SPNP‑I在製備Nav1.2通道工具試劑中的應用的製作方法
2023-05-14 13:58:21 2
本發明涉及一種活性多肽在製備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學法製備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡寫為spnp-i）在製備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.2型鈉通道抑制劑中的用途。
背景技術：
電壓門控鈉通道廣泛分布於神經元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結構蛋白，其參與調節神經遞質的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時也是治療藥物作用的重要靶標之一。鈉通道在動作電位的產生和傳播過程中的關鍵性作用，電壓門控鈉通道成為很多動植物毒素的作用靶標。鈉離子通道的結構與功能關係研究已經成為國際上的研究熱點。電壓門控鈉通道很可能成為神經性和心血管等疾病的重要治療靶點。自然界的動物毒素是一類具有很高實用價值和應用前景的工具試劑或藥物導向物質，不僅是有毒動物抵禦天敵的有力武器，也是從事神經生物學和生理學研究、天然創新藥物開發以及蛋白質基礎研究的寶貴材料,同時也是研究離子通道的獨特「分子探針和解密器」。迄今為止，從多種動物（如蠍、蜘蛛、蛇以及海洋動物等）的毒液中鑑定到了很多作用於鈉通道的活性成分。它們通過與鈉通道的不同位置相結合從而引起通道的動力學特徵發生相應的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調製劑作用於鈉通道的分子機制，除了在理論上可深入推測鈉通道亞型之間的功能活動區別和門控活動機制外，還可以為將它們開發成治療人類相關疾病的新藥提供充分的理論基礎和廣闊的應用前景。
技術實現要素：
本發明旨在於提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i在製備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.2型鈉通道抑制劑中的應用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i（簡寫為spnp-i），其胺基酸序列為：
nh2-alacysglyglnphetrptrplyscysglygluglylysproprocyscysalaasnphealacyslysileglyleutyrleucysiletrpserpro-oh,
其特徵在於廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組份用於製備nav1.2型鈉通道抑制劑。
所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鈉肽-i在製備電壓門控鈉通道工具試劑-nav1.2型鈉通道抑制劑中的應用，其特徵在於，所述的蜘蛛抑鈉肽-i的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。
該蜘蛛抑鈉肽-i作為單一有效活性組分用於製備nav1.2型鈉通道抑制劑，以細胞外給藥的方式製備成nav1.2型鈉通道工具試劑。
蜘蛛抑鈉肽-i在製備nav1.2型鈉通道工具試劑或抑制劑時，配製細胞外給藥的劑量為1μmol/l。
蜘蛛抑鈉肽-i對nav1.2型鈉通道的抑制呈現濃度依賴性和時間依從性，是一種較好的nav1.2型鈉通道工具試劑。
附圖說明
圖1是spnp-i對nav1.2型鈉通道的影響。
圖2是spnp-i抑制nav1.2型鈉通道的時間-效應關係曲線。
具體實施方式
為了更好的理解和更充分公開本發明，下面將通過細胞外給藥途徑，採用轉染hek293t細胞模型來說明蜘蛛抑鈉肽-i的nav1.2型鈉通道抑制作用。
1、實驗材料和方法
1.1人胚腎細胞（hek293t）的培養及轉染
hek293t細胞適應酸性環境,ph值在6.9～7.1時,可順利貼壁生長,換液時動作要輕。一般用高糖的dmem培養基。
1.1.1細胞的傳代培養
(1)hek293細胞傳代時機為達80-90%匯合，待細胞在60mm培養皿中長滿後，吸掉培養液。
(2)加適量pbs漂洗兩次，吸掉。
(3)加0.5ml0.25%胰酶，搖勻。37℃培養箱中胰酶處理2-3min。於顯微鏡下觀察細胞是否全部脫壁。加入適量10%新生牛血清dmem培養液終止胰酶反應。
(4)用移液管將細胞團輕輕吸打成單個細胞。將細胞按1∶3平均分入裝有預熱培養液的培養皿中，於37℃、5%co2、15%相對溼度培養箱中培養。
1.1.2陽離子性的脂質體法轉染方法:
（1）在轉染前一天，對於35mm培養皿，每皿用2ml不含抗生素的培養液培養。
（2）轉染的當天，細胞密度最好達到80-90%，吸掉舊培養液，pbs漂洗一次，換成2ml無血清opti-mem培養液。
（3）每皿dna用量為4µg，用無血清無血清opti-mem培養液分別稀釋到250µl，輕輕混勻,室溫靜置5min。
（4）同時將10µl脂質體加入250µl無血清opti-mem培養液中，輕輕混勻，室溫靜置5min。
（5）將稀釋的脂質體加入等體積dna混勻，室溫靜置20min。
（6）將0.5mldna/脂質體複合物輕輕混勻，滴加入細胞中，輕輕混勻，常規條件培養。
（7）讓dna/脂質體複合物與細胞接觸4-6h後，換成10%新生牛血清dmem培養液培養。24-72h內可以進行膜片鉗實驗。
1.2膜片鉗電生理活性實驗
膜片鉗實驗均在室溫（25±1℃）進行，採用全細胞膜片鉗技術。挑選質膜光滑可見、胞質均勻的有綠色螢光的hek293t細胞作為實驗細胞。電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進行。計算機記錄和分析系統採用pulse+pulsefit8.0軟體。玻璃電極管為硼矽酸鹽玻璃毛細管（南京泉水教學實驗器材廠）。玻璃電極兩步拉制而成，經拋光儀(narishige,japan)拋光後電極尖端直徑約為3µm，充灌電極液後電極電阻為1-3mω。膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，整個實驗過程中溫度的變動最多上下不超過2℃。採用sigmaplot9.0軟體分析實驗結果。
2、實驗結果與分析
2.1spnp-i對nav1.2型電壓門控鈉通道的影響
運用全細胞膜片鉗技術，我們進一步研究了spnp-i對瞬時表達於hek293t細胞的鈉通道亞型nav1.2的抑制作用。鈉通道亞型電流以同一種去極化方式誘導：將細胞膜電位鉗制在-100mv，以20ms的時程給予一測試電壓-10mv，每隔5s重複一次。
如圖1所示，1μmspnp-i對nav1.2通道的失活有一定的抑制作用，能明顯延緩nav1.2鈉通道的失活，其抑制程度為43%。spnp-i對nav1.2通道的抑制或延緩失活作用呈現明顯的濃度依從性，spnp-i的半數有效作用劑量ic50為870nmol/l。spnp-i對nav1.2鈉通道的失活抑制具有時間依從性，當濃度增加為1µm時，可在約3min的時間內達到最大抑制程度（見圖2）。
sequencelisting
長沙沁才生物科技有限公司
蜘蛛抑鈉肽-i
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廣西纓毛蛛
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