一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊及應用的製作方法

2023-05-12 21:49:31 2

專利名稱：一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊及其應用，包裹的質粒是分別由綠色和紅色螢光蛋白標記的BMP-2(骨形態發生蛋白-2)和 bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)，該殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時轉染入細胞並有效表達。
背景技術：
骨缺損常由外傷、感染及腫瘤等疾病引起，會造成嚴重的人體功能障礙和外貌畸形，給患者工作、生活、社交帶來巨大的影響，是臨床醫學面臨的一大難題。目前對骨缺損的治療主要有自體骨移植修復和各種材料充填兩種。前者的主要缺點在於供區損傷和供骨有限；後者的主要缺點在於移植物排斥和成骨性能不良等。當前骨缺損治療的困境在於骨缺損治療仍然以傳統方法為主，且效果欠佳；基因治療骨缺損存在很多問題。這就有必要應用多樣的技術，特別是多基因聯合治療的方法，對組織工程化人工骨的構建進行改良和完
口 ο基因治療是維持骨缺損局部生長因子有效治療濃度進而提高療效最有希望的一種方法。其優點在於保證基因產物的局部靶向釋放；可最大限度地增加局部治療效果，減少副作用；多種基因可分別轉導，並分別調控，內源性合成的蛋白質比外源性重組蛋白具有更強的生物活性。但是，骨缺損基因治療目前至少存在以下問題①研究多集中與單一基因方面，而事實上，在骨折癒合及骨生成過程中，有多個基因共同參與並協同表達；②基因轉染多採用病毒為載體，一般只轉載一個基因，同時存在免疫原性、安全性等很多問題；③種子細胞來源受限制，骨髓基質細胞等的獲取繁瑣且難於被患者所接受。自 1965 年 Urist 首先發現骨形態發生蛋白(Bone morphogenticproteins,BMPs) 具有骨誘導能力以來，骨的生長和修復受骨誘導因子的調控已被國內外學者所公認。BMPs 是唯一一類能夠啟動成骨分化，並作用於成骨整個過程的細胞因子。BMP-2是第一個在體內實驗中證明具有誘骨活性的BMP分子，並且可作為誘骨的充分條件，即在只有單獨BMP-2存在的情況下即可誘導軟骨和骨組織的形成。在局部使用BMP-2蛋白或轉染了 BMP-2基因的骨髓基質幹細胞用於治療骨缺損已經獲得了一定的成功。然而，組織工程骨要得到理想的癒合效果，其再血管化是一個十分關鍵的環節。現已證明鹼性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)是體內最為有效的血管形成因子之一，對新生血管形成過程中多個環節起作用，可刺激毛細血管內皮細胞的遷移和增生，形成毛細血管芽，同時能刺激纖溶酶原激活劑和膠原酶分泌，對創傷區域的細胞外基質進行降解，使毛細血管向創面區域延伸。bFGF也是一種強大的促軟骨細胞、骨髓基質幹細胞有絲分裂因子，可促進軟骨和骨組織的形成。與VEGF(Vascular endothelial growth factor，血管內皮細胞生長因子)相比，BMP_2、bFGF基因修飾(各基因分別單獨轉染)的種子細胞能夠更為有效地在骨組織工程中發揮作用。
Franceschi等用腺病毒分別表達BMP_2、4和7後轉染細胞，結果發現聯合應用時成骨能力提高。理論上BMP-2和bFGF的協同作用將取得更佳的成骨效果，這就需要去尋找能同時轉導多個基因的載體。目前基因轉染多採用病毒為載體，如逆轉錄病毒、腺病毒等，雖取得一定成功，但一個病毒載體一般只能轉載一個目標基因，同時在表達時間、免疫源性反應以及安全性方面仍存在很多問題。據Nature和Scinece和的報導，1999年9月，18歲的美國少年 Gelsinger J在腺病毒介導的基因治療臨床研究中不幸死亡。裸露質粒由於轉染效率較低而未推廣，非病毒載體如陽離子脂質體lipofectamine早在1987年就已研發，隨之一些合成聚合物載體如賴氨酸(PLL)、二氯乙基(DEAE)-葡聚糖、磷酸鈣和樹枝狀聚合物等均用於 DNA釋放，還包括一些控制釋放聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(EVAc)等。納米載體分為納米微囊和納米顆粒，殼聚糖載體是納米微囊結構，它將基因包裹在內部，納米顆粒則將基因結合在顆粒的表面。殼聚糖是由β-1-4鍵合葡糖胺和一部分 N-乙醯基葡糖胺組成的天然線性陽離子多糖，為低毒性且生物相容性基因載體，因而可增加DNA/殼聚糖配合物劑量而提高其轉染率。Corsi等採用殼聚糖DNA納米載體轉染人骨髓間充質幹細胞、腎肉瘤細胞和人胎腎細胞，發現殼聚糖DNA納米微囊在基因轉運中具有毒性小、細胞型依賴性的特點。殼聚糖納米微囊(Nanosphere)包裹非病毒載體基因轉移技術是一種較為成熟的多基因轉移技術。主要特點在於①納米微囊包裹可避免轉載物在受體內被溶酶體酶降解； ②同時可包裹多個轉導基因；③由於採用可降解生物材料包裹，故明顯提高轉載基因的活性並具有長時間緩釋功能；④體內及體外多種細胞系轉染證明其有較脂質體優越的基因轉移效率。

發明內容
本發明的目的是提供一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，微囊的基質為殼聚糖，包裹的質粒分別是綠色螢光蛋白標記的人骨形態發生蛋白-2(pEGFP-N2-Hu-BMP-2) 和紅色螢光蛋白標記的人鹼性成纖維細胞生長因子(pTagRFP-Cl-Hu-bFGF)。殼聚糖購自美國 Sigma 公司(low molecular weight, Sigma-Aldrich，脫乙醯度 75-85 %，貨號 448869-50G)，包裹的質粒與殼聚糖的質量比為1 1，其中BMP-2和bFGF各半(質量比 1:1)。本發明所述微囊主要通過以下步驟製備(1)殼聚糖溶液的配製稱殼聚糖50mg，加入359ul乙酸，加滅菌去離子水(SDW) 至2. 5mL，37度過夜；次日力口 SDW至M5ml，調pH為5. 5，最後定容250mL，真空過濾(0. 22um 濾膜)除菌得a液的殼聚糖溶液，此時殼聚糖溶液的溶度為0. 2g/L ；O)DNA溶液的配製將質量比1 1的pEGFP-N2-Hu-BMP-2和 pTagRFP-Cl-Hu-bFGF溶解於5mM的硫酸鈉鈉溶液中，配製成200 μ g/mL(0. 2g/L)質粒溶液 (100 μ g/mL BMP-2 質粒 +100 μ g/mL bFGF 質粒)，得到 b 液；(3)殼聚糖納米微囊的製備將a液、b液分別加熱，55度水浴15min，按1 1混合，2500rpm攪拌30秒，即得lOOng/uL的BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊溶液，4攝氏
度保存。
本發明的另一個目的是提供所述微囊在製備基因治療骨缺損藥物中的應用。綠色螢光蛋白標記的人骨形態發生蛋白-2 (pEGFP-N2-Hu-BMP_2)和紅色螢光蛋白標記的人鹼性成纖維細胞生長因子(pTagRFP-Cl-Hu-bFGF)是從人成纖維細胞中分別提取BMP-2和bFGF，再分別與綠色螢光蛋白載體pEGFP-N2(Cl0ntech，美國)和紅色螢光蛋白載體pTagRFP-Cl (Evrogen，Moscow, Russia)連接構建，具體構建方法見實施例1。經菌落 PCR、雙酶切鑑定以及測序三種方法，均表明pTagRFP-Hu-bFGF重組表達載體的構建是正確的，而且Hu-bFGF和RFP (紅色螢光蛋白)以融合表達的方式在Kozak sequence的幫助下進行高水平真核細胞的表達。原子力顯微鏡(SPI3800N)下觀察見殼聚糖納米微囊呈不規則球形，結構緊密，粒徑約為100-200nm，大小較均一(圖1)。螢光顯微鏡下觀察可見轉染後同一細胞內出現綠色和紅色(圖2)，說明分別標記有綠色和紅色螢光蛋白的雙基因轉入同一細胞表達。本發明針對骨缺損基因治療方面的三方面不足設計BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，採用納米微囊包裹非病毒載體多基因轉移技術，轉染於脂肪幹細胞(脂肪源性基質細胞，Adipose Derived Stem Cells，ADSCs)，以取得更好的成骨性能。本發明微囊的基質選用殼聚糖，包裹的質粒是分別由綠色和紅色螢光蛋白標記的BMP-2和bFGF。經實驗證實，該殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時進入細胞並有效表達，因此可在製備基因治療骨缺損藥物中的應用。該微囊的製備方法簡單，條件溫和，效果良好，殼聚糖在體內可以完全降解並代謝，其分解產物及代謝產物對人體健康無害，有良好的應用前景。


圖1為原子力顯微鏡下的殼聚糖納米微囊。圖2為BMP-2/bFGF雙基因共轉染的螢光照片(a為綠色螢光激發，b為紅色螢光激發，c為雙色螢光合成照片)。圖3為殼聚糖納米微囊的瓊脂糖凝膠電泳鑑定。圖4為原子力顯微鏡下的殼聚糖納米微囊(稀釋後放於雲母片上)。圖5為原子力顯微鏡下殼聚糖納米微囊粒徑測量(稀釋後放於雲母片上)。圖 6 為 Western Blotting 檢測。具體實施方法本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。實施例ΙΒΜΡ-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊的製備BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊的製備方法主要分為如下4個步驟①構建綠色和紅色螢光蛋白分別標記的BMP-2和bFGF 分別構建 pEGFP-N2-Hu-BMP-2和pTagRFP-Cl-Hu-bFGF，並經經菌落PCR、雙酶切鑑定以及測序三種方法，均表明pTagRFP-Hu-bFGF重組表達載體的構建是正確的，而且Hu-bFGF和RFP (紅色螢光蛋白)以融合表達的方式在Kozak sequence的幫助下進行高水平真核細胞的表達。構建方法如下。( 一)pEGFP-N2-Hu-BMP-2的構建用總RNA提取試劑盒(杭州浩基生物科技有限公司)提取人成纖維細胞總RNA，再用superscript II RTase(Invitrogen)合成cDNA，然後進行Hu VEGF ORF PCR擴增反應。
PCR引物設計和合成根據基因資料庫VEGF-A序列，採用I^rimer Premier 6. 0軟體進行螢光引物的設計，然後由上海生物工程有限公司負責合成，引物序列如下正向引物Hu-Bmp2-F見 SEQ ID NO. 1。反向引物:Hu-Bmp2-R見 SEQ ID NO. 2。表IPCR反應體系
權利要求
1.一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，其特徵在於，微囊的基質為殼聚糖，包裹的質粒分別是綠色螢光蛋白標記的人骨形態發生蛋白-2和紅色螢光蛋白標記的人鹼性成纖維細胞生長因子，殼聚糖的脫乙醯度75-85%，包裹的質粒與殼聚糖的質量比為1:1，其中綠色螢光蛋白標記的人骨形態發生蛋白-2和紅色螢光蛋白標記的人鹼性成纖維細胞生長因子質量比1:1。
2.根據權利要求1所述的一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，其特徵在於，所述微囊通過以下步驟製備(1)殼聚糖溶液的配製稱殼聚糖50mg，加入359 ul乙酸，加滅菌去離子水至2. 5 mL, 37度過夜，次日加滅菌去離子水至M5 ml，調pH為5. 5，最後定容250 mL，真空過濾除菌得殼聚糖溶液，為a液，殼聚糖溶液的溶度為0. 2g/L ；(2)DNA溶液的配製將質量比 1 1 的 pEGFP-N2-Hu-BMP-2 和 pTagRFP-Cl-Hu_bFGF 溶解於5 mM的硫酸鈉鈉溶液中，配製成200 μ g/mL質粒溶液，得到b液；(3)殼聚糖納米微囊的製備將a液、b液分別加熱，55度水浴15min，按1: 1混合， 2500 rpm攪拌30秒，即得100 ng/uL的BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊溶液，4攝氏度保存。
3.根據權利要求1所述的一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊在製備基因治療骨缺損藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種BMP-2/bFGF雙基因殼聚糖納米微囊，微囊的基質為殼聚糖，包裹的質粒分別是綠色螢光蛋白標記的人骨形態發生蛋白-2和紅色螢光蛋白標記的人鹼性成纖維細胞生長因子，質粒與殼聚糖的質量比為1:1。經實驗證實，本發明殼聚糖納米微囊包裹的BMP-2和bFGF雙基因能同時進入細胞並有效表達，因此可在製備基因治療骨缺損藥物中的應用。該微囊的製備方法簡單，條件溫和，效果良好，殼聚糖在體內可以完全降解並代謝，其分解產物及代謝產物對人體健康無害，有良好的應用前景。
文檔編號A61K9/50GK102430129SQ201110425620
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月17日 優先權日2011年12月17日
發明者張夢媛, 李彩雲, 楊虎, 範聰, 談偉強, 陳強 申請人:浙江大學