Rna和dna雙外參以及dna內參實時定量螢光pcr檢測方法
2023-05-12 18:27:06 2
Rna和dna雙外參以及dna內參實時定量螢光pcr檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，包括步驟：選定外參基因和內參基因；製備外參基因mRNA與DNA的預混合液；收集樣品及預混合液的總mRNA和DNA；實時定量螢光PCR，檢測外參基因和待測基因的mRNA和DNA拷貝數以及內參基因DNA拷貝數，從而同時得到基因的表觀表達水平、DNA拷貝數相對量以及細胞水平相對表達量，為基因樣本檢測及機理研究提供了多層次信息。
【專利說明】RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方
法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學及生物信息學領域，具體涉及一種RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法。
【背景技術】
[0002]自從1970年克裡克提出分子生物學的中心法則以來，人們對於基因的轉錄表達和及其調控的機制進行了大量的研究。Northern雜交方法是最早被用來測定基因轉錄量的方法。後來,結合逆轉錄和聚合酶鏈式反應產生的RT-PCR(reverse transcription-PCR,即:逆轉錄-聚合酶鏈式反應)提供了一種靈敏而又簡便的半定量測定方法。近年來，實時定量聚合酶鏈式反應(簡稱為:qPCR)方法由於其靈敏、準確和重複性好，因此逐步成為基因表達的定量測定的主要方法。上述方法為了減少由於RNA不穩定和逆轉錄的效率問題產生的誤差，通常將待測基因的轉錄水平表示為與一個參考值(內參基因mRNA水平、細胞內總RNA水平)的相對表達量。內參通常為看家基因，如:β -actin,GAPDH以及rRNA等。然而，由於不同組織來源、或同一組織在不同條件下，細胞的總RNA量和/或內參的量並不恆定，因此，基於該前提所進行的基因轉錄水平檢測往往不準確。針對這一問題，我們曾經提出「RNA和DNA雙外參實時定量螢光PCR檢測方法」，檢測基因在某個時刻、某個細胞狀態下的mRNA和DNA的比值，確定該基因每個DNA拷貝的轉錄水平，並將其命名為表觀表達水平
[1](專利號:ZL200910049306.5)。這一概念的提出和技術的實現使得任一基因的mRNA水平直接與基因拷貝數建立關聯，由此，同一基因的表觀表達水平在不同組織之間、同一組織不同條件之間、不同批次實驗之間可以進行比較，不同基因的啟動子之間也可以進行比較，能夠為基因表達調控研究提供最本質的彳目息。
[0003]然而，我們注意到，近年來拷貝數變異(copy number variations,CNVs)引起人們越來越多的關注。CNVs指長度超過Ik的片段在基因組上拷貝數的變化，涉及缺失或複製兩類事件。CNVs在基因組中分布相當普遍，以人類基因組為例，CNV可能影響到約2%的基因組序列[2]。其中一部分CNVs通過改變基因表達量、生成截斷的蛋白產物、影響調控序列等方式造成樣本間表型的差異，包括疾病的發生。由於CNV事件的存在，當我們運用「RNA和DNA雙外參實時定量螢光PCR檢測方法」檢測到某個基因在不同樣本間具有相同的表觀表達值(每個基因拷貝的表達量)，儘管該方法相對傳統qPCR方法檢測到了更加精確的表達水平，但仍然不能確定地判斷該基因在細胞水平的表達量是否存在樣本間差異。因此，如何能同時獲得表觀表達值和細胞水平表達值，並解析基因表達水平發生改變的機制性原因，成為急待解決的具有現實意義和理論意義的問題。
【發明內容】
[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供了一種RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，從而同時檢測得到待測基因的表觀表達水平、DNA拷貝數相對量以及細胞水平相對表達量。
[0005]本發明的目的之一是提供了一種RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，步驟如下:
[0006]I)選定外參基因，配製具有一定比例的外參基因mRNA與DNA的預混合液；其中，所述外參基因為待測樣品中不存在的序列。
[0007]其中，所述外參基因的選定原則與預混液中外參基因mRNA與DNA的比值選擇可參考專利.RNA和DNA雙外參實時定量螢光PCR檢測方法及其應用」(專利號:ZL200910049306.5)。2)選定內參基因，所述內參基因選自不容易發生拷貝數變異的CNV冷區的DNA序列。
[0008]其中，所述內參基因的選定為，收集以往研究公開報導的「CNV冷區」序列信息，即不容易發生拷貝數變異的DNA區域序列數據。以大鼠為例，整條18號染色體均為CNV冷區[3』4];以人類基因組為例，從資料庫-人類基因組為例，從資料庫E.DATA,成為急待解決的具(http: / / dgv.tcag.ca / dgv / app / home)[5]中獲取了人基因組中目前鑑定到的所有CNV序列信息，從人基因組全序列中扣除這些信息，即得到了 CNV冷區序列。
[0009]3)將步驟I)製備的預混合液與待測樣品混合，分別抽提總mRNA和總DNA ；
[0010]4)總mRNA進行逆轉錄合成第一條cDNA鏈後與總DNA分別進行實時定量螢光PCR，擴增反應後，檢測待測基因的mRNA和DNA的擴增產物的拷貝數、外參基因的mRNA和DNA的擴增產物的拷貝數，以及內參基因DNA擴增產物的拷貝數；根據如下公式計算分別得到待測基因的表觀表達水平、待測基因的DNA拷貝數相對量、以及待測基因的細胞水平相對表達量:
[0011]·
【權利要求】
1.一種RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，包括如下步驟: 1)選定外參基因，配製外參基因mRNA與DNA的預混合液；所述外參基因為待測樣品中不存在的序列； 2)選定內參基因； 3)將步驟I)製備的所述預混合液與待測樣品混合，分別抽提總mRNA和總DNA; 4)總mRNA進行逆轉錄合成第一條cDNA鏈後與總DNA分別進行實時定量螢光PCR擴增，檢測待測基因的mRNA和DNA的擴增產物的拷貝數、外參基因的mRNA和DNA的擴增產物的拷貝數，以及內參基因DNA擴增產物的拷貝數，根據如下公式計算同時檢測得到待測基因的表觀表達水平、DNA拷貝數相對量以及細胞水平相對表達量:
2.如權利要求1所述的RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，其特徵在於，所述外參基因的DNA為包含外參基因的重組載體；所述外參基因的mRNA是以上述線性化的包含外參基因的重組載體為模板，通過體外轉錄製得的mRNA。
3.如權利要求2所述的RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，其特徵在於，所述重組載體為質粒或杆狀病毒。
4.如權利要求1所述的RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，其特徵在於，對同一基因的mRNA與DNA使用相同的引物分別進行實時定量螢光PCR擴增。
5.如權利要求1所述的RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，其特徵在於，所述內參基因為不易發生拷貝數變異的CNV冷區的DNA區域。
6.如權利要求1所述的RNA和DNA雙外參以及DNA內參實時定量螢光PCR檢測方法，其特徵在於，所述檢測方法應用於同時檢測待測基因的表觀表達水平、DNA拷貝數相對量以及細胞水平相對表達量。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589803SQ201310595973
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】李園園, 陸長德, 蔣昊韡 申請人:上海生物信息技術研究中心