一種酵母麥角固醇高產菌株及其選育方法與應用的製作方法

2023-05-12 17:32:51

專利名稱：一種酵母麥角固醇高產菌株及其選育方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於發酵工 程和微生物菌種選育的技術領域，特別涉及一種酵母麥角固醇高產菌株及其選育方法與應用。
背景技術：
麥角固醇是一種重要醫藥化工原料，可用於製造VD2、激素黃體酮、可的松，在臨床上能有效防治嬰幼兒維生素D缺乏性佝僂病，其對骨折、骨結核、齲齒等病症也有較好的預防和治療作用。由於留體化合物分子中含有不對稱的中心，化學合成步驟多、產率低、成本高，難於工業化生產，目前國內外主要採用微生物發酵法生產。麥角固醇主要存在於植物和一些真菌的細胞膜上。其中以酵母菌的含量最高，所以一般都以酵母作為麥角固醇的生產菌株。麥角固醇是酵母細胞固醇類中最主要的一種化合物，由於其獨特的化學結構，能增加細胞膜的堅固性。當有機溶劑存在的情況下對細胞進行傷害時，在應激條件的作用下，細胞合成更多的麥角固醇使細胞膜具有更好的穩定性，形成障礙物阻止有機溶劑進入細胞造成傷害。有研究表明，與酒精敏感的工業酵母菌株相比，耐高濃度乙醇的酵母菌株在有氧分批培養過程中能合成較多的留醇和脂類物質，而且在高濃度酒精的傷害中，耐受性強的酵母菌株死亡速率明顯要比敏感型酵母菌株慢，這說明酵母細胞膜上留醇和脂類物質的含量與生產菌株耐有機溶液濃度的能力密切相關。對生活條件的變化有迅速的適應能力，是微生物生長的一大特點。外界環境的變化，能使微生物群體特性發生相應的變異。在有機溶劑存在的條件下，微生物細胞可採用多種方式去適應這種不利的環境，主要包括細胞膜本身的成分特點及相應的組成的改變如細胞膜通透性增加、長鏈不飽和脂肪酸含量的增加、磷脂組成中磷酸乙醇胺(PE)、磷酸肌醇(PI)含量增加、膽固醇及麥角固醇含量增加、衝擊蛋白的合成、線粒體活性增強、海藻糖含量提高、質膜ATP酶活性增強等等，且這些因素間又相互影響，因此，細胞對有機溶劑的適應機制是一個相當複雜的反應體系。其中起著最主要作用的是細胞膜自身通透性和固醇、脂類的含量。長時間不間斷地利用強極性、高濃度有機溶劑對酵母生產菌株進行應激定向馴化，改變生產菌株的生理性狀，提高其對有機溶劑毒害的抗性和耐受性，從而篩選出高產酵母麥角固醇的生產菌株，不失為是一種篩選改良菌種有效的技術手段。

發明內容
本發明的首要目的在於提供一種酵母麥角固醇高產菌株。本發明的另一目的在於提供所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法。本發明的再一目的在於提供所述的酵母麥角固醇高產菌株的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種酵母麥角固醇高產菌株，名稱為釀酒酵母 scut_B6305 (Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏於位於中國武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC N0:M2012105 ；所述的酵母麥角固醇高產菌株的細胞形態為橢圓形或卵圓形，直徑大小為10 20 μ m ;菌落形態較大而厚,呈圓形、隆起,溼潤,較光滑,顏色為淡黃白色；所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法，包含以下步驟(I)高極性有機溶劑耐受性酵母菌株的初步篩選將釀酒酵母出發菌株接入種子培養基中，28°C培養18 24h後按體積百分比10%轉接入發酵培養基中，28°C培養24h後加入二甲基亞碸，二甲基亞碸的終濃度為體積百分比12%，強制應激處置6小時，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基平板；待長出菌落後，挑選長勢好、菌落大的菌落再次接入種子培養基，進行再一輪篩選；其中，二甲基亞碸的起始濃度為體積百分比12%，每輪篩選二甲基亞碸濃度比上一輪濃度提高體積百分比I. 0%，直至培養基平板上菌落形成率只能形成幾個菌落；(2)強極性有機溶劑置措耐受性酵母富集馴化和平板分離復篩將初篩獲得的耐受性菌株接入種子培養基中，28°C培養18 24h後按體積百分比10. 0%轉接入發酵培養基中，28°C培養24h後加入二甲基亞碸，濃度為步驟(I)所用的二甲基亞碸的最高濃度，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基平板，挑選長勢最好的菌落進行下一代馴化；經過五代的按步驟(I)所使用的最高濃度的二甲基亞碸置措馴化培養，得到酵母麥角固醇高產菌株。所述的種子培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然；所述的發酵培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然；所述的固體培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水IOOmL,瓊脂2g, pH自然；步驟(I)中所述的出發菌種優選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS2. 599 ； 所述的酵母麥角固醇高產菌株用於生產麥角固醇。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明提供的酵母麥角固醇高產菌株，其單位細胞麥角固醇含量達到5. 63mg/g (乾重)，比出發菌株提高了 30. 32% ;其單位體積發酵液的生產能力為90. 8mg/100mL，是出發菌株的I. 91倍。(2)本發明提供的選育方法培育條件溫和、操作簡單、投入少、易掌握。


圖I是釀酒酵母scut_B6305的細胞與菌落形態圖；其中，圖(a)為放大1000倍的油鏡觀察圖；圖(13)是菌落圖。圖2是皂化-萃取-紫外檢測法測定酵母麥角固醇的標準曲線。圖3是二甲基亞碸耐受性酵母菌株馴化過程中麥角固醇積累情況圖。圖4是高耐受性酵母菌株在不同馴化過程中麥角固醇生產能力的比較圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限·於此。
實施例I(I)高極性有機溶劑耐受性酵母菌株的初步篩選將出發菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, AS2. 599,購自中國科學院微生物研究所)接入種子培養基(每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然，下同)中，28°C培養18 24h後按體積百分比10%轉接入發酵培養基(每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然，下同)中，28°C培養24h後吸取I. OmL菌懸液至I. 5mL無菌的小離心管中,加入二甲基亞碸，二甲基亞碸的終濃度為體積百分比12%，強制應激處置6小時，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基(每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，瓊脂2g，pH自然，下同)平板。待長出菌落後，挑選長勢好、菌落大的菌落再次接入種子培養基，進行再一輪篩選。其中，二甲基亞碸的起始濃度為體積百分比12%，每輪篩選二甲基亞碸濃度比上一輪濃度提高1.0%，直至培養基平板上菌落形成率很低，只能形成少數幾個菌落，通過初篩最終獲得了二甲基亞碸耐受性菌株DM-c和DM-d。 (2)強極性有機溶劑置措耐受性酵母富集馴化和平板分離復篩以初篩的最高有機溶劑濃度(二甲基亞碸濃度為體積百分比18. 0%)對初篩所得菌株進行富集馴化培養。將初篩獲得的耐受性菌株接入種子培養基中，28°C培養18 24h後按體積百分比10. 0%轉接入發酵培養基中，28°C培養24h後吸取I. OmL菌懸液至I. 5mL無菌的小離心管中，加入初篩確定的最高濃度為體積百分比18. 0%的二甲基亞碸，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基平板，挑選長勢最好的菌落進行下一代馴化。經過五代的體積百分比18. 0% 二甲基亞碸置措馴化培養，最終篩選出遺傳性能穩定的二甲基亞碸高耐受性菌株scut-B6305，細胞形態為橢圓形或卵圓形，直徑大小為10 20 μ m左右，如圖I (a)所示；菌落形態較大而厚，呈圓形、隆起，溼潤，較光滑，顏色為淡黃白色，如圖I (b)所示。(3)有機溶劑置措高耐受性酵母菌株產麥角固醇能力的測定從復篩馴化獲得的二甲基亞碸高耐受性菌株Scut-B6305接入種子培養基中，28°C培養18 24h後按體積百分比10. 0%量轉接入IOOmL發酵培養基中，28°C培養48h，然後取樣進行生物量(見測定方法II)和麥角固醇含量的測定。I、麥角固醇含量的測定，為皂化-萃取-紫外檢測法①麥角固醇標準曲線測定精確稱取麥角固醇標準品12. 2mg，用無水乙醚稀釋定容至IOOmL,振蕩均勻。分別吸取0. 5mL、l. OmLU. 5mL、2. OmL,2. 5mL稀釋液，各加適量無水乙醚定容至10mL。測定各試樣溶液在282nm處的紫外吸光度，以吸光度為縱坐標、麥角固醇濃度為橫坐標，繪製麥角固醇標準曲線，如圖2所示。②取發酵液8. OmL, 5000r/min離心IOmin,棄上清液,沉澱用蒸懼水離心洗漆3次後，轉置250mL三角瓶中，加入質量百分比30%的氫氧化鉀溶液20mL和質量百分比95%的乙醇12mL，沸水浴中皂化I. 5h ;再次加入質量百分比95%的乙醇4mL，皂化lh。冷卻至室溫後，加乙醚50mL，劇烈震蕩15min，靜止2h，分層，取上層萃取液ImL至IOmL容量瓶定容，于波長282nm測定吸光度。參照同樣波長下所作標準曲線，即可知麥角固醇濃度。單位乾重細胞麥角固醇含量按下式計算麥角固醇含量(％)=CXV/WX 100%式中C一試樣中麥角固醇濃度(mg · mL-1)(由標準曲線查得)；V—萃取溶劑體積(mL) ;W—酵母菌的生物量(mg)。
單位體積發酵液麥角固醇的生產能力(mg/100mL) =IOOmL發酵液中所含的細胞生物量(mg) X幹菌體細胞中的麥角固醇含量(％)。II、生物量測定方法為取發酵液10. OmL於15. OmL塑料離心管中，5000r/min離心lOmin，棄上清液，用蒸餾水離心洗滌沉澱3次，然後用已烘乾稱重的濾紙片過濾，所得酵母菌體於60°C烘箱過夜至恆重，稱重，換算成每IOOmL發酵液的菌體量，即為細胞生物量(mg/ IOOmDo結果如圖3和4所示隨著二甲基亞碸置措脅迫馴化次數的增加，酵母菌株對二甲基亞碸的耐受性有所提高，細胞中麥角固醇含量也呈逐漸上升趨勢。所獲得的高耐受性釀酒酵母菌株scut-B6305的麥角固醇含量達到5. 63mg/g(乾重)，比出發菌株的的含量提高了30. 32%。而在經過五次的重複馴化後，耐受性菌株釀酒酵母scut-B6305的生物量得到了較大程度的恢復，其最大細胞生物量可達到I. 61g/100mL (乾重)，單位體積發酵液的生產能力可達到 90. 8mg/6,是出發菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae, AS2. 599)的 I. 91 倍，都極大地提高了菌株的生產能力。將該菌株命名為釀酒酵母scut_B6305 (Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏在位於中國武漢的中國典型培養物保藏中心,保藏日期為2012 年 4 月 10 日，保藏編號為 CCTCC N0:M2012105。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種酵母麥角固醇高產菌株，其特徵在於名稱為釀酒酵母SCUt-B6305(Saccharomyces cerevisiae scut_B6305),保藏於位於中國武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC N0:M2012105。
2.權利要求I所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法，其特徵在於包含以下步驟 (O高極性有機溶劑耐受性酵母菌株的初步篩選 將釀酒酵母出發菌株接入種子培養基中，28°C培養18 24h後按體積百分比10%轉接入發酵培養基中，28°C培養24h後加入二甲基亞碸，二甲基亞碸的終濃度為體積百分比12%，強制應激處置6小時，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基平板；待長出菌落後，挑選長勢好、菌落大的菌落再次接入種子培養基，進行再一輪篩選；其中，二甲基亞碸的起始濃度為體積百分比12%，每輪篩選二甲基亞碸濃度比上一輪濃度提高體積百分比1.0%，直至培養基平板上菌落形成率只能形成幾個菌落； (2)強極性有機溶劑置措耐受性酵母富集馴化和平板分離復篩 將初篩獲得的耐受性菌株接入種子培養基中，28 °C培養18 24h後按體積百分比10. 0%轉接入發酵培養基中，28°C培養24h後加入二甲基亞碸，濃度為步驟(I)所用的二甲基亞碸的最高濃度，於搖床上震蕩培養後塗布固體培養基平板，挑選長勢最好的菌落進行下一代馴化；經過五代的按步驟(I)所使用的最高濃度的二甲基亞碸置措馴化培養，得到酵母麥角固醇高產菌株。
3.根據權利要求2所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法，其特徵在於所述的種子培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然。
4.根據權利要求2所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法，其特徵在於所述的發酵培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水lOOmL，pH自然。
5.根據權利要求2所述的酵母麥角固醇高產菌株的選育方法，其特徵在於所述的固體培養基的組成為每13g麥芽汁培養基加水IOOmL,瓊脂2g，pH自然。
6.權利要求I所述的酵母麥角固醇高產菌株在生產麥角固醇中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種酵母麥角固醇高產菌株及其選育方法與應用。該酵母麥角固醇高產菌株的名稱為釀酒酵母scut-B6305，保藏於位於中國武漢的中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年4月10日，保藏編號為CCTCC NO:M2012105。本發明通過長時間不間斷地利用二甲基亞碸對酵母生產菌株進行應激定向馴化，選育出該酵母麥角固醇高產菌株。該酵母麥角固醇高產菌株的單位細胞麥角固醇含量達到5.63mg/g，比出發菌株提高了30.32%；其單位體積發酵液的生產能力為90.8mg/100mL，是出發菌株的1.91倍，可用於生產中獲得麥角固醇。
文檔編號C12R1/865GK102911883SQ20121036470
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者張毅, 林曉珊, 何小妮, 陳子健 申請人:華南理工大學