一種檢測肼的螢光探針及其應用的製作方法

2023-05-12 18:26:47 1

本發明屬於分析化學技術領域，涉及一種檢測肼的螢光探針及其應用。

背景技術：

肼（N2H4）由於其毒性和高頻率使用引發人民特別的關注。它在各種化工行業裡如火箭燃料，催化劑，緩蝕劑，紡織染料和醫藥中間體有著廣泛的應用然而，肼也是一種有毒化學品的，它通過口服，暴露的皮膚或吸入途徑是對人體產生危害，已經有報導肼是一種神經毒素，能夠使呼吸道、肝、肺、腎損壞並且誘變中樞神經。另外，當它在製造，運輸，使用和處理中可能危及環境。因此，開發一種能可靠靈敏的檢測肼的可靠、靈敏的分析方法是十分必要的。

迄今為止，各種分析方法包括色譜法，滴定法，和電化學方法常用來檢測水樣中的微量的肼，但是這些方法往往耗時並且需要處理和破壞組織或細胞。而螢光分析是檢測它的最簡單方便的方法之一，具有成本低，靈敏度高，優秀的選擇性，以及用於生物成像有著顯著的潛力等優點而被廣泛用於各種離子及活性小分子的檢測中。然而據我們所知，只有有限的幾個螢光探針已經被用於檢測肼，而且一些探針只能在酸性條件下被利用限制了其在生物中的應用。這些肼螢光探針大多數都在紫外或可見光範圍內能夠發射和吸收，有著高的螢光背景但不適合用於生物成像。因此，對於研究人員來說仍具有極大的挑戰性。

目前，檢測肼的螢光探針大多數屬於反應型螢光探針。由於肼能夠跟很多化合物或者基團發生選擇性反應，研究者們利用肼的特異性的化學性質，設計了一系列的肼檢測螢光探針。

Shuizhu Wu 課題組設計了一種基於ICT機理比率型肼螢光探針，探針本身發出藍色螢光（Sensors and Actuators B: Chemical, 2016, 227: 411-418.）。該探針利用了肼的強親核性，取代萘環上乙醯基保護基，使乙醯基保護基褪去，發生ICT，從而產生綠色螢光。該探針能夠實現對肼的比色型和比率型螢光檢測，其檢測極限為9.40 ± 0.12 nM，遠低於國際標準（10 ppb）。而且它的選擇性和抗幹擾性非常好，能夠對實際水樣中（飲用水和河流水）的肼進行定量檢測，對氣態肼也能進行定性檢測。此外，該探針實現了活細胞和活體的螢光成像。

Suk-Kyu Chang 課題組設計了一種turn-on型螢光探針，選用了二氯螢光素作為螢光團（Org. Biomol. Chem., 2013, 11,2961）。這種探針的水溶性好，在含有小分子肼類似物的親核試劑存在的條件下，能夠實現對肼的選擇性檢測，而且已廣泛用於實驗室和工廠中。

大多數檢測肼的螢光探針都屬於turn-on型的檢測，這類探針有著很大的局限性及缺點，如靈敏度不高，選擇性差等。比率型螢光探針則有效的改善了turn-on型選擇性及靈敏度上的缺點，但是目前基於FRET機理的比率型螢光探針很少，響應時間較長，因此具有很大的研究空間。

技術實現要素：

本發明針對現有技術上的不足，提供了一種檢測肼的螢光探針。

本發明所述的一種檢測肼的螢光探針，該螢光探針的化學結構通式如式所示：

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上述檢測肼的螢光探針以如下方法製備：

中間體1a的製備：在圓底燒瓶中依次加入偏苯甲酸酐和對氯間苯二酚和甲磺酸，在100℃下攪拌反應8 h，將反應體系冷卻至室溫，抽濾。將固體乾燥，得S1產品。在圓底燒瓶中加入所得的S1和乙酸酐以及吡啶，回流1 h，將反應體系冷卻到室溫並抽濾，將所得固體乾燥，得到淺黃色固體即化合物1a。

中間體2的製備：取4-二乙胺基水楊醛，丙二酸二乙酯和哌嗪於圓底燒瓶中，加入無水乙醇，120℃回流12 h。隨後將NaOH (3 M)加入到反應液中並攪拌10 h，然後在冰浴中將pH調到2，抽濾。將固體在乙醇中重結晶，乾燥得固體，即化合物S2。

在圓底燒瓶中加入S2和二氯甲烷，DMAP和 EDCI。將混合物攪拌30 min，然後加入N-叔丁氧羰基哌嗪並在室溫下攪拌過夜。用飽和NaCl溶液洗滌，乾燥，濃縮。將得到的粗產品用矽膠柱色譜（乙酸乙酯：石油醚=2:1）分離提純，得到亮黃色粉末固體，即化合物S3。將S3溶於二氯甲烷中並加入濃鹽酸在室溫下攪拌2 h。將該溶液減壓溶縮，在無水乙醇中重結晶，得到白色晶體，即化合物2。

探針CFAc的製備：將1a用二氯甲烷溶解，然後在室溫下加入SOCl2，加熱回流2 h。將混合物冷卻至室溫並濃縮，得到淺黃色油狀物，即化合物1b。

將1b用二氯甲烷溶解，加入吡啶。然後加入2並攪拌過夜。用飽和NaCl溶液洗滌，並用DCM萃取所得混合物，乾燥後濃縮，將得到的產品經矽膠柱色譜法（乙酸乙酯：石油醚=1:1）提純，得黃色粉末固體，即探針CFAc。

本發明的合成如下所示：

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本發明所述的檢測過氧化氫的螢光探針在檢測活細胞中肼的應用。

本發明所述螢光探針可以應於檢測活細胞內的過氧化氫，具體檢測方法為：在Hela細胞中加入10 μM的CFAc，在37 ºC下培養15分鐘，細胞釋放藍色螢光。之後將Hela細胞與10 μM的CFAc在37 ºC下培養15分鐘後，用PBS洗滌三次，更換培養基，再由肼緩衝溶液（25 μM）培養15分鐘，細胞發出強烈綠色螢光。實驗表明，CFAc對細胞中的肼有良好的成像作用，可以很好的用於檢測生物體中的肼，在環境汙染檢測等方面具有重要的潛在應用價值。

本發明的有益效果：

本發明所涉及的一種檢測肼的螢光探針，以螢光素為母體，以乙醯基為開關，能過與肼發生肼解反應而釋放出不同的螢光，本發明的螢光探針合成簡單，使用方便，可以特異性與肼發生反應釋放綠色螢光，在檢測過氧化氫過程中不會受到其他親核試劑的幹擾，對肼具有良好的選擇性，能對活細胞中的肼進行檢測，成像效果好，且對細胞毒性低。

附圖說明

圖1是螢光探針CFAc的1H NMR譜圖。

圖2是螢光探針CFAc的13C NMR譜圖。

圖3是螢光探針CFAc的選擇性光譜圖。

圖4是螢光探針CFAc隨肼濃度變化響應光譜圖。

圖5是螢光探針CFAc響應時間光譜圖。

圖6是螢光探針CFAc抗幹擾性測試圖。

圖7是螢光探針CFAc對Hela細胞內過氧化氫檢測圖。

具體實施方式

實施例1：

在100 mL圓底燒瓶中依次加入偏苯甲酸酐和（9.6 g，50.0 mmol）和對氯間苯二酚（14.4 g，100 mmol）和100 mL甲磺酸，在100℃下攪拌反應8 h，將反應體系中加入500 mL的冰水冷卻至室溫，抽濾並用清水洗滌沉澱。將固體在90℃下乾燥，過夜，得S1產品23.9 g。在250 mL燒瓶中加入所得的S1和150 mL乙酸酐以及9 mL吡啶，在130℃下攪拌回流1 h，將反應體系冷卻到室溫並抽濾，將所得固體在真空下乾燥，得到淺黃色固體即化合物1a（12.9 g，21.2 mmol，產率42.4%）。

取4-二乙胺基水楊醛（10.0 g，51.75 mmol），丙二酸二乙酯（8.64 mL，56.92 mmol）和哌嗪（0.5 g）於250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL無水乙醇，120℃下攪拌回流12 h。隨後將NaOH (3 M,20 mL)加入到反應液中並攪拌10 h，然後在冰浴中將pH調到2。隨著酸化過程得到黃色固體。抽濾並用清水洗滌沉澱。將固體在乙醇中重結晶，得到黃色粉末狀晶體，乾燥得固體11.2 g，即化合物S2（42.87 mmol，產率82.8%）。

在250 mL圓底燒瓶中加入S2（1.31 g，5 mmol）和20 mL二氯甲烷，DMAP（0.07 g, 0.60 mmol）和 EDCI (1.15 g, 6 mmol）。將混合物攪拌30 min，然後加入N-叔丁氧羰基哌嗪（1.12 g，6.0 mmol）並在室溫下攪拌過夜。用水和飽和NaCl溶液洗滌，靜置分液，將分出來的有機層用無水MgSO4乾燥，並將其在真空下濃縮。將得到的粗產品用矽膠柱色譜（乙酸乙酯：石油醚 2:1）分離提純，得到亮黃色粉末固體，即化合物S3（1.57 g, 3.65 mmol,產率73%）。將S3 (0.43 g，1mmol)溶於二氯甲烷中並在室溫下攪拌2 h。將該溶液減壓溶縮，在無水乙醇中重結晶，得到白色晶體，即化合物2（0.30 g, 0.92 mmol,產率 92 %）。將1a（0.2 g, 0.38 mmol）用20 mL二氯甲烷溶解，然後在室溫下加入SOCl2（0.12 mL,1 mmol），加熱回流2 h。將混合物冷卻至室溫並濃縮，得到淺黃色油狀物，即化合物1b，無需進行純化即可進入下一步。

將1b用10 mL二氯甲烷溶解置於冰水浴中，加入吡啶（0.061 mL，0.76 mmol）。然後將溶液恢復至室溫後加入2（0.125 g，0.38 mmol）並攪拌過夜。用DCM（3×30 mL）萃取所得混合物，並用飽和NaCl溶液洗滌，經無水MgSO4乾燥後濃縮，將得到的產品經矽膠柱色譜法（乙酸乙酯：石油醚 1:1）提純，得白色粉末固體，即探針CFAc（0.218 g，0.26 mmol，產率68.4%）。1H NMR (CDC13, 400 MHz):1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.35 – 7.27 (m, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.13 (d, J = 24.9 Hz, 2H), 6.90 (s, 2H), 6.59 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 6.45 (s, 1H), 3.98 – 3.21 (m, 12H), 2.32 (s, J = 24.4, 10.9 Hz, 6H), 1.21 (t, J = 7.3 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.10, 167.94, 167.79, 165.49, 159.31, 157.51, 152.04, 149.55, 148.70, 146.20, 142.65, 134.80, 130.16, 129.58, 128.60, 126.27, 123.01, 117.13, 115.19, 113.05, 109.59, 107.80, 96.94, 80.53, 77.36, 60.50, 45.07, 21.16, 20.68, 14.29, 12.49.

本發明對實施例1得到的探針CFAc進行了效果測試：

1. CFAc選擇性分析

在5 μM的CFAc中加入80當量肼的CH3OH / PBS緩衝液（其中肼的濃度為10 mM， pH = 7.4，乙腈：PBS緩衝液 = 1：5），檢測結果如圖3，當λex = 400 nm時，CFAc對肼有強烈的螢光響應，而且CFAc對其他氧化性物質幾乎沒有響應，說明CFAc對肼具有優異的選擇性。

2. CFAc對肼濃度變化響應分析

在5 μM CFAc中加入0 - 160個當量（0 - 320 μM）的肼時，螢光響應強度隨肼加入量的增加呈規律性增加，檢測結果如圖4，結果說明CFAc對肼濃度檢測範圍廣且靈敏度高。

3. CFAc對肼響應時間分析

在5 μM的CFAc中加入80當量肼的乙腈：PBS緩衝液，對CFAc與肼的響應時間進行了檢測，檢測結果如圖5，結果顯示，在加入過氧化氫後0 - 120分鐘內，CFAc對肼的螢光響應強度隨時間的增加呈線性增強，在較短的時間內就能達到良好的螢光強度。結果表明，CFAc對肼的響應快速，可有效的應用於肼的檢測。

4. CFAc抗幹擾性分析

探針CFAc在各種親核性物質幹擾分子存在的情況下進行了競爭實驗，來檢測CFAc的抗幹擾性。檢測結果如圖6，在肼與其他親核性物質共存的情況下CFAc仍然能對其產生穩定的螢光響應。上述結果表明CFAc對肼有著優異的抗幹擾性，可以在其它親核性物質存在的情況下高效的檢測肼。

5. CFAc在細胞檢測中的應用

在Hela細胞中加入10 μM的CFAc在37 ºC下培養15分鐘，檢測結果如圖7，由圖7中B所示，細胞釋放藍色螢光。我們將Hela細胞與10 μM的CFAc在37 ºC下培養15分鐘後，用PBS洗滌三次，更換培養基，再由肼緩衝溶液（25 μM）培養15分鐘，由圖7中E所示，細胞發出強烈的綠色螢光。實驗表明，CFAc對細胞中的肼有良好的成像作用，可以很好的用於檢測生物體中的肼，在環境汙染檢測等方面具有重要的潛在應用價值。

上述雖然結合附圖對本發明的具體實施方式進行了描述，但並非對發明範圍的限制，所述領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護範圍之內。