一種水黴菌孢子檢測試劑及檢測方法

2023-05-13 00:04:51 2

專利名稱:一種水黴菌孢子檢測試劑及檢測方法
技術領域：
本發明涉及菌類檢測技術，尤其涉及一種水黴菌孢子檢測試劑及檢測方法。
背景技術：
水黴病(Saprolegniasis),又叫膚黴病(Dermatomyucosis),是淡水魚類中最為常見的一種疾病。水黴菌是引起水生動物發生水黴病的主要病原，其適應溫度範圍廣，分布範圍亦很廣，一年四季都可以引起魚類發病。水黴菌隸屬於卵菌綱中的水黴目(Saprolegniales)、霜黴目(Peronosporales)和芽枝菌目(Blaslociadiales),其中水黴科(Saprolegniaceae)的水黴屬(Saprolegnia)、綿黴屬(Achlya)和絲囊黴屬(Aphanomyces)最為常見,是魚卵孵化、魚類培育和成魚養殖中主要的病原體。
水黴菌對宿主無嚴格的選擇性，在水生動物的各個生長階段均有發生，主要寄生在魚體傷口和死卵上，危害養殖魚類和降低魚卵孵化率。在適當條件下，水黴菌絲髮育為動孢子囊，動孢子囊內形成遊動孢子，遊動孢子逸出到水體中，當魚類皮膚或鰓受到機械損傷 及其他病原體的傷害時，魚體抵抗力降低，水黴孢子在傷口處萌發並開始寄生。
水黴菌傳統的檢測方法主要是通過遊動孢子釋放形式、有性生殖、無性生殖、菌絲形態等進行鑑定，然而這些結構的形成需要較長時間的發育，因而形態學方法難以短時間準確鑑定分離得到的水黴菌株。隨著分子生物學的快速發展，人們開始採用許多分子生物學手段，如DNA G+C mol1^含量測定、蛋白電泳技術、DNA指紋(DNA,Fingerprinting)、核糖體 rDNA 內部轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer, ITS)、擴增多態性 DNA(Randomamplification of polymorphic DNA, RAPD)等已有效的用於水黴菌的檢測中。但由於上述手段均需要昂貴的儀器設備、繁瑣的檢測過程以及對檢測人員較高的技術要求，而使其難以在基層普及推廣。
環介導等溫擴增(LAMP)技術(國際專利公開號W000/28082)是Notomi等在2000年開發出的一種新的核酸擴增方法，即針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恆溫條件下即可完成核酸擴增反應。已經廣泛應用於細菌、寄生蟲和病毒的定性檢測。該技術較常規PCR擴增方法提高了敏感性、特異性，並且具有操作簡單、設備要求低、檢測費用較少、等溫高效的特點。目前尚未有本方案中檢測水黴菌孢子或水黴菌菌絲團的檢測方法和檢測試劑盒。
因此本發明建立了檢測水產養殖水體中水黴菌孢子或水黴菌絲團的檢測方法和水產養殖水體中水黴菌孢子或水黴菌菌絲團的檢測試劑。

發明內容
本發明的目的是要解決傳統的水產養殖水體中水黴菌孢子或其菌絲團檢測方法存在繁瑣、費時費力、特異性低、對檢測的數據處理費時且準確性難以把握的問題。為解決上述問題，本發明採用的技術方案包括水產養殖水體中水黴菌孢子或其菌絲團的檢測方法和水產養殖水體中水黴菌孢子或水黴菌菌絲團的檢測試劑。[0008]本發明所建立的試劑盒特異性強，敏感性高；本發明水黴菌孢子或水黴菌菌絲團檢測方法利用所述試劑盒檢測，該方法方便、靈敏、準確、快速、便捷。
本發明提供的檢測試劑包括以下組分
(I)檢測反應液20mmol/L Tri-HCl ； IOmmoI/L (NH4) 2504 ； IOmmoI/LKCL ；0. I %Triton X-100 ;MgS0410mmol/L、dNTPslmmol/L、BetaineO. 6mmol/L、內引物(FIP 和 BIP)各I. 5 μ mol/L、外引物(F3和B3)各O. 8 μ mol/L及8U Bst DNA聚合酶大片段。
其中內引物FIP和BIP，外引物F3和B3分別是
SP-FIP
GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG
SP-BIP
TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC
SP-F3 GCAAGAAGCCGATGTCAAT
SP-B3 :GCGTTCAAAATTTTGATGACT。
(2)反應顯色液10 % SYBR Green螢光染料/TAE緩衝液；
(3)核酸裂解液
核酸裂解溶液A(100mmol/L Tris HCl，ρΗ9· O ；40mmol/L EDTA, ρΗ8· O)；
核酸裂解溶液BlO % SDS ；
核酸裂解溶液C氯化苄。
本發明還提供一種水黴菌的檢測方法，包括如下步驟
I)待檢樣品的核酸提取
使用本方案中的核酸裂解試劑提取待測樣品的核酸得到核酸提取液。
2)進行本方案中的檢測反應
向20 μ L檢測反應液中加入3 μ L步驟I的核酸提取液，60°C下反應45min ；
3)在步驟2中的檢測反應液中加入2 μ L反應顯色液，直接肉眼觀察顏色變化，反應液呈綠色說明反應呈陽性，反應液呈橘紅色說明反應呈陰性。
本發明方法簡單、費用低、操作簡便，檢測操作不需要費用高昂的儀器，費用低廉操作簡便，檢疫人員或漁民即可在魚塘附近進行現場採樣操作。本方法克服了傳統的養殖水體中水黴菌孢子或水黴菌絲團檢測方法的檢測周期長、步驟繁瑣、技術性強等缺點，使得廣大檢疫人員和漁民可以及時的預警養殖池塘水黴病得爆發。


圖I示出的是檢測反應可視化結果
其中，
A試管中是水黴菌JLl ；
B試管中是陰性對照水；
C試管中是近平滑念珠菌標準株；
圖2示出的是檢測反應電泳結果
其中，
I號試管中是陰性對照水；[0038]2號試管中是水黴菌JLl ；
3號試管中是近平滑念珠菌標準株；
圖3示出的是水黴菌特異性檢測電泳結果
圖中
I號試管中是水黴菌JLl ；
2號試管中是水黴菌L2 ；
3號試管中是水黴菌L5 ；
4號試管中是水黴菌L6 ；
5號試管中是水黴菌L7 ；
6號試管中是對照例黴菌節菱孢菌；
7號試管中是對照例白色念珠球菌；
8號試管中是熱帶念珠菌；
9號試管中是近平滑念珠菌標準株。
具體實施方式
下列實施例進一步說明本發明，但不應當作本發明的限制。
發明水黴菌孢子或水黴菌菌絲團檢測試劑，包括水黴菌孢子或菌絲團核酸提取試劑和檢測反應試劑，所述檢測反應試劑中含有用於檢測水黴菌擴增核酸引物組，該引物組包含引物SP-FIP、SP-BIP、引物SP-F3、SP-B3，其特殊之處是所述引物SP-FIP、引物SP-BIP、引物SP-F3、引物SP-B3分別為
SP-FIP
GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG
SP-BIP
TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC
SP-F3 GCAAGAAGCCGATGTCAAT
SP-B3 :GCGTTCAAAATTTTGATGACT。
所述檢測反應試劑包括以下組分
(I)檢測反應液20mmol/L Tri-HCl、10mmol/L(NH4)2S04、10mmol/LKCL、0. I %Triton X-100> MgSO41OmmoI/L> dNTPslmmol/L> BetaineO. 6mmol/L> 內引物(FIP 和BIP) I. 5 μ mol/L、外引物(F3 和 B3) 0. 8 μ mol/L 及 8U Bst DNA 聚合酶大片段;
(2)反應顯色液10% SYBR Green螢光染料；
(3)核酸裂解液
核酸裂解溶液A (100 mmol/L Tris HCl，pH 9. O ；40mmol/L EDTA, ρΗ8· 0)；
核酸裂解溶液BlO % SDS ；
核酸裂解溶液C氯化苄。
實施案例一
本發明應用於水黴病的預警，即水產養殖水體中水黴菌孢子濃度的檢測方法，其特殊之處是按照以下步驟
待測樣品(水產養殖水體中水黴菌孢子)收集，用定量吸管吸取ImL待測水樣，10倍倍比稀釋成5個梯度，樣品分別為1號管樣品為ImL待測水樣原液、2號管取I號管100 μ L樣品加入900 μ L雙蒸水中(相當於I號管的KT1濃度)、3號管取2號管IOOyL樣品加入900 μ L雙蒸水中(相當於I號管10_2濃度)、4號管取3號管100 μ L樣品加入900 μ L雙蒸水中(相當於I號管10_3濃度)、5號管取4號管IOOyL樣品加入900yL雙蒸水中(相當於I號管10_4濃度)；
I)待測樣品核酸提取，離心收集待測樣品(水產養殖水體中的水黴菌孢子)棄去上清，加入500 μ L核酸裂解液A充分混勻；再加入100 μ L核酸裂解液B和300 μ L核酸裂解液C劇烈震蕩；
2)進行檢測反應，取20 μ L反應緩衝液，加入3 μ L步驟I的核酸提取液；
3)在60°C反應45min後加入2 μ L反應顯色液,反應呈綠色說明樣品呈陽性,若呈橘紅色說明樣品呈陰性。也可以在顯色液顯色後利I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在紫外分析儀下觀察，如果發現有階梯狀的擴增特徵條帶，說明檢測樣品呈陽性。
檢測結果的分析見表I
權利要求
1.一種水黴菌檢測試劑，包括以下組分 (1)檢測反應液
20mmol/L Tri-HCl
I Ommo I/L (NH4)2SO4
IOmmoI/L KCL
0.1% Triton X-IOO
MgSO41 Ommo I/L ；
dNTPslmmol/L ；
BetaineO. Bmmol /I,； 內引物FIP和內引物BIP1. 5iimol/L ； 外引物F3和外引物B30. 8 u mo I/L ； 8U Bst DNA聚合酶大片段。
其中內引物FIP和BIP，外引物F3和B3分別是 SP-FIP
GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG
SP-BIP
TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC
SP-F3 GCAAGAAGCCGATGTCAAT
SP-B3 :GCGTTCAAAATTTTGATGACT。
(2)反應顯色液10%SYBR Green螢光染料/TAE緩衝液； (3)核酸裂解液，包括
核酸裂解溶液 A ； IOOmmoI/L Tris HCl，pH9. 0、40mmol/L EDTA, pH8. 0 ； 核酸裂解溶液B :10% SDS ； 核酸裂解溶液C :氯化苄。
2.一種使用權利要求
I所述的水黴菌檢測試劑進行檢測的方法，包括以下步驟 1)待測樣品核酸提取，離心收集待測樣品棄去上清，加入500u L核酸裂解液A充分混勻；再加入100 u L核酸裂解液B和300 u L核酸裂解液C劇烈震蕩得到核酸提取液； 2)進行檢測反應，取20y L檢測反應液(I)，加入3 y L步驟I的核酸提取液； 3)在601反應451^11後加入2111反應顯色液(2)，反應呈綠色說明樣品呈陽性，若呈橘紅色說明樣品呈陰性；或者在加入反應顯色液顯色後利用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果在紫外分析儀下觀察，如果發現有階梯狀的擴增特徵條帶，說明檢測樣品呈陽性。
專利摘要
本發明涉及菌類檢測技術，提供的水黴菌檢測試劑包括以下組分(1)檢測反應液20mmol/L Tri-HCl；10mmol/L(NH4)2SO4；10mmol/L KCL；0.1％Triton X-100；MgSO4 10mmol/L；dNTPs1mmol/L；Betaine0.6mmol/L；內引物FIP和內引物BIP1.5μmol/L、外引物F3和外引物B30.8μmol/L；8U BstDNA聚合酶大片段；(2)反應顯色液10％SYBR Green螢光染料/TAE緩衝液；(3)核酸裂解液，包括核酸裂解溶液A100mmol/L Tris HCl，pH9.0、40mmol/L EDTA，pH8.0；核酸裂解溶液B10％SDS；核酸裂解溶液C100％氯化苄。本發明方法簡單、費用低、操作簡便，檢疫人員可在魚塘附近進行現場採樣操作。
文檔編號C12Q1/68GKCN102827945SQ201210369174
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月27日
發明者呂利群, 王浩, 張楠 申請人:上海海洋大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan