弓形蟲IgM抗體檢測試劑及應用的製作方法

2023-05-14 06:34:21

專利名稱：弓形蟲IgM抗體檢測試劑及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體檢測試劑，具體地說是涉及弓形蟲IgM抗體檢測試劑及其製備方法和用途背景技術現有檢測弓形蟲IgM抗體的方法主要是酶聯免疫法和免疫膠體金法，其基本的理論依據均是利用抗原抗體的特異性結合而製備的。其中免疫膠體金法雖然具有操作簡便、快速，無需專業人員和專業儀器的優勢，但目前國內外的免疫膠體金法產品的特異性和靈敏度均比酶聯免疫法差；而酶聯免疫法又有間接法和捕獲法兩種，間接法試劑盒操作也較簡便、快速，但特異性和靈敏度又比捕獲法差。國內外現有的捕獲法試劑盒有二種，一種是抗原直接標記酶的，但其靈敏度不夠高；另一種是利用弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體，即先加入工作濃度的弓形蟲抗原於酶標板孔中與特異性抗體反應一段時間，洗板後再加入工作濃度的酶標記弓形蟲單抗於板孔中反應一段時間，其操作過程分三步進行，反應時間長，操作複雜，用戶在使用時需要自行稀釋弓形蟲抗原或酶標弓形蟲單抗。甚至有些試劑盒中抗弓形蟲單克隆抗體沒有標記酶，而需再加入酶標記抗鼠IgG抗體來完成反應。

發明內容
本發明的目的是為克服現有技術中的缺陷，提供一種捕獲法檢測試劑，具有靈敏度高、特異性強、重複性好、操作簡單，用戶使用時無需稀釋弓形蟲抗原及酶標記的抗弓形蟲單抗。
本發明的另一目的是提供該試劑在檢測弓形蟲IgM抗體中的應用。
本發明的技術方案在於用抗人IgM-μ鏈單克隆抗體包被微孔板、弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體及其他輔助試劑製成檢測試劑，應用酶聯免疫捕獲法原理檢測人血清或血漿樣品中的抗弓形蟲IgM抗體。
本發明弓形蟲IgM抗體檢測試劑，是由弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體及其他輔助試劑組成，其特徵是將酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合，配製成可供檢測的工作濃度。
所述的弓形蟲IgM抗體檢測試劑，其中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合液中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體工作濃度為1∶5000～1∶10000，弓形蟲抗原的工作濃度為40～100μg/ml。
所述的弓形蟲IgM抗體檢測試劑，其中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體是採取2株抗弓形蟲單克隆抗體標記辣根過氧化物酶後，等體積混合，再與弓形蟲抗原用含10％小牛血清、5％蛋清的PBS緩衝液配製成而成。
一種弓形蟲IgM抗體檢測試劑盒，包括上述的檢測試劑。
本發明弓形蟲IgM抗體檢測試劑盒，其組成為預包被抗人IgM-μ鏈單克隆抗體的微孔板、酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合物、陽性對照、臨界對照、陰性對照、顯色液A、顯色液B、終止液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、密封袋、不乾膠、記錄紙、說明書。
上述試劑組成中，抗人IgM-μ單克隆抗體，由自備的雜交瘤細胞株，經常規方法製備腹水，以硫酸銨鹽析法提純抗體。
弓形蟲抗原的製備方法弓形蟲RH蟲株由本發明人保種。弓形蟲RH株經Vero細胞傳代培養擴增，收集原蟲並經磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，以G3砂蕊漏鬥過濾，去除細胞等雜質，收集蟲體，原蟲純度＞98％。反覆凍融3次，再以超聲波粉碎，4℃10000轉/分(rpm)離心30分鐘，取上清作為試劑盒使用的弓形蟲抗原。
上述組成中的陽性對照、臨界對照、陰性對照、顯色液A、顯色液B、終止液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液等均為本領域常用的試劑，如陽性對照為抗弓形蟲IgM抗體陽性人血清，臨界對照為抗弓形蟲IgM抗體弱陽性人血清。
本發明的有益效果在於常規捕獲法酶聯免疫試劑，是分別將弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體加入酶標板孔中，即先加入工作濃度的弓形蟲抗原於酶標板孔中與特異性抗體反應一段時間，洗板後再加入工作濃度的酶標記弓形蟲單克隆抗體於板孔中反應一段時間，其操作過程分三步進行，反應時間長，操作複雜，用戶在使用時需要自行稀釋弓形蟲抗原或酶標弓形蟲單抗，甚至有些試劑盒中抗弓形蟲單克隆抗體沒有標記酶，而需再加入酶標記抗鼠IgG抗體來完成反應。
而本發明是將抗弓形蟲單克隆抗體酶標記物與弓形蟲抗原直接混合配製成工作濃度，用戶在使用時無需稀釋，無需臨時將兩者混合，無需加兩次，從而簡化了操作步驟，一步即可完成，縮短了反應時間。
本發明臨床試驗數據本試劑與義大利DiaSorin公司平行檢測450例血清樣品，本試劑和DiaSorin試劑檢測同時陽性的血清有11例，同時陰性的血清有438例，本試劑陽性而DiaSorin試劑陰性的血清有1例，本試劑陰性而DiaSorin試劑陽性的血清有0例。本試劑和DiaSorin試劑比較，其靈敏度為100％，特異度為99.8％，假陽性率為0.2％，假陰性率為0，粗一致性為99.8％，調整一致性為97.9％，約登指數為0.998，陽性預示值為91.7％，陰性預示值為100％。本試劑與義大利DiaSorin公司同類試劑相比較，其特異性好，靈敏度高，符合率高，重複性好，並且操作快速、簡便，結果判斷簡單。應用本發明診斷試劑盒(酶聯免疫捕獲法)進行弓形蟲IgM抗體檢測，對於優生優育及弓形蟲病防治工作具有重要意義。
具體實施例實施例1抗弓形蟲單克隆抗體製備1、材料和方法1.1BABL/C小鼠SPF級，雌性，4～6周齡，體重18～22克。
1.2免疫用弓形蟲抗原弓形蟲RH蟲株由本公司保種。弓形蟲RH株經小鼠腹腔傳代培養擴增，收集原蟲並經PBS洗滌，以G3砂芯漏鬥過濾，去除小鼠腹腔細胞等雜質，收集蟲體，原蟲純度＞98％。反覆凍融3次，作為免疫原。
1.3小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0骨髓瘤細胞株。
1.4其它試劑和消耗物品，均為本領域所公知的，在此略過。
2、免疫小鼠取弓形蟲抗原加等量0.2％利復星，混勻，第一次於小鼠腹腔注射，14天後於背部皮下注射，間隔14天於皮下注射，共注射5次，每次抗原注射量均為每隻小鼠40微克的抗原蛋白。
3、細胞融合間接ELISA法測定免疫血清效價，選擇效價最高的免疫小鼠，於融合前3天腹腔注射60微克抗原。無菌取小鼠脾臟，製成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0按10∶1的比例混合，用50％PEG進行融合。融合後的細胞用HAT選擇培養基於37℃，二氧化碳含量為5％的二氧化碳培養箱培養，每3天用此培養基換液一次，直至克隆細胞形成。
4、篩選分泌抗弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤用間接ELISA法檢測細胞培養上清，陽性孔用有限稀釋法連續克隆化3次。得到穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株。
5、雜交瘤細胞庫的建立5.1原始細胞庫的建立將融合細胞管、一次或多次克隆的細胞管及鑑定證明特異性、體外連續培養3個月以上穩定分泌抗體的細胞管保存於專用的液氮罐中。
5.2主細胞庫的建立將原始細胞庫的雜交瘤細胞株全面檢定合格後的細胞株擴大培養後，每株細胞凍存20管作為主細胞庫。
5.3工作細胞庫的建立從主細胞庫的細胞管大量培養，經抗體活性、支原體複查合格後凍存1批細胞管，每批不少於20管，每次生產時取1管復甦，用於製備腹水，不再凍存。
6、單克隆抗體的製備6.1腹水的製備6.1.1雜交瘤細胞株培養6.1.2從工作細胞庫中取出1支細胞，37℃水浴中迅速融化，吸取凍存管中細胞到裝有預冷4ml雜交瘤完全培養基的15ml離心管中，離心後棄去上清，用完全培養基重懸後加入75cm2培養瓶中，置37℃ 5％CO2培養箱中培養。
6.1.3取處於對數生長期的細胞，離心棄上清，用預冷的無血清的RPMI1640培養基重懸並洗滌細胞2次，以適量的培養基重懸細胞到2～5×106個/100ul。
6.1.4小鼠腹腔注射雜交瘤細胞株，取100ul注射於用降植烷處理過的BALB/C鼠腹腔。
6.2、腹水收集6.2.1小鼠腹水形成後可見腹腔明顯變圓、腫脹，取腹水並用15ml離心管置於冰上收集，立即加硫柳汞，至終濃度為0.01％。於4℃待用。
6.3、單克隆抗體的純化及活性測定6.3.1單克隆抗體的純化經過預處理的腹水，12000rpm、4℃離心30分鐘，取上清。加入與上清體積等量的0.01mol/L、PH7.4PBS緩衝液。室溫攪拌下逐滴緩慢加入2倍上清體積的飽和硫酸銨溶液。4℃靜置4小時，12000rpm，4℃離心30分鐘，取沉澱加入適量33％的飽和硫酸銨溶液，4℃靜置4小時，12000rpm，4℃離心30分鐘，取沉澱加入適量0.01mol/L、PH7.4PBS，並在此PBS中4℃透析過夜，換液三次。透析後的抗體於12000rpm，4℃離心30分鐘，除去不溶性沉渣，即可用於標記或加50％甘油-20℃凍存備用。
6.3.2單克隆抗體效價檢定用含1％BSA、0.1％Tween20、0.01mol/L PBS系列稀釋單克隆抗體，間接ELISA檢測抗體效價。
6.4單克隆抗體特異性的鑑定免疫印跡分析法分析單克隆抗體特異性。將弓形蟲速殖子抗原做電泳分離，轉印到硝酸纖維膜上，封閉後分別加入雜交瘤細胞培養上清，4℃反應過夜，用含有0.5％Tween20的PBS洗滌膜後，加入HRP標記羊抗鼠IgG，置室溫反應1小時，洗滌後，DAB顯色後，用去離子水終止顯色。結果抗弓形蟲單克隆抗體與弓形蟲抗原在28～36KD處有一條明顯的顯色帶。
實施例2試劑盒的製備本試劑盒的組成為(1)單抗人IgM微孔板 96孔 (8)濃縮洗滌液(10倍) 50ml×1瓶(2)酶標記物1瓶 (9)樣品稀釋液 50ml×2瓶(3)陽性對照(直接使用) 1支 (10)終止液 1瓶(4)陰性對照(直接使用) 1瓶 (11)密封袋 1個(5)臨界對照(直接使用) 1支 (12)不乾膠 2片(6)顯色液A 1瓶 (13)記錄紙 1份(7)顯色液B 1瓶 (14)說明書 1份其中96孔單抗人IgM微孔板是用抗人IgM-μ鏈單克隆抗體包被。
酶標記物是採取2株自製的抗弓形蟲單克隆抗體標記辣根過氧化物酶後，等體積混合，再與弓形蟲抗原用含10％小牛血清、5％蛋清的PBS緩衝液配製成而成。抗弓形蟲單克隆抗體酶標記物工作濃度為1∶5000～1∶10000，弓形蟲抗原的工作濃度為40μg/ml、或80μg/ml。
本試劑盒其它組分為陽性對照是抗弓形蟲IgM抗體陽性人血清，陰性對照是抗弓形蟲IgM抗體檢測為陰性的5份混合的正常人血清，臨界對照是抗弓形蟲IgM抗體弱陽性人血清，顯色液A是過氧化氫-檸檬酸磷酸鹽緩衝液，顯色液B是TMB-檸檬酸磷酸鹽緩衝液，濃縮洗滌液是含吐溫-20的磷酸鹽緩衝液，樣品稀釋液是磷酸鹽緩衝液，終止液是0.5mol/L的硫酸溶液。
實施例3試劑盒應用
1、樣本要求本試驗用血清或血漿進行檢測，用量為10μl。血清或血漿勿使用染菌、脂血或溶血樣品。按照標準方法收集血清，室溫保存樣品不要超過8小時，若實驗在8小時以後進行，需將樣品保存在2～10℃，如保存超過1周則保存在-20℃。
2、操作程序1、試劑盒在室溫平衡20～30分鐘。濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水10倍稀釋。
2、樣品1∶100稀釋將樣品稀釋液1ml加入一潔淨小管內，加10μl待檢樣品，充分混勻。
3、將板條固定於板架上，剩餘的板條用不乾膠密封並放入密封袋中保存。每孔加入稀釋後樣品100μl。陽性對照、陰性對照各加2孔，臨界對照加3孔，100μl/孔。另留一孔不加任何液體為空白對照。置37℃30分鐘。
4、甩淨孔中液體，洗板3次，每次停留1分鐘後甩淨拍幹，除空白對照外每孔加酶標記物50μl，置37℃30分鐘。
5、甩淨孔中液體，同上洗板3次，拍幹後各孔滴加顯色液A、B各50μl，置37℃避光10分鐘，每孔立即加入終止液50μl，混勻後用酶標儀450nm讀數判定結果。
3、質量控制以空白孔調零，450nm波長測定A值。陽性對照平均值大於0.50，陰性對照平均值小於0.15，臨界對照A值平均值介於0.15～0.60，證明實驗成立。
4、結果判定1、酶標儀設定波長450nm，先用空白調零，然後測定各孔A值。
2、樣品A值＜臨界對照A值均值為陰性，樣品A值≥臨界對照值均值為陽性。
權利要求
1.一種弓形蟲IgM抗體檢測試劑，是由弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體及其他輔助試劑組成，其特徵是將酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合，配製成可供檢測的工作濃度。
2.權利要求1所述的弓形蟲IgM抗體檢測試劑，其中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合液中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體工作濃度為1∶5000～1∶10000，弓形蟲抗原的工作濃度為40～100μg/ml。
3.權利要求1的弓形蟲IgM抗體檢測試劑，其中酶標記抗弓形蟲單克隆抗體是採取2株抗弓形蟲單克隆抗體標記辣根過氧化物酶後，等體積混合，再與弓形蟲抗原用含10％小牛血清、5％蛋清的PBS緩衝液配製而成。
4.一種弓形蟲IgM抗體檢測試劑盒，包括權利要求1～3之一所述的檢測試劑。
5.權利要求4的弓形蟲IgM抗體檢測試劑盒，其組成為預包被抗人IgM-μ鏈單克隆抗體的微孔板、酶標記抗弓形蟲單克隆抗體和弓形蟲抗原混合物、陽性對照、臨界對照、陰性對照、顯色液A、顯色液B、終止液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、密封袋、不乾膠、記錄紙、說明書。
全文摘要
本發明公開了弓形蟲IgM抗體檢測試劑及應用，涉及應用酶聯免疫捕獲法原理檢測人血清或血漿樣品中的抗弓形蟲IgM抗體。用抗人IgM－μ鏈單克隆抗體包被微孔板，以弓形蟲抗原和酶標記抗弓形蟲單克隆抗體及其他輔助試劑製成檢測試劑，其中抗弓形蟲單克隆抗體酶標記物和弓形蟲抗原混合，配製成可供檢測的工作濃度。本檢測試劑盒靈敏度高、特異性強、重複性好、操作簡單。
文檔編號G01N21/78GK1908667SQ200510036318
公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月5日 優先權日2005年8月5日
發明者湯漢文 申請人:珠海經濟特區海泰生物製藥有限公司