史，由毛華菊、野菊 和紫花野菊等天然雜交並經人工長期選育而成(Chen， 1957; Chen， 1985)。唐朝 時期，中國菊花經朝鮮傳入日本，17世紀中葉始，中國菊花傳入荷蘭、法國、 英國等歐美國家。菊花盛開於秋季花少時節，而且花期長達一個月以上，給眾花 凋零的秋日園林帶來了璀璨的美；也使我們十一、十二月的寒冷季節充滿了花卉 的芬芳，因此它在觀賞園藝領域有著特殊重要的地位，特別值得花卉育種家的注 意。目前，我國選育的菊花品種約有4000多個，全球品種總數在2萬之上(陳 俊愉，2001)，是世界上商品產值最高的花卉(Boaes， 1997)。菊花不僅在切花 和盆花中具有十分重要的地位，而且在露地栽培中也起到了越來越大的作用，因此加強菊花育種具有很高的經濟效益和社會效益。近年來，國內外研究者在菊花育種方法上，採用了自然雜交、人工雜交、芽 變選種、輻射誘變、組織培養、衛星搭載太空誘變、轉基因、單細胞培養突變育 種等方法。國內外研究文獻表明，目前絕大部分菊花品種都是經人工雜交育成， 種間遠緣雜交也已開始用到育種上。遠緣雜交是研究菊花及其它園林植物起源和 進化的重要途徑，也是創造園林植物新類型和獲得有價值的新品種的有效方法 (孟金陵，1997)。隨著園林植物育種工作的深入，屬內的遺傳資源利用日益枯 竭，同時也發現某些優良性狀的基因庫貧乏，採用屬內資源進行常規育種實踐難 以取得突破，到屬外尋找優良的基因資源，通過採用現代生物技術手段開展屬間 遠緣雜交，打破屬間隔離，實現有利基因的轉移，將其它屬的有益性狀(如抗逆 性、抗病蟲能力強等)的基因資源導入栽培菊花中，對於菊花及其它園林植物育 種，具有重要意義。菊花屬間雜交工作近年來也取得了一定進展。1978年，Tanaka等曾發現春 黃菊族(Anthemidinae)多數屬間雜交親和性很高，柴田道夫(1988)利用日本亞 菊屬的磯菊[4/"m'" /^c折cwm]與從荷蘭、美國引來的Spray型日中性的菊花品種 雜交成功育出了耐熱的切花優良品種'Summer Queen，； 1989年，荷蘭De Jong 和Rade Marker利用磯菊育出了切花和盆栽類的商品菊。之後，Douzono等(1998) 又利用鹽菊[A W/wog汰M]開展了培育抗病切花菊的研究，而且得到了很多雜交後 代和回交後代。 一分布於我國的菊屬近緣屬主要有短舌菊屬Brac/zcm決ewww、亞菊屬4/am'a、 蒿屬爿故附/s/a 、 芙蓉菊屬 Omsos譁/n'調、梓節蒿屬iVeop"〃"w'a 、 茼蒿屬3C/ o^^/^m,等。這些近緣屬植物多為野生種，具有許多栽培品種所缺乏的優 異性狀，如長期的自然選擇下進化出的較好的抗病蟲性、抗逆性和某些特異的觀 賞價值等。例如，蒿屬和茼蒿屬植物多數種類含揮髮油、脂肪、有機酸及生物鹼， 主要成分為聚己炔類(polyacetylenes)、黃酮類(flavonoids)、砲類(terpenoids) 及其他化合物，如倍半萜內酯類(sesquiterpene lactones)等，許多種類入藥，為 重要或常用的藥用植物。尤其是含有的萜類物質，有較強的殺蟲和抑菌作用。 Furuta (2004)曾將菊花和大籽蒿(A ivw^mfl)進行原生質融合，得到的後代有 23株開花，並具有較強的抗銹病能力。近緣野生種不僅含有豐富的抗性基因， 很多種類還有獨特的觀賞價值，如亞菊屬的磯菊，葉片被濃密的白色表皮毛，使 葉片看上去呈現銀色；蒿屬黃金艾蒿的葉片表面有大小不一、不規則的黃色或白 色斑點，看上去呈現金黃色。和常見的綠色葉片相比，這些特異的葉形葉色往往 會給人賞心悅目的視覺享受。與國外相比，我國有豐富的菊屬近緣屬植物種質資源，但在近緣屬種質資源 的研究和開發利用方面還相當薄弱，僅有零星報導，許多物種的優良性狀，特別 是各種抗性基因尚未得到充分挖掘和利用，亟待重視和加強。如果能夠克服栽培 菊花和近緣屬物種的遠緣雜交障礙，把近緣屬物種抗病蟲的性狀(基因)或優異 的觀賞性狀轉移到栽培菊花中，則有望獲得具較強抗病蟲能力或特異觀賞性狀的 菊花新種質，實現栽培菊花的品種改良，將是我國菊花育種(尤其是抗病蟲育種 和抗逆育種)取得重要突破的關鍵所在。三、發明內容技術問題本發明的目的是針對目前菊花資源遺傳基礎狹窄尤其是抗性較 弱這一現狀，提供一套利用現代生物技術克服遠緣雜交障礙，獲得栽培菊花與近 緣屬間遠緣雜種的方法，以達到擴大菊花基因庫、引進野生植物中優異性狀(基 因)的目的，形成一套菊花種質創新、品種改良和新品種選育的技術。技術方案本發明利用克服遠緣雜交障礙獲得栽培菊花與近緣屬間雜種的 方法，包括1)栽培菊花與近緣屬間遠緣雜交後代材料的獲得選擇菊屬栽培菊花["e"(ira"Aew" mw7/o"wm]和近緣屬物種(如亞菊屬磯菊[4/""/a JW"y CW附]、蒿屬黃金艾蒿[」We附Z'57V7 Vw/gfl 7'51]、茼蒿屬白晶菊[C7zr少saw^zemw附/7a/Mt/asi/附]及芙蓉菊屬芙蓉菊[Oawo5fep/H'Mm c/ /wewse]等)，於溫室內進行雜交，以栽培菊花為母本進行人工去雄並套袋隔離，以近緣屬物種為 父本在筒狀花散粉前套袋，於上午9~10時或下午3~4時授粉，同一花序重複授 粉2次；接種時取雜交授粉後15 18d的頭狀花序，剝取邊緣舌狀花的子房，在超淨 工作檯上依次開展以下操作用體積比為75%的乙醇浸泡30s，質量百分比為 0.1%的升汞溶液消毒6min，無菌水衝洗4~5次；用接種針將子房內的胚珠剝出，接入MS添加激動素KT 2.0 mg丄"+生長素 IAA1.0 mg'I/1或者添加細胞分裂素6-BA2.0 mg丄"+生長素NAA 0.5 mg'L"的培 養基上，每瓶接種胚珠10個，每處理重複20-30瓶，誘導愈傷組織形成；30d後轉入分化培養基，分化培養基為MS +細胞分裂素6-BA2.0 mg丄"+生長素NAAO.l mg丄—1，誘導愈傷組織分化出苗；得到幼苗後轉入MS +細胞分裂素6-BA0.2 mg七"的培養基中進行擴繁和繼 代培養，幼苗移至1/2MS添加生長素NAA0.1 mg丄"的培養基上生根，培養溫 度為23士2'C，光照周期為141rd—、光照強度為1 600-2 000 lx，即可獲得菊屬栽 培菊花與近緣屬物種屬間遠緣雜交後代的無菌苗；2)屬間雜種的獲得對獲得的後代材料經煉苗移栽後進行雜種形態學鑑定和基因組原位雜交 (Genomic wYw hybridization, GISH )鑑定，其中對後代材料進行形態學鑑定，選擇形態學特徵在株高、冠徑、分枝性、葉片、 花序、表皮毛等方面出現介於雙親之間、與母本不同、父本特異性狀或父母本都 不具備的新性狀的植株，以雙親之一的總DNA用螢光素標記後作為探針，進行 分子原位雜交鑑定；經原位雜交鑑定後體細胞內含有分別來源於雙親基因組的後 代材料，即為獲得的菊屬栽培菊花與近緣屬物種的屬間雜交種。有益效果本發明提供的克服遠緣雜交障礙獲得菊屬與近緣屬遠緣雜種的 方法，與現有技術相比具有如下優點和積極效果(1) 本發明利用菊屬近緣屬物種結合現代生物技術進行菊花育種研究， 克服了菊屬與近緣屬的遠緣雜交障礙，拓寬了菊花育種的思路和領域，擴展了栽 培菊花的遺傳基礎，實現了菊花的種質創新。(2) 在組織培養技術上比較了不同培養基、不同激素配比、不同胚胎髮 育時期等的培養效果，獲得了最佳接種時期和培養基配比。篩選出培養胚齡以 15 18 d最好，愈傷誘導培養基以MS添加激動素KT 2.0 mg丄"+生長素IAA1.0 mg'L"或者添加細胞分裂素6-BA2.0 mg'L"+生長素NAA0.5 mg'L"效果最好。(3) 結合利用形態學和分子原位雜交方法對屬間雜種進行鑑定，結果真 實可靠。(4) 獲得了一批具有較強抗病蟲能力的栽培菊花與近緣屬物種的屬間雜 種，實現了栽培菊花的品種改良，生態效益和社會效益顯著。(5) 在本發明基礎上，使利用創新的菊花種質進一步開展菊花育種成為 可能，同時可利用雜交後代進行菊屬與近緣屬的染色體組分析、起源演化及親緣 關係研究等，有重要的理論意義和現實意義。四

圖1、鐘山金桂X黃金艾蒿雜種與親本的形態學和原位雜交比較鑑定 A-C:盛花期植株形態，標尺40cm。 (A):鐘山金桂；(B):鐘山金桂X黃金 艾蒿；(C):黃金艾蒿。D-F:表皮毛形態比較，標尺=25(^111。 (D):鐘山金桂； (E):鐘山金桂X黃金艾蒿；(F):黃金艾蒿。G:鐘山金桂(左)、鐘山金桂 X黃金艾蒿(中)和黃金艾蒿(右)的葉形態比較，標尺4cm。H:鐘山金桂 (左)、鐘山金桂X黃金艾蒿(中)和黃金艾蒿(右)的花序形態比較，標尺4cm。 I:鐘山金桂(左)和鐘山金桂X黃金艾蒿(右)的舌狀花形態比較，標尺=5皿。 J:鐘山金桂(左)和鐘山金桂X黃金艾蒿(右)的筒狀花形態比較，標尺二5mm。K:鐘山金桂的染色體有絲分裂中期形態(2n=6x=54)，標尺=3|^。 L:黃金艾 蒿的染色體有絲分裂中期形態(2n=4x=36)，標尺=3|^111。 M-O:鐘山金桂X黃金 艾蒿的染色體螢光原位雜交，標尺=5^1111。其中M代表有絲分裂中期，紅色是鍾 山金桂染色體(27條)，黃色是黃金艾蒿染色體(18條)；N和O分別是間期和 前期，注意來自不同親本的染色體(質)在核空間分布上的區域性。五具體實施方式
本發明所提供的利用胚珠培養獲得菊屬與近緣屬遠緣雜交後代和雜種鑑定的方法，其具體實施方式
如下1.菊屬與近緣屬屬間雜交後代材料的獲得 1.1材料選擇選擇菊屬栽培菊花如'奧運火炬'、'鐘山金桂'、'鐘山紫桂'、'寒小白'等品種(中國菊花研究網，http:〃www.chrysanthemum.cn)作為母本，以近緣屬物 禾中如亞菊屬磯菊[4/a"/a/wc折cw附]、蒿屬黃金艾蒿[Jrfe附/w'" ra/ga〃XI、茼蒿屬白 晶菊[C7w75^w決e附wm pa/wi/oyww]及芙蓉菊屬芙蓉菊[Oawosfe/ /^ww c/w'"e"se]等作為父本。所選擇的近緣屬物種有較強的抗病蟲能力或者特異的觀賞價值，有的 己經在園林綠化領域有了栽培應用。以上材料全部種植在南京農業大學"中國菊 花種質資源保存中心"，可對外銷售。 1.2雜種幼苗獲得於溫室內進行雜交，以栽培菊花為母本進行人工去雄並套袋隔離，以近緣 屬物種為父本在筒狀花快開時套袋，於上午9~10時或下午3~4時授粉，同一花 序重複授粉2次。雜交後採用組織培養手段進行雜種胚的離體培養以克服遠緣雜 交障礙。接種時取雜交授粉後15-18 d的頭狀花序，剝取邊緣舌狀花的子房，在 超淨工作檯上依次開展以下操作用體積比為75。/。的乙醇浸泡30s，質量百分比 為0.1%的升汞溶液消毒6min，無菌水衝洗4~5次後用接種針將子房內的胚珠剝 出，接入MS添加激動素KT 2.0 mg丄"+生長素IAA1.0 mg'I/1或者添加細胞分裂 素6-BA2.0 mg丄"+生長素NAA0.5 mg'I/1的培養基上，每瓶接種胚珠10個，每 處理重複20-30瓶，誘導愈傷組織形成；30d後轉入分化培養基，誘導愈傷組織 分化出苗，分化培養基為MS +細胞分裂素6-BA2.0 mg丄"+生長素NAA 0.1 mg七-1。得到幼苗後轉入MS +細胞分裂素6-BA 0.2 mg'U1的培養基中進行擴繁 和繼代培養，待苗到一定數量後接種在1/2MS添加生長素NAA 0.1 mg七—i的培 養基上生根。培養溫度為23士2"C，光照周期為14h'd"，光照強度為1 600~2 0001x， 即可獲得菊屬栽培菊花與近緣屬物種屬間雜交後代的無菌苗。2.菊屬與近緣屬屬間雜種的獲得2.1雜種形態學鑑定將雜交父母本及後代材料於4月份同時定植在田間，6月起開始對雜交父母 本及後代材料的形態學進行觀察與統計，後代材料的莖、葉、花序、表皮毛等形 態學特徵介於雙親之間、與母本不同、出現父本特異性狀或雙親不具有的新性狀， 即可初步判定其為真雜種。性狀登記均按李鴻漸(1993)標準(李鴻漸，邵建文. 《中國菊花》.南京江蘇科學技術出版社，1993,4)進行，花色以英國皇家園藝 學會的色譜為標準(Color chart, the Royal Hort. Culture Society, London, 1996)。 表皮毛形態是用尖頭鑷子撕取葉片表皮在體視顯微鏡下觀察並照相。依據雜交父 母本及後代的表現型對所得的可能的雜種植株進行鑑定。2.2原位雜交鑑定方法對經形態學鑑定後的材料進行DNA原位雜交鑑定，如果後代材料的細胞內 含有分別來源於雙親的基因組，即可判定其為真雜種。原位雜交技術流程為(1) 採用CTAB微量法提取親本的總DNA (鄒喻萍等，系統與進化學中的 分子標記[M]，科學出版社，2001: 9-17), Lambda DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA濃度和質量，最後將濃度調至200 ng^L-1 。(2) 用缺刻平移法(NickTranslation)標記雜交用DNA探針在PCR管中依次加入ddH2O20nl、 10xbuffer、 dNTP、 Template DNA (父本或母本DNA均可)、Fluorescein-12-dUTP、 DNase I和DNA聚合酶I (1:1200稀釋)各5(il，混勻後離心，置入PCR儀中15。C兩小時後加入5pl終止緩衝液0.5MEDTA，置一20。C 冰箱中保存備用。(3) 製片準備製片置超低溫(-70。C)冰箱3-4小時或過夜，冰凍揭片後 用100%ETOH脫水，室溫下晾乾後用70%甲醯胺在80 。C變性，在室溫下晾乾備用o(4) 配雜交液(15 nl/slide): PCR管中依次加入d.d.H20 (lul/slide)、 dFA (7.5n區de)、 20xSSC (lnl/slide)、 Salmon sperm DNA (0.5|al/slide)、 DNA probe(2nl/slide)和50%Dextran sulfate (3pl/slide)，混勻後備用。(5) 雜交將雜交液滴於製片上，蓋上蓋玻片，將製片放在墊有溼潤濾紙 的保鮮盒內放在黑暗的37°C恆溫箱內過夜。(6) 雜交後洗滌在42。C水浴鍋中預熱2xSSC和FA,移去蓋玻片在其 中洗脫未雜交的DNA探針，氣乾片子。(7) 套染探針用螢光綠標的用PI (碘化丙啶)染，探針用螢光紅標的用 DAPI染(雙色原位雜交也用DAPI染)。(8) 觀察與照相在避光處用螢光顯微鏡觀察並照相。實施實例應用本方法先後開展了栽培菊花品種與多個近緣屬物種的屬間遠緣雜交試驗，並獲得了一系列遠緣雜交種，如'奧運火炬'x磯菊(亞菊屬)、'鐘山金桂，X黃金艾蒿(蒿屬)、'鐘山紫桂'X白晶菊(茼蒿屬)、'寒小白' X芙蓉菊(芙蓉菊屬)等。現以菊屬'鐘山金桂'與蒿屬黃金艾蒿的遠緣雜交為 例具體說明如下以栽培菊花品禾中'鐘山金桂，[De"c/rawAe附a won》//"w 'zhongshanjingui，]為母本，以蒿屬野生種黃金艾蒿[^Y^^/ara/g^W (因其葉片表面有大小不一、 不規則的黃色或白色斑點，看上去呈金黃色而得名，在長江流域有野生分布，在 園林綠化領域作為觀葉植物也有一定的栽培應用，同時具有較強的抗病蟲能力) 為父本，獲得了雜交後代材料，經形態學和原位雜交成功地鑑定出了屬間遠緣雜 種。
對雜交父母本及後代材料的初步觀察表明新材料的株型、冠幅、株高、葉 等形態特徵介於雙親之間，但偏母性遺傳；花序具有超親優勢，尤其是花序直徑 和舌狀花長度明顯大於母本，但舌狀花數量、寬度和筒狀花數量、長度均沒有明 顯變化；分枝性、花序繁密度、開花期等具父本特異性狀，如分枝比母本多，單 株花序比母本繁密，開花期較母本提前。尤其不同的是，雜交後代由於體內攜帶 了野生種的基因，長勢好，抗性強，在終花期依然保持全株為綠色葉片，而母本 在開花後期的中下部葉片幾乎全部枯死。雜交後代在表皮毛密度和形態上也具有 父本的特徵，密度和長度均較母本顯著增加，尤其是在"T"形表皮毛的豎端上， 母本由2或3個細胞組成，雜種和父本均由5個細胞組成。
在對雜種的根尖細胞有絲分裂中期製片進行的原位雜交圖中，可以清楚地看 到其45條染色體的組成為來自母本栽培菊'鐘山金桂'的27條(紅色)和來自 父本蒿屬黃金艾蒿的18條(黃色)，直觀地證明了雜種的真實性。關於雜種和親 本葉、花、表皮毛形態及原位雜交見圖1。栽培菊'鐘山金桂'(染色體54條)、 黃金艾蒿(染色體36條)及'鐘山金桂'X黃金艾蒿組合雜種的形態特徵具體 描述如下
'鐘山金桂，[D. morifolium'zhongshanjingui，]: 株高52cm， 冠《5 86 cm， 分枝性中等，葉長5.0cm，寬3.2咖，葉裂深，有或無託葉，莖綠或紫色，莖及 葉片上均有較稀疏毛；花序直徑4.12 cm，筒狀花部分直徑1.8cm，均為黃色； 舌狀花數22，長1.97cm，寬0.52cm;筒狀花數146，長1.09cm;花期10 11月。 黃金艾蒿[Artemisia vulgaris]:株高55 160cm，冠徑26~64 cm，分枝性強， 葉長5.31cm，寬2.94cm，葉裂深，有託葉，莖淺綠或綠色，莖及葉片上被細長 濃密如蛛絲狀絨毛；花序無舌狀花，筒狀花數15，初開8月20日，此後在抽生
的新枝上現蕾開花直至11月底。
'鐘山金桂，X黃金艾蒿組合雜種株高43 63cm，冠徑65-81 cm，分枝 性強，葉長5.8cm，寬3.2 0111，葉裂深，有或無託葉，莖綠或紫色，莖及葉片上 均有較密長柔毛，但較父本稀疏；花序直徑4.78cm，筒狀花部分直徑2.01cm， 均為黃色；舌狀花數21，長2.41cm，寬0.54cm;筒狀花數151，長1.09cm;花 期9月底~11月。
權利要求
1、一種獲得栽培菊花與近緣屬間遠緣雜種的方法，包括1)栽培菊花與近緣屬間遠緣雜交後代材料的獲得選擇菊屬栽培菊花[Dendranthema morifolium]和近緣屬物種亞菊屬磯菊[Ajania pacificum]、蒿屬黃金艾蒿[Artemisia vulgaris]、茼蒿屬白晶菊[Chrysanthemum paludosum]及芙蓉菊屬芙蓉菊[Crossostephium chinense]，於溫室內進行雜交，以栽培菊花為母本進行人工去雄並套袋隔離，以近緣屬物種為父本在筒狀花散粉前套袋，於上午9～10時或下午3～4時授粉，同一花序重複授粉2次；接種時取雜交授粉後15～18d的頭狀花序，剝取邊緣舌狀花的子房，在超淨工作檯上依次開展以下操作用體積比為75％的乙醇浸泡30s，質量百分比為0.1％的升汞溶液消毒6min，無菌水衝洗4～5次；用接種針將子房內的胚珠剝出，接入MS添加激動素KT 2.0mg·L-1+生長素IAA1.0mg·L-1或者添加細胞分裂素6-BA2.0mg·L-1+生長素NAA 0.5mg·L-1的培養基上，每瓶接種胚珠10個，每處理重複20～30瓶，誘導愈傷組織形成；30d後轉入分化培養基，分化培養基為MS+細胞分裂素6-BA2.0mg·L-1+生長素NAA0.1mg·L-1，誘導愈傷組織分化出苗；得到幼苗後轉入MS+細胞分裂素6-BA 0.2mg·L-1的培養基中進行擴繁和繼代培養，幼苗移至1/2MS添加生長素NAA 0.1mg·L-1的培養基上生根，培養溫度為23±2℃，光照周期為14h·d-1，光照強度為1600～2000lx，即可獲得菊屬栽培菊花與近緣屬物種屬間遠緣雜交後代的無菌苗；2)屬間雜種的獲得對後代材料進行形態學鑑定，選擇形態學特徵在株高、冠徑、分枝性、葉片、花序、表皮毛等方面出現介於雙親之間、與母本不同、父本特異性狀或父母本都不具備的新性狀的植株，以雙親之一的總DNA用螢光素標記後作為探針，進行分子原位雜交鑑定；經鑑定後體細胞內含有分別來源於雙親的基因組的後代材料，即為獲得的菊屬栽培菊花與近緣屬物種的屬間雜交種。
全文摘要
本發明獲得菊屬與近緣屬的屬間遠緣雜種的方法，屬於生物技術育種領域。選擇栽培菊花品種為母本，以野生的抗病蟲能力強或具特異觀賞價值的近緣屬物種為父本，採用組織培養手段進行雜種胚的離體培養，以克服菊屬與近緣屬遠緣雜交後合子胚敗育的障礙。對獲得的後代材料進行雜種形態學鑑定和原位雜交鑑定，選擇莖、葉、花序、表皮毛等形態學特徵介於雙親之間、與母本不同、出現父本特異性狀或雙親不具有的新性狀的後代材料，進行原位雜交，若染色體組成為分別來源於雙親，即為獲得的屬間遠緣雜交種。應用本方法成功地實現了菊屬與多個近緣屬的屬間遠緣雜交種，對現有栽培菊花品種進行了改良，並創造了一批有應用價值的新種質。
文檔編號A01H1/02GK101513167SQ20091002962
公開日2009年8月26日 申請日期2009年4月8日 優先權日2009年4月8日
發明者房偉民, 真 李, 湯訪評, 滕年軍, 王海濱, 管志勇, 鄧衍明, 陳發棣, 陳素梅 申請人:南京農業大學