克魯維酵母屬作為宿主菌株的製作方法

2023-05-14 07:37:16

專利名稱：克魯維酵母屬作為宿主菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及製備和用克魯維酵母生產有興趣的多肽，該多肽可分泌到生長培養基中。作為本發明的例子是用於在克魯維酵母中生成凝乳酶及其前體，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)和人血清清蛋白(HSA)的序列。
在微生物中生產肽的光明前途由於某些因素而變得暗淡。很多情況下，產生了肽卻留在胞質中，內含殘留物使得需要蛋白變性，再復性。然而僅部分成功或有時失敗。另一些情況，產生的肽遭受降解，不僅使產率降低，而且得到的是難以分離的混合物。為有效地解決這些困難，已研究將所需肽分泌到營養基質中去的可能性。然而這種分泌成功有限，原因是，不是所有蛋白都能在所用的宿主中分泌。既使能分泌，肽的生成過程會導致產生與所需肽的組分和/或構型不同的產物。因此，人們的興趣在於發展在一定條件下有效而經濟地生產活性肽的系統，這種條件允許在各種環境中，體內或體外用這種肽。
歐洲專利申請(EPA)0096430揭示了用克魯維酵母屬作為宿主克隆和表達外源基因。然而沒提及將蛋白分泌到生長基質的可能性。
Boyle等人在EMBOJ.(1984)31581-1585中和Innis等人在Science(1985)22821-26中敘述了麴黴菌(Aspergillus)澱粉葡糖苷酶的前導序列。Bruenig等人敘述了乳糖酶啟動子(NucleicAcids.Res.(1984)122327-2341)。在歐洲專利申請0123544和Smith等人(Science1985，229∶1219)敘述了在酵母中使用與偶配型α-因子有關的信號肽，及用轉化酶和酸性磷酸酶指導異源蛋白的分泌。
Mellor等人(Gene，(1983)，24∶1-14)研究了在酵母中生產前凝乳酶原，凝乳酶原和凝乳酶。當在酵母中細胞內生產凝乳酶原時，僅有少量凝乳酶原是可激活的。Moir等人在DeuelopmentsinIndustrialBiology，(1985)，26∶75-85;Mellor等人，基因(1983)24∶1-14;Kingsman等人在BiotechnologyandGeneticEngineeringRiviewVol。3(1985)376-418中所述。由酵母產生的凝聚的凝乳酶原需要複雜的變性和復性方法以穩定酶原。(見WO83/04418和EP-A-0114506)。
提供的生產肽系統包括克魯維酵母宿主株，含用於克魯維酵母有效轉錄起始和終止區的表達暗盒，和一個在調節區的轉錄轉譯調節下任選的含分泌信號序列的基因。表達暗盒引入克魯維酵母宿主菌株，引入條件是所得轉化體穩定保持表達暗盒。天然存在的DNA和合成的基因均可用於生產感興趣的肽。


圖1是質粒pGBTe418圖解;
圖2圖解了質粒pGB901;
圖3敘述了從澱粉葡糖苷酶信號順序合成連接信號順序的寡核苷酸。
圖4描述一個合成信號順序。即用於合成前導區和推斷前導區蛋白質序列的合成的寡核苷酸。
圖5是表示由乳酸克魯維酵母(K.lactis)AG前導序列分泌的凝乳酶原的免疫吸印譜。該實驗用實施例5所述方法進行。用酸(pH2)處理用pGB905乳酸克魯維酵母轉化的培養物上清液2或6小時。
泳道1未處理;
泳道2處理2小時;
泳道3處理6小時。
圖6是來自pDM100PC的整個BamHI插入序列，包括釀酒酵母α因子和凝乳酶原融合肽以及轉錄調節區;
圖7是質粒pKS105限制酶圖。
圖8表示設計用於鑑定K.lactisα-因子DNA的寡核苷酸探針的方案。
圖9是為K.lactisα-因子編碼的DNA片段完整順序;
圖10描述了由於表達α-因子信號序列和凝乳酶原結構基因融合的一些質粒。
圖11是α因子前導序列/凝乳酶原融合結合點周圍的序列。
圖12是pAB309的BamHI/salI插入序列。
圖13代表使乳酸克魯維酵母α-因子前導DNA突變的引物序列。
1號引物間隔區缺失;
2號引物間隔區缺失+BSSHII位點。
圖14圖解質粒pUCG418。
圖15圖解質粒pGBtPA1。
圖16表示用血纖維蛋白溶酶原/纖維蛋白-瓊脂糖凝膠覆蓋的SDS聚丙烯醯胺凝膠上分析被乳酸克魯維酵母分泌的人t-PA。
泳道120ng由黑素瘤細胞產生的t-PA(kabi-vitrum);
泳道2從CBS2360培養物上清液中製得的樣品;
泳道3從用pGBtPA1轉化的CBS2360培養物上清液中製得的樣品。
圖17圖解質粒pGBtPA2;
圖18圖解質粒pGBHSA3;
圖19表示在10%聚丙烯醯胺凝膠上分析乳酸克魯維酵母分泌的HSA。按照Leammli的方法，在10%聚丙烯醯胺凝膠上分析用pGBHSA3轉化的CBS2360和CBS2360培養物上清液。泳道1含有標記蛋白(示出分子量)，泳道2和3的樣品來自對照菌株CBS2360的上清液，泳道4的樣品來自轉化體之一的上清液。
根據本發明，克魯維酵母細胞可提供有效而經濟地生產多肽的表達暗盒。表達暗盒有在克魯維酵母宿主細胞中有功能的轉錄和轉譯調節序列和在該調節區的轉錄轉譯控制下為所需多肽編碼的開放讀碼。開放該碼也可以包括一個由能將多肽分泌到生長培養基中的克魯維酵母識別的前導順序。所用克魯維酵母細胞可是實驗室菌株，也可是工業菌株。
表達暗合包括5′-3′方向轉錄，轉錄和轉譯起始調節區，編碼所需肽的開放碼，還需有為克魯維酵母識別的分泌信號序列和一個轉譯終止區。表達暗盒還包括一個轉錄終止調節區。起始和終止調節區在克魯維酵母中都是有功能的，能使所需肽有效表達，又不影響宿主本身活力和繁殖。
轉錄和轉譯起始調節區可對克魯維酵母是同源或異源的。特別有趣的是轉錄起始區是來自出現在克魯維酵母和其它酵母中的基因，其它酵母諸如釀酒酵母，Schiao酵母，Candida等，或其它真菌如絲狀真菌，麴黴菌、脈孢菌、青黴菌等。轉錄起始調節區可從糖酵解途徑的基因如乙醇脫氫酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，磷酸葡糖歧化酶，磷酸甘油酸激酶等中得到或取自可調節的基因如酸性磷酸酶，乳糖酶，澱粉葡糖苷酶等。
在特定情況下優選的在一個調節區序列取決於是否需要基本的或誘導的轉錄，與所需開放讀碼結合的啟動子的特殊效率，與來自轉誘導轉錄不同啟動子並具有控制區的強啟動子結合的能力，容易構建，等因素。這些調節區可在文獻中找到足夠的先例。見如EP-A-0164566。
在遺傳學修飾了的微生物中分泌異源蛋白可通過下面兩個方法之一完成。首先，前導序列與該蛋白是同源的;其次，前導序列與宿主是同源的。本發明中為在克魯維酵母中分泌異源蛋白其它有趣的補充包括用與克魯維酵母和所需肽異源的前導序列，或用專門設計的合成前導序列。為前一個前導序列編碼的DNA可經分離或人工合成得到。因此，開放該碼通常包括野生型或突變基因，在這些基因中信號順序常與剩餘的編碼序列;一個雜交或嵌合開放該碼，其中信號順序通常不與公開讀碼的剩餘部分相連;或一個合成序列，其中信號序列和開放讀碼合成為優選的密碼子;合適的限制酶點，新胺基酸序列等等，或它們的組合。可用的信號序列可得自下列基因如α-因子，轉化酶，澱粉葡糖苷酶，存在於結構基因中的天然或野生型信號順序，它們可被克魯維酵母，酵母，其它真菌如脈孢菌，曲酶菌和其它真菌細胞所識別。
特別令人感興趣的是所用信號順序能將所需肽分泌到培養基中而不是分泌到細胞質周圍的空間。大部分情況下，信號序列是開放讀碼的5′末端。然而在某些情況下，需要在開放讀碼內有信號序列。分泌用讀碼內信號序列見美國專利01774，338，397和Perara及Lingappa，J.CellBiology(1985)101∶2292-2301。插入開放讀碼的基因包括高表達的基本基因，如為糖酵解途徑的酶編碼的基因，及乳糖酶，澱粉葡糖苷酶等高表達可調基因，等等。
在酶母和動物細胞中，為達到最優基因表達，發現轉錄起始碼ATG周圍的核苷酸序列是重要的如，M.Kozak，Microbial.Revs.(1983)47∶1-45廣泛研究了在COS細胞中這些區對表達胰島素的影響。同樣，在高表達酵母蛋白時比在其它情況下更常發現一些特定核苷酸，這說明這些核苷酸對表達這些基因的重要作用。
為外源基因最優表達，修飾在起始ATG周圍的核苷酸序列裡很重要的。這可通過直接位點誘變或將外源基因融合到內源克魯維酵母基因，特別是融入如乳糖酶基因的高表達基因的碼中來完成。
正常情況下，在分泌過程中將信號前導序列從所需肽切下而不是在分泌過程後切下。當然兩種情況均會發生。通常，所用加工信號是具有信號序列的天然加工信號或來自天然的修飾的加工信號，而它仍能有效使所需肽信號水解為信號肽和加工信號肽。很多加工信號已被進行順序分析和確認，如α-因子(見美國專利4，546，082見參考資料)，澱粉葡糖苷酶，α-澱粉酶等。某些情況下，可用其它肽酶識別序列，但需要酶解以分離所需肽。這些序列包括二元肽，如KR，(D4)K和EA，它們可分別被KEX2，牛腸激酶，和一種酵母膜肽酶酶解。
所需肽可是宿主固有的或異源的，來源於原核或真核生物，真核生物包括真菌，原生動物，脊椎動物，非脊椎動物等等。肽產品可包括酶如乳糖酶，α-澱粉酶，β-澱粉酶，澱粉葡糖苷酶，凝乳酶等;哺乳動物肽如激素，白細胞介素，細胞激動素，cachexin;生長因子如血小板衍生的，表皮的，骨骼的等生長因子;生長激素;促濾胞激素;幹擾素(α-，β-和γ-);血因子如第五，六，七，八(VW或C)，九，十，十一或十二因子，血纖維蛋白溶酶激活因子(組織或尿的);血清蛋白如人血清清蛋白;集落生長因子(如GM)，紅血球生成素。thaumatin，胰島素等。
這些結構基因可以各種方法得到。當其氨基取序列已知時，可全長或部分人工合成，特別是需用酵母優選的密碼子。因此，全部和部分開放讀碼均可用克魯維酵母優選的密碼子合成。優選的碼可通過在克魯維酵母宿主大量生產的蛋白中測定，如糖酵解酶。合成順序的方法及得到的序列均可在文獻中查到。當合成公開讀碼一部分時及這一部分是天然衍生的時，合成部分可作為兩個天然部分間的橋，或可提供3′末端或5′末端。特別是當信號序列和為某肽編碼的公開讀碼從不同基因得來時，通常需用合成連接物。另一些情況，可用連接子，這時可在不同限制點插入不同片段或在連接子處取代一個序列。
大多情況下，部分或全部開放讀碼來自天然來源。鑑定所需序列的方法已廣泛記載，當然在各種情況下會遷到不同程度的困難。這些技術包括用探針，這時用至少一部分已知天然胺基酸序列，通過基因組或cDNA文庫尋找互補序列。此外，可誘導所需基因或細胞來自同一宿主不同分化部分時可通過比較產生的mRNA來探測不同的轉錄。其它的技術也有人舉例。
末端區可來自得到起始區的基因3′端區，或來自不同的基因。大多數末斷區是已知的，並發現可滿足來自相同或不同屬種的各種宿主。末端區通常根據其方便而不是根據其特殊性質而選擇的。它最好來自酵母基因，特別是釀酒酵母和克魯維酵母。
為開發表達暗盒，將包含調節區和開放讀碼的各種片段置於不同加工條件進行，如連接，限制，再接，體外誘變，引物修補，用連接子或連接物等等。因此，核苷酸轉換，顛換，插入，缺失等均可用於調節區或/和開放讀碼的DNA。
在構建表達暗盒時，不同DNA片段通常將克隆到合適克隆載體上，該載體可繁殖DNA，修飾DNA或通過連接，刪去一些序列，連接子等等。正常情況下，該載體至少能以相對高拷貝數在大腸桿菌中複製。克隆所用載體數是容易得到的載體有pBR322，pACYC184，pUC7-19，M13，Chron4A等等。
克隆載體的特點在於在大腸桿菌中有功能性的高效複製系統。克魯維載體還至少有一個單一的限制點，通常有多樣性的單一限制酶點，還可能包括多限制點，特別是為取代用的兩個同樣限制點。此外，克隆載體還有一個或多個用於選擇轉化體的標誌，標誌通常為抗細胞毒劑如抗生素，重金屬，毒素等，還可能提供營養缺陷型宿主的補充或對噬菌體的免疫性等。通過載體和暗盒的適當的限制，所謂適當即通過吃掉一個單鏈或添補單臂修飾末端;或加連接子，加尾提供平端;提供連接用互補端，將載體與表達暗盒或其一部分連接。
在開發暗盒時，每次DNA操作後，就需根據需要克隆和提取質粒，分析特定暗盒成分的順序，以保證得到合適的序列。根據操作的性質，從質粒上剪下所需序列，引入不同載體或將質粒限制酶解和根據需要對表達暗盒修飾。
某些情況下需用穿梭載體，這時該載體可在需不同複製系統的不同宿主中複製。這可能需要或不需要在兩種宿主中有功能的附加標誌。當需要這些標誌時，將其包括在載體中，這時含有暗盒，兩個複製系統，標誌的質粒可根據需要從一個宿主轉到另一個宿主。這種情況下，第二複製系統是一個在克魯維酵母中有功能的複製系統。可用的複製系統來自質粒，如果蠅克魯維酵母的pKD1質粒，病毒或克魯維酵母或其它種的(如釀酒酵母)染色體。這樣，該複製系統包括在酵母中發現的2微米質粒的複製系統和一個自我複製序列(ARS)基因如可用於中心體序列連接的序列等等。如果需要，可用同源區使表達暗盒整合到克魯維酵母宿主的基因組中。
特別令人或興趣的是本發明的組建物是來自克魯維酵母DNA染色體的序列，稱為KARS，它提供高的轉化率。通過篩選高轉化效率的克魯維維酵母DNA片段的文庫得到KARS基因。以此方式，可得到含KARS序列的片段，再用限制，再接，引物修補等進一步修飾片段得到約200bp及不大於5000bp的片段，通常是200-2000bp，從而加強了轉化效率。KARS基因的存在使K.lactis營養缺陷型種以至少103/μgDNA，通常為104/μg DNA或更多的頻率轉化為原養型。
本發明用不同克隆DNA組建物(質粒和病毒)轉化大腸桿菌的方式是不受限制的。連接，轉導，轉染或轉化如氯化鈣或磷酸鹽介導的轉化均可應用。相反，對酵母，大多的先有技術都是用鈣離子和2000-8000(通常是4000-7000)道爾頓的聚乙二醇結合使用來轉化原養型的。
轉化的其它方法包括在標準酵母培養基中培養克魯維酵母使密度達1-25，最好為4-10OD610。然後收穫克魯維酵母細胞，洗滌，用離液序列高的離子，特別是鹼金屬離子預處理，如鋰，鍶或鉫離子，優選的是其氧化物或硫酸鹽，最好為鋰鹽，常以2mM到1M濃度，最好為約0.1M。
將細胞與離液序列高的離子一起溫育，加入DNA，在適當溫度下一般為20℃-35℃)再溫育少許，(約5-60分鐘)。再加聚乙二醇，濃度最好為25～50%，其中加入等體積的聚乙二醇濃縮液將整個培養基稀釋到所需的終濃度。聚乙二醇是2000-8000道爾頓的，最好為4000-7000道爾頓的。溫育時間較短，一般為5～60分鐘，溫育培養基一般要在35-45℃，最好約42℃下熱處理1-10分鐘。
可用任何常用標誌供篩選。然而用於克魯維酵母的標誌比用於普通酵母的要窄。最好是抗卡那黴素和氨基葡糖苷G418，也可用色氨取代謝途徑中的基因補充物，如TRPI或在乳糖代謝途徑中的基因補充物如LAC4。
雖然選擇標誌操作方便，但也敘述了其它篩選轉化細胞的步驟。見例如G.Reipen等人的CurrentGenetics(1982)5189-193。除了用諸如β-內醯胺酶等指示酶外，還可通過它們的特定產物篩選轉化細胞。如對凝乳酶，可通過免疫學或酶方法來測定產物的合成。
所用載體可以是能在克魯維酵母染色體外保存的，或整合到其基因中。發現來自釀酒酵母的2微米質粒複製系統在克魯維酵母中染色體外保存。此外，可用中心體組合，如釀酒酵母的CEN3和高頻轉化序列如ARS或KARS。如果提供了篩選維持性，如補充物或克魯維酵母敏感的抗生素抗性，ARS等順序通常是以在染色體外維持。
在大規模發酵中，即使克隆質粒穩定性的少量損失都將極大地影響所需蛋白的最終產量。為增加重組分子在宿主細胞(如克魯維酵母)中的穩定性，可用整合到宿主染色體的重組分子。
在需要整合時，就需要一個與宿主染色體同源的序列，從而可發生同源重組。當然隨機整合也會發生，所以同源序列是優選的。當用同源序列時，至少需200bp同源序列，1000bp或更多則更好。此外，涉及整合時，需要結構基因的擴增。通過在選擇培養隨機提供一個有利篩選宿主的基因與所需結構基因一道，則可達到擴增的目的。因此，可用表達二氫葉酸還原酶，金屬硫因(metallothioneins)，胸腺嘧啶酶等的基因已用於各種宿主中，以實現擴增，這時這些基因保護基免受諸如氨甲蝶呤等毒素及如銅，汞等重金屬的毒害。
穩定複製所需載體包括來源於K.lactis的KARS載體，如pKARS12和pKARS2，其中質粒包括含在釀酒酵母質粒YRp7中的KARS12或KARS2的K.lactisDNA片段。用於整合的載體如pL4，一個攜帶質粒YRp7的雜交質粒，攜帶LAC4基因的K.lactisXhoIDNA片段。(見EP-A0096430)。
所需質粒包括含2微米質粒複製系統，LAC4基因，Tn601和Tn5卡那黴素抗性基因的質粒，它們都在克魯維酵母中有抗生素G418抗性。(Jimenez和Davis，Nature(1980)287∶869-871)。這個質粒在克魯維酵母中自我複製，在含葡糖，山梨醇和0.2μg/mlG418而不太高的KCl濃度的再生平板培養基上可通過抗G418篩選之。伏選的質粒包括TRR1基因，特別是來自釀酒酵母的該基因;及LAC4基因，特別是來自K.lactis的該基因;及來自Tn5的抗G418的Kan基因等等。
將上述載體及組建物引入合適宿主，克隆和表達所需結構基因。轉化後，5-6天內在再生培養基上出現菌落。用抗生素篩選時，先要篩選出不會自發突變為抗性株的菌落。用本發明的質粒及方法，發現約有5%抗性菌落含組建質粒，它們以至少4個轉化體/μg質粒DNA的轉化率轉化。當基於LAC4基因篩選時，用乳糖作唯一碳源，0.6MKCl作為滲透壓穩定劑，所有殘留菌落均為轉化體，沒有自發回復突變。在適當溫度如30℃下約4-5天得到20個轉化體。
作為宿主，克魯維酵母是特別適於生產異源蛋白的，如生產和萃取凝乳酶和它的前體前凝乳酶原，擬凝乳酶和凝乳酶原，生產人血清清蛋白(HSA)，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)和thaumatin及其前體。雖然其它菌株如釀酒酵母也以可觀量產生凝乳酶原，但產生的凝乳酶原不能以活性或可激活形式提取出來。我們吃驚地發現，用克魯維酵母生產的總量在90%以上的凝乳酶原可根據非常簡單的標準技術提取出有活性的該物質。
可用克魯維酵母任何種，無論是實驗室的還是工業菌株，最好用工業菌株。為得到工業菌株，可從天然源分離，也可從保藏單位得到，或用突變等方法修飾菌株。工業菌株的特點在於可抵抗遺傳交換，是原養的，或通過引入單個基因到宿主株製成原養的，通常篩選用於改進肽的生產。在克魯維酵母屬的各種中可用的有乳酸克魯維酵母(K.laetis)，脆壁克魯維酵母(K.fragilis)，保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)，耐溫克魯維酵母(K.thermotolerans)，馬克斯克魯維酵母(K.marxiaus)等。克魯維酵母各種已列在GRAS上(GenerallyRecogniaedAssafe)。將它們用於體內生產一些產品及食用一般都不必特殊的政府批准。
野生型和突變型的克魯維酵母，特別是乳酸克魯維酵母或脆壁克魯維酵母常用作宿主。最令人感興趣的是乳酸克魯維酵母SD11lac4trpl和乳酸克魯維酵母SD69lac4和野生型菌株CBS2360(見EP-A-0096430)。
為保持含質粒的轉化體的選擇壓力，要用篩選培養基，如酵母含氮培養基，對K.lactisSD69lac4(PTY75-LAC4)和SD69lac4(PL4)需用2%乳糖代替葡萄糖，對乳酸克魯維酵母SD11lac4trpl(pKARS12)需用酵母含氮培養基(Difco)加2%葡萄糖(見EP-A0096430轉化體。與此相似，對含有抗生素抗性如抗G418質粒的菌株，可培養在含該抗生素的培養基中。
當用雜交質粒大量生產所需蛋白時，從雜交質粒至少基本上除去全部細菌DNA序列是有用的。
根據所需結構基因的性質，表達產物可能殘留在宿主細胞質內或被分泌出來。發現不管是留在細胞內還是分泌出來的均為可溶的。當表達產物留在宿主細胞中時，一般可需有誘導轉錄起始區，從而直到轉化體達高密度時，很少或沒有所需產物表達。待形成表達產物足夠時間後，才可用常規方法分離細胞，如離心，溶胞和提取所需產物。根據產物性質和用途，用不同方法純化溶胞物，如層析，電泳，溶劑萃取，結晶等等。純度從50%～90%或更高不等。最高可達基本和非基本轉錄起始區，這取決於生產所需蛋白或多肽所用的發酵方法。表達產物可分泌到培養基中，當培養可部分取出，用親和層析萃取所需產物時，生產可連續進行。重加基本成分，除去消耗的基質以再循環生產。
本說明書中提及的所有出版物和專利申請都表示了本領域普通專業人員的水平。所有出版物和專利申請均包括在參考資料日錄中。
下面的例子是為說明本發明，不構成對其的限制。
實驗部分實施例1含有長乳糖酶啟動子序列的凝乳酶表達質粒的構建A.pUCla56的構建從乳酸克魯維酵母菌株CBS2360分離出染色體DNA(DasandHollenberg，CurrentGenetics(1982)5∶123-128)，用XhoⅠ裂解，並按照在蔗糖梯度下的大小分離之。在硝化纖維素濾紙上準確地定出DNA的位置後，用得自質粒pK16的LAC4探針檢測出含有乳糖酶基因的部分(見歐州專利申請0096430，實施例16，C2)。將含有LAC4基因的DNA克隆到質粒pPA153-215的SsaⅠ位點上(Andreoli，Mol.Gen.Genet.(1985)199∶372-380)，得到質粒pPA31。含有乳糖酶基因的pPA31的XbaⅠ片段再克隆於pUC19的XbaⅠ位點中(Yanisch-Perronetal.Gene(1985)33∶103-119)，可得到質粒pUCla56。
B.在乳糖基因的終止區引入G418抗性基因從質粒pGBTeG418中得到含有G418抗性標記的終止片段。含有pGBTeG418的大腸桿菌已於1987年2月26日貯存在CBS，貯存號為CBS184.87並已於1988年8月3日貯存在CCTCC，貯存號為M88084。質粒pGBTeG418(見圖1)由如上所述的pPA153-215和包括3.7KbBamHⅠ乳酸克魯維酵母乳糖酶終止片段(Breuningetal.，Nucl.AcidRes.(1984)12∶2327-2341)和Tn5基因(Reissetal.，EMBOJ.(1984)3∶3317)在內的5.6Kb片段所組成，在酵母啟動子醇脫氫酶(ADH)的指導下賦予對G418的抗性，這與Bennetzen和Hall在J.Biol.Chem.(1982)257∶3018-3025中所述相似。
C.含有G418抗性基因和編碼凝乳酶原DNA的質粒pGB900之構建在用SalⅠ和XbaⅠ切開的pUC19中使來自含有G418抗性基因的質粒pGBTeG418的3.6KbHindⅢ-XbaⅠ片段(見實施例1B)和含有來自pGB123的凝膠酶原基因的SalⅠ-HindⅢ片段連接起來，得到質粒pGB900。
D.質粒pGB901的構建(見圖2)通過連接下面四個片段構建質粒pGB901(1)含有乳糖酶啟動子的3.6KbXbaⅠ-HaeⅡ片斷連接到從pUCla56分離出的乳糖酶ATG起始密碼子的大約-90位上，(2)從上述HaeⅡ位點延伸到SalⅠ位點的HaeⅡ-SalⅠ片段，用與在歐洲專利申請0096430的實施例16.C2中所述的方法類似的Bal31實驗使該片段連接到-26位上。但在該實驗中只使用了一個SalⅠ連接子。該片段的序列如下5′TTAACACTTGAAATTTAGGAAAGAGCAGAATTTGGCAAAAAAAATAAAAAAAAAATAAACACG3′3′CGCGAATTGTGAACTTTAAATCCTTTCTCGTCTTAAACCGTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTGTGCAGCT5′(3)含有凝乳酶原和來自pGB900的G418(見實施例1C)的5.1KbSalⅠ-XbaⅠ片段，(4)用XbaⅠ切開的pUC19。
在構建質粒期間，HaeⅡ位點的CG序列由於疏忽而除去，因而在該位置上建立一個HindⅢ位點。
編碼凝乳酶原的DNA存在於質粒pGB901中。分別用來自pGB131，122或124的SalⅠ-BglⅡ片段可容易地轉化為帶有前凝乳酶原，擬凝乳酶或凝乳酶DNA的質粒(見歐洲專利申請0096430)。
實施例2從乳酸克魯維酵母轉化體分泌凝乳酶原為了引導凝乳酶原在克魯維酵母中合成，使用質粒pGB901轉化乳酸克魯維酵母菌株SD11和CBS2360，結果相似。轉化基本上按照歐洲專利申請0096430的實施例4和14所述方法進行，使用完整的質粒DNA或用限制性內切核酸酶切割的質粒DNA。在後一種情況下，使用了限制性內切核酸酶，該酶在啟動子區切割，例如，在SacⅡ，NdeⅠ，SnaBⅠ或SpeⅠ點;或在終止區切割，如，在EcoRV點;或即在啟動子區又在終止區切割。
使乳酸克魯維酵母菌株CBS2360在100mlYEPD培養基(1%酵母膏，2%腖，2%葡萄糖)中生長至OD610大約7為止，培養基中含有2.5ml6.7%酵母氮鹼(Difco)溶液。通過離心從10ml培養物中收集細胞，用TE緩衝液(10mMTris-HClpH7.5，0.1mMEDTA)洗滌並再懸浮於1mlTE緩衝液中。加入等體積的0.2M乙酸鋰並於30℃下在震蕩水浴中溫育混合物1小時。在乳糖酶啟動子的唯一SacⅡ位點切開質粒pGB901(15μg)，用乙醇沉澱並再懸浮於15μlTE緩衝液中。將該DNA製劑加入到100μl預先溫育過的細胞中，溫育過程延長30分鐘。然後加入等體積的70%PEG4000並在同樣溫度下溫育混合物1小時，然後在42℃下熱震蕩5分鐘。然後加入1mlYEPD培養基並在30℃的震蕩水浴中溫育細胞1.5小時。最後離心收集細胞，再懸浮於300μlYEPD中，塗在含有15mlYEPD瓊脂和300μg/mlG418的瓊脂平板上，在使用前1小時用15ml不含G418的YEPD-瓊脂覆蓋細胞。使這些菌落在30℃下生長3天。用類似的方法使乳酸克魯維酵母菌株SD11轉化，只是使G418在選擇平板上的濃度降低到150μg/ml。
在一項實驗中，使CBS2360轉化體於30℃下在含有2%半乳糖的YEP培養基中生長。60小時後，通過離心使細胞與培養基分離。通過用玻璃珠處理破壞細胞。在測定凝乳酶活性之前在pH2條件下處理培養基和細胞提取物(見Foltman，MethodsinEnzymology(1970)19∶421-426)。
通過離心從培養物中除去細胞，加入1M H2SO4使所得上清液酸化至pH2並在室溫下溫育2小時。然後加入2M Tris鹼將該溶液中和至pH6。將50μl合適的稀釋液加入到12%無脂肪奶粉於10mM Ca Cl2中的懸浮液中並在37℃下溫育直到形成凝塊。凝乳酶活性單位的定義為在10分鐘內產生凝塊所需活性凝乳酶的量。在這些條件下，雖然使蛋白質分泌的信號序列沒有加入到凝乳酶原中，但由於乳酸克魯維酵母轉化體產生並分泌出凝乳酶原，所以上清液具有凝乳活性。用上述凝膠檢測法測得在培養基中有大約30-60%所產生的總凝乳酶原。用乳酸克魯維酵母菌株SD11得到了相似的結果。
實施例3增強凝乳酶產量的乳糖酶-凝乳酶融合蛋白利用不同的SnaBⅠ-SalⅠ片段(來自與在歐洲專利申請0096430的實施例16.C2中所述類似的Bal31實驗，但僅使用一個SalⅠ連接子)，得到了含有乳糖酶和凝乳酶蛋白之間融合的pGB901變異體(表1)。用酸處理可將由乳糖酶DNA和連接子序列提供的額外胺基酸與凝乳酶原的前序到一起除去。觀察到含有4個來自乳糖酶編碼序列(pGB902)的胺基酸的融合使得凝乳酶的產量提高。
表1在pGB901和pGB902中乳糖酶啟動子與凝乳酶原之間連接處的核苷酸序列pGB901
pGB902
蛋白質合成開始於框中的ATG密碼子。
實施例4前凝乳酶原通過克魯維酵母轉化體的表達為方便起見從pGB902的多連接子中除去SalⅠ位點(見實施例3)。用SalⅠ部分消化pGB902，然後與Bal31(Boehringer)一起短暫溫育。從瓊脂糖凝膠中分離出線性片段，連接並轉化到大腸桿菌中，得到正確的質粒，pGB903。限制性分析表明該質粒也具有從多連接子中除去的XbaⅠ和HindⅢ位點。
為了構建含有並表達前凝乳酶原的質粒，用限制性內切核酸酶Sal和BglⅡ消化質粒pGB903。通過電泳洗滌從瓊脂糖凝膠中分離出11KbDNA片段。類似地，消化含有前凝乳酶原基因的質粒pGB124(見歐洲專利申請0096430，實施例16)並分離出含有前凝乳酶原N-末端部分的0.3KbSalⅠ-BglⅡ片段。
將11Kb和0.3KbDNA片段混合，用DNA連接酶連接並轉化到大腸桿菌中。分離出質粒pGB904，該質粒含有與小部分乳糖酶基因融合的前凝乳酶原基因(表2)
表2在pGB904中乳糖酶啟動子與前凝乳酶原之間連接處的核苷酸序列pGB904
蛋白質合成開始於框中的密碼子。
用pGB904轉化乳酸克魯維酵母CBS2360細胞，pGB904已用SacⅡ線性化。用實施例2所述方法選擇轉化體，使之生長並測定凝乳酶活性。在下面的表3中，比較了從用pGB902(見實施例3)和用pGB904轉化的乳酸克魯維酵母CBS2360細胞中分泌的凝乳酶原。在OD610為200條件下以每ml細胞的任意單位表示凝乳酶(原)的產量。
表3由用pGB902和pGB904轉化的乳酸克魯維酵母細胞分泌凝乳酶原pGB902pGB904轉化體上清液沉澱物上清液沉澱物13.2＜0.422.41.721.3＜0.433.33.037.11.428.02.344.40.6653.85.8實施例5用異源前導序列由克魯維酵母分泌凝乳酶原A.澱粉葡糖苷酶前導序列的化學合成和含有所述前導序列的質粒的構建Innis等人在Science(1985)228∶21～26中公開了來自泡盛麴黴的澱粉葡糖苷酶前導序列。根據蛋白質序列，得到了寡核苷酸使前導序列插入到凝乳酶原基因的前面(見圖3)。
用AppliedBiosystems的DNA合成儀合成了寡核苷酸。通過變性聚丙烯醯胺凝膠電泳法純化寡核苷酸，然後從凝膠中電泳洗脫下來。
在唯一的Sal位點切開質粒pGB903(見實施例4)。在65℃，50℃和37℃下使寡核苷酸在2×SSC中雜交各1小時。寡核苷酸在5′-端沒有磷酸酯可防止多體形成。用T4多核苷酸連接酶將DNA連接到Sal Ⅰ位點中。將連接混合物轉化到大腸桿菌H B101中。培養24個菌落並分離出質粒DNA。質粒之一，pGB905，通過限制性酶分析顯示出具有正確的核苷酸方位。將質粒pG B905轉化到乳酸克魯維C B S2360中。按照在實施例2中所述程序分析凝乳酶(原)產量。凝乳酶(原)產量以在OD610為200時每ml細胞的任意單位表示，結果示於下面表4中。
表4由用pGB902和pGB905轉化的乳酸克魯維酵母細胞分泌的凝乳酶原pGB902pGB905轉化體上清液沉澱物上清液沉澱物13.2＜0.460.6＜0.421.3＜0.456.4＜0.437.11.456.7＜0.444.40.6657.6＜0.4B.新的合成前導序列的化學合成到含有新的合成前導序列的質粒的構建製備一種合成前導序列，它具有不同於任何已知前導序列的序列。用該前導序列，由克魯維酵母分泌出合成的全部凝乳酶原，如下所示。
利用在信號序列切點的-6位到+2位經常出現的胺基酸設計該合成前導序列(VonHeyne，Eur.J.Biochem.(1983)13317-21)。也使用了經常出現的酵母密碼子並將額外的核苷酸摻入到ATG序列的前面彌補在pGB902中26個核苷酸的缺失。所用的寡核苷酸和所得的前導序列示於表5中。
用AppliedBiosystems的DNA合成儀合成出合成前導序列DNA。使所得的寡核苷酸在40cm長，1mm厚的聚丙烯醯胺凝膠上通過，凝膠中含有TBE緩衝液(50mMTris，50mM硼酸鹽，1mMEDTA，pH8.3)和7M尿素，直到溴酚藍標記移過2/3的凝膠長度為止。使DNA顯色，從凝膠中洗脫下來並用乙醇沉澱，同樣從pGB901製得一種在SalⅠ位點附近具有缺失的衍生物，該缺失是pUC19的多連接子造成的。用來自pGB901的相應片段代替來自pGB903的0.5KbSnaBⅠ-BglⅡ片段製得該衍生物。在唯一的SalⅠ位點切開所得質粒。在65℃，50℃和37℃下使寡核苷酸在2×SSC中雜交各1小時。用T4多核苷酸連接酶將DNA連接到SalⅠ位點中。然後將質粒轉化到大腸桿菌HB101中。在所得到的菌落中，培養24個並分離出質粒DNA。通過限制性酶解看出質粒之一，pGB906具有正確方位的寡核苷酸。用pGB906轉化的乳酸克魯維酵母CBS2360分泌出95%以上所產生的凝乳酶(原)。
C.分析由用pGB905轉化的乳酸克魯維酵母產生的凝乳酶蛋白質使乳酸克魯維酵母CBS2360(pGB905)轉化體於30℃生長3天並從培養物上清液中收集樣品。按照Laemmli的方法(Nature(1970)227680-685)將蛋白樣品在聚丙烯醯胺凝膠上電泳。按照Towbin等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)764350-4354)使蛋白吸印到硝化纖維素濾紙上。將濾紙與抗凝乳酶的多克隆抗血清(Chr.Hansen)一起溫育檢測凝乳酶蛋白，然後將驢抗兔抗體偶聯到過氧化物酶(Amersham)上，最後在含有40%甲醇的緩衝液(50mMTris-HClpH7.5，0.9%NaCl)中具有0.6mg/ml4-氯萘酚和0.015%過氧化氫。由AG信號序列分泌出的凝乳酶原在用該測定法所證明的pH2處理後正確地裂解下來(圖5)。用乳酸克魯維酵母CBS2360(pGB906)轉化體得到了相似的結果。
實施例6由於高效分泌的含有釀酒酵母α因子序列的質粒的構建A.酵母α-因子表達質粒1.質粒的構建pDM100-PC起始材料為質粒pGB163(見歐洲專利申請0096430，實施例16.C1)。用BamHⅠ消化質粒pGB163，並連接到XbaⅠ-BamHⅠ，α-因子前導序列-凝乳酶原連接物上。然後用PstⅠ處理所得混合物並分離出編碼具有凝乳酶原位點和N-末端區的前-α-因子的96bp片段。在用PstⅠ和SalⅠ消化後從質粒pJS111中分離出編碼牛凝乳酶原的1900bp片段。質粒pJS111是在ADH-2啟動子和甘油醛-3-磷酸(GAPDH)終止區的調控下含有pGB163的凝乳酶原基因的pBR322衍生物。酵母GAPDH49基因啟動子和轉錄終止區基本上如Travis在J.Biol.Chem.(1985)2604384-4389中所述。
用XbaⅠ和SalⅠ消化質粒pDM100，該質粒含有GAPDH啟動子，釀酒酵母α-因子前導區，和人的合成基因與幹擾素的融合區，其兩側是XbaⅠ和SalⅠ位點和α-因子終止區，用鹼性磷酸酶處理，然後連接到上述96bp和1900bp片段上。α-因子前導區和終止區基本上如Brake在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)814642-4646中所述。分離所得質粒pDM100-PC，該質粒含有GAPDH啟動子，α-因子前導區和凝乳酶原基因的融合區。BamHⅠ插入體的完整序列示於圖6。
為了選擇酵母轉化體，構建了質粒pKS100和pAB300。
pKS100將來自含有釀酒酵母URA3基因的YEp24的1170bpHindⅢ片段插入到pDM100-PC中構建質粒pKS100。
pAB300將來自含有乳酸克魯維酵母LAC4基因3′區和G418抗性標記的3500bpHindⅢ-SalⅠ片段插入到pDM100-PC中構建質粒pAB300。圖6說明了GAPDH/α-因子/凝乳酶原BamⅠ插入pDM100-PC中。
2.乳酸克魯維酵母和釀酒酵母的轉化在凝乳酶原編碼區的BglⅡ位點消化質粒pKS100並用來轉化乳酸克魯維酵母菌株KRN201-6。該菌株是2UV21菌株的衍生物(alac4trplura3[Kil°])，其中lac4基因已被來自pGB901的LAC4啟動子-凝乳酶原基因融合區所取代。因此可將pKS100的整合定向到整合的凝乳酶原編碼區。也可用質粒pKS100轉化釀酒酵母菌株(αUra3Leu2his4pep4-3[Cir°])，假使這樣的話可定向到GAPDH基因3′區的SalⅡ位點。
在液體YEPD培養基中使所得轉化體生長至飽和狀態，在pH2下活化後檢測培養物上清液和細胞溶解物的凝乳酶活性。由下面表5歸納的結果可看出，乳酸克魯維酵母將凝乳酶原高效分泌到培養基中，而釀酒酵母轉化體只分泌出一小部分所產生的凝乳酶原。
表5在乳酸克魯維酵母和釀酒酵母轉化體中凝乳酶原的產量凝乳酶活性(相對單位/ml培養物)菌株細胞提取物培養物上清液AB110＜0.25＜1.0AB110pKB10015.52.3KRN201-6＜0.25＜1.0KRN206-6pKS10012.0333.0用質粒pAB300將乳酸克魯維酵母2UV21菌株轉化為G418抗性，定向整合到LAC4基因3′區的EcoRV位點。這些轉化體也高效地將凝乳酶原分泌到培養基中，結果如下表6所示。
表6從α-因子/凝乳酶原融盒體分泌的凝乳酶原宿主菌株轉化質粒分泌的凝乳酶活性(相對單位/ml培養物)2UV21-＜2KRN201-6-＜2KRN201-6pKS1003852UV21pKS300294
B.LAC4啟動子/α-因子前導序列/凝乳酶原融合體的構建為了產生該融合體，構建了兩個中間體質粒。用PstⅠ部分消化質粒pDM100-PC，連接到SalⅠ-PstⅠ連接物上，該連接物編碼部分α-因子前導序列和26bp的LAC4基因5′區，然後用HindⅢ消化該質粒。從該混合物中分離出1500bp片段，然後克隆到用HindⅢ和SalⅠ消化過的pUC18中得到pKS102。
將合成的大腸桿菌乳糖操縱子連接到pKS102α-因子前導編碼序列5′端SalⅠ位點上得到質粒pKS103。這樣做的原因是LAC4啟動子/α-因子前導序列/凝乳酶原融合體對大腸桿菌可能是有毒性的。
分離pKS103的409bpSalⅠ-BglⅡ片段並連接到SalⅠ-BglⅡ消化的pJD15R上。通過填補在pUC19多連接子中SalⅠ位點的缺失從pGB901衍生出質粒pJD15R，從而得到pJD15，然後以相反的方向再克隆8800bpXbaⅠ片段。從這個反應中分離出質粒pKS105。這些質粒示於圖7中。
然後用質粒pKS105轉化乳酸克魯維酵母菌株CBS2360成為G418抗性，用LAC45′區中的SacⅡ位點作為整合轉化的靶位。以在OD610為200時每ml細胞的單位數表示凝乳酶的產量(表7)。
表7由用pKS105轉化的乳酸克魯維酵母細胞分泌的凝乳酶原＊
轉化體上清液沉澱物11113.321474.531243.741253.0＊以每ml培養物的相對單位數表示凝乳酶活性。
實施例7A.乳酸克魯維酵母α-因子信號序列的分離和應用用釀酒酵母Matasst2-3RC687菌株作為試驗菌株按Julius等人在Cell(1983)328-39中所述的方法進行培養物上清液的生物測定。使乳酸克魯維酵母菌株CBS141(α)生長於含有0.5%葡萄糖，0.17%沒有硫酸銨的酵母氮鹼(Difco)，和0.002%硫酸銨的培養基中。離心除去細胞後，將乙酸加入到培養物上清液中至0.1M濃度，使上清液通過一個Bio-Rex70柱(Biorad)。用0.1M乙酸洗柱，然後用80%乙醇/10mMHCl洗脫α-因子。將洗脫液蒸發至幹，然後溶於0.1%三氟乙酸(TFA)/20%乙腈中並加到反相HPLC保護柱上。用含有0.1%TFA和20%，40%，60%和80%乙腈的溶液逐步洗柱。然後將含有α-因子活性的60%級分加到分析C-18HPLC柱上並用溶於0.1%TFA的20%到80%乙腈進行梯度洗脫。收集各級分並測定α-因子活性。使含有α-因子活性的級分乾燥並進行胺基酸順序分析。
B.質粒庫的雜交篩選用
-[32P]-ATP和T4多核苷酸激酶標記寡核苷酸庫。用這些寡核苷酸探針於42℃在下列雜交液中探測Southern吸印或細菌菌落4×SSC，50m MKH2 PO4 PH7，1%肌氨醯(Sarkosyl)，10%硫酸葡聚糖，200μg/ml聲處理的，變性鮭魚精子DNA。於42℃用2×SSC，0.1% SDS洗滌濾器。
以每80mm的含有100μg/ml氨苄青黴素的L-瓊脂平板含500-2000個菌落的密度平板培養大腸桿菌HB101菌株的轉化體，用這些探針篩選載體pJS109中的質粒庫，該質粒庫含有由乳酸克魯維酵母SD11菌株的基因組DNA(trpllac4)的有限Sau3AI消化液產生的插入體，分級分離為純化片段的大小＞5000bp。將DNA從菌落中轉移到硝化纖維素濾紙上並如上所述使這些濾紙雜交。挑選出相應於濾紙上的雜交信號區的原平板上的區域，然後再進行平板培養並用雜交法再次試驗，以分離出帶有含雜交序列質粒的信號菌落。通過Southern吸印分析從少量培養物中純化的DNA，進一步檢測陽性菌落。
用各種限制性酶消化從雜交陽性菌落中純化的質粒，為了鑑定適合於DNA序列分析的限制性片段的大小，採用相同的雜交探針，以Sou-thern吸印分析法分析了所得的片段。通過瓊脂糖凝膠電泳使鑑定出的片段純化並克隆到合適的MP18和MP19載體中。然後進行DNA序列分析。
C.克魯維酵母α-因子的分離乳酸克魯維酵母α-因子的頭10個胺基酸顯示出與來自釀酒酵母的頭10個胺基酸明顯的同源性，即具有6個相同的胺基酸殘基。該序列如下所示Trp-Ser-Trp-Ile-Thr-Leu-Arg-Pro-Gly-Gln用此蛋白質序列設計一組寡核苷酸，據推斷其與圖8所示的相應結構基因是互補的。將包含α-因子肽段所有可能的密碼子的寡核苷酸合成為96個和48個不同分子組成的兩個庫。
用y-[32-P]-ATP和T4多核苷酸激酶放射性標記這兩個庫，分別用這兩個庫探查乳酸克魯維酵母DNA限制性酶解物的Southern吸印情況。在幾種不同的酶解物中，第2號庫與單一的片段牢固地雜交並與第二個片段雜交得弱得多。因此選用第2號庫篩選乳酸克魯維酵母基因組DNA的質粒庫。
使用這些探針篩選質粒庫使得許多雜交的克隆分離。這些克隆之一，αfh18b的DNA序列分析表明它編碼一條α-因子相關肽，該肽與釀酒酵母α-因子肽有強烈的相似處。將雜交部分定位於大約為1000bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上。該片段的序列示於圖9中。乳酸克魯維酵母只含有加入N-連接的糖鏈的兩個位點。此外，乳酸克魯維酵母重複的間隔區要比釀酒酵母重複的間隔區長，並顯示出更不同的序列，該序列具有X-Ala/Pro型式的序列而不是在釀酒酵母中所看到的Glu/Ala-Pro序列。DNA序列的比較表明了在整個編碼區同源的強烈程度。
D.質粒的構建為了提供乳酸克魯維酵母α-因子前導區與在強有力的啟動子的轉錄控制下表達的凝乳酶原的融合體，構建了一系列質粒(見圖10)。
pAB307用klenow酶填充EcoRⅠ懸臂並將BglⅡ連接子加入到鈍端修飾了來自αfk18b的673bpSspⅠ-EcoRⅠ片段(圖9)。然後將該片段插入到把釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)的啟動子和終止區連接起來的BglⅡ位點中。在pUC18中將這個暗盒克隆為BamHⅠ片段，得到pAB307。
pAB309然後使編碼α-前導區和牛凝乳酶原的序列融合。首先用NcoⅠ消化pAB307並通過用綠豆核酸酶處理使粘性末端變為平鈍末端。然後用SalⅠ消化所得產物。將含有編碼凝乳酶原和釀酒酵母轉錄終止區序列的2000bpEcoRV-SalⅠ片段連接到上述產物上。該片段得自質粒pJS111，其中已將XbaⅠ-BamHⅠ連接物加到了含有與釀酒酵母GAPDH轉錄終止區融合的凝乳酶原cDNA之片段的5′端。用該連接混合物轉化大腸肝菌HB101菌株並分離出攜帶質粒pAB309的轉化體。在該融合體連接處附近的序列示於圖11中並且pAB309的整個BamHⅠ-SalⅠ插入體的序列示於圖12中。
pAB312a為了獲得乳酸克魯維酵母菌株的轉化，將得自pGB901的3560bpHindⅢ片段插入到pAB309產生質粒pAB312中。HindⅢ片段包含乳酸克魯維酵母LAC4基因的3′區和釀酒酵母ADH1啟動子與細菌G418抗性結構基因的融合體。
pAB313和pAB314從pAB309中分離出1900bpSacⅠ-HindⅢ並克隆到MP19中(Yanisch-Perronetal，Gene(1985)33103)。製備單鏈噬菌體DNA並用作模板，用圖13所示的兩種寡核苷酸引物之一進行體外誘變。分別用1號引物和2號引物製備M13噬菌體MP19/αk11.5和MP19/αK12.2。
由這些噬菌體製備雙鏈RFDNA，並從每種噬菌體中分離出SacⅠ-StuⅠ片段。將這些片段與來自pAB312a的7100bpSacⅠ-StuⅠ片段連接。氛離出的質粒pAB313和pAB314具有圖13所示的序列改變。
E.克魯維酵母的轉化用EcoRV消化質粒pAB312(定向整合到乳酸克魯維酵母基因組的LAC4區中)，然後用它使乳酸克魯維酵母2uv21菌株(ura3trpllac4[Kil°])轉化成G418抗性。用質粒pAB313和pAB314使2uv21菌株轉化為G418抗性。使轉化體2uv21pAB312，2uv21pAB313和2uv21pAB314的培養物生長並如上測定培養物上清液的凝乳酶活性。
使許多這些轉化體及未轉化的對照菌株在1ml培養基中生長36小時，培養基組成為1%的酵母膏，2%腖，2%葡萄糖，0.17%酵母氮鹼，50μg/ml色氨酸和50μg/ml尿嘧啶。然後在酸活化後測定培養物上清液的凝乳酶活性。發現所有轉化體都分泌可活化的凝乳酶。結果示於下面表8中。
表8凝乳酶原在克魯維酵母中的分泌菌株宿主質粒凝乳酶活性(相對單位/ml培養物)2UV212UV21-＜2KRN303-12UV21pAB312256KRN304-42UV21pAB313175KRN305-22UV21pAB314206用三氯乙酸沉澱的培養物上清液的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定發現每種轉化體均分泌單一的凝乳酶原相關種類。由pAB312轉化體分泌的凝乳酶原相關蛋白通過電泳遷移測定出的分子量比由pAB313和pAB314轉化體所分泌的凝乳酶原相關蛋白的分子量略高。
通過製備SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳純化由KRN303-1和KRN304-4分泌的大多數蛋白並進行氣相胺基酸序列分析。這些蛋白的N-末端順序如下所示
KRN301-11510Glu-Ala-Asp-Ala-Ser-His-His-Met-Ala-Glu-15Ile-Thr-Arg-Ile-ProKRN304-415Ala-Glu-Ile-Thr-Arg-Ile這些結果表明由KRN301-1所分泌的凝乳酶相關蛋白沒有氨基末端間隔區序列，而由KRN304-4所分泌的蛋白具有真正成熟的凝乳酶原氨基末端。
實施例8用澱粉葡糖苷酶信號肽由乳酸克魯維酵母分泌t-PAA.組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑cDNA的克隆用與Pennica等人所述相似的方法(Nature(1983)301214)得到為組織型血纖維蛋白溶酶原活化劑編碼的cDNA。DNA序列分析和限制酶圖譜證實了t-PAcDNA的真實性。為了研究表達，使用了2.0KbBglⅡ片段(見Pennica等人的方法)，該片段幾乎含有成熟蛋白的整個編碼區和3′端非編碼區。
B.在pUC19中引入G418抗性標記將含有Tn5基因的DNA片段(Reisset.al.，EMBOJ.(1984)33317)插入到pUC19的SmaⅠ位點中(Yanisch-Perronetal.，Gene(1985)33103)，該片段在釀酒酵母醇脫氫酶Ⅰ(ADH1)啟動子指導下具有對G418的抗性，這與Bennetzen和Hall在J.Biol.Chem.(1982)2573018中所述類似。得到的質粒pUCG418示於圖14中。含有pUCG418的大腸桿菌已於1987年12月4日貯存在CBS，貯存號為CBS872.87。
C.pGBtPAl的構建用幾個克隆步驟構建pGStPA1(見圖15和表9)，其含有下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切開的pUCG418(見上);
(2)來自pGB901，含有乳糖酶啟動子的XbaⅠ-SalⅠ片段;
(3)編碼來自泡盛麴黴的澱粉葡糖苷酶信號序列的合成DNA(Inniset-al.，Science(1985)22821)。選擇在起始密碼子之前的序列除去位於乳糖酶啟動子片段末端的SalⅠ位點，該序列還含有部分乳糖酶基因的5′端非編碼區;
(4)來自t-PAcDNA的2.0KbBg1Ⅱ片段(見上述);
(5)含有部分乳糖酶基因的3′端非編碼區的合成DNA。
表9質粒pGBtPA1的圖示
蛋白質合成開始於劃線的ATG密碼子。
D.乳酸克魯維酵母的轉化和轉化體的分析用實施例2所述方法轉化具有pG Bt PA1的乳酸克魯維酵母CB S2360菌株。在YEPD培養基中於30℃培養轉化體和對照菌株CB S2360大約64小時。通過離心從培養轉化體和對照菌株C B S2360大約64小時。通過離心從培養基中分離出細胞。將細胞重新懸浮於生理鹽水中，OD610為300，以最大速度在渦流振蕩器中加玻璃珠振搖3分鐘破壞細胞。離心除去細胞碎片。
在微滴板中按照Wallen等人的方法(Biochem.Biophys.Acta(1982)719318)進行溶解凝塊測定。製得一種含有15mM磷酸鹽緩衝液(pH7.3)，內含0.2CU/ml血纖維蛋白溶酶原，1.5mg/ml纖維蛋白原和0.04%明膠。在微滴板的各孔中使10μl凝血酶(13.9NIH單位/ml)，25μl樣品和65μl血纖維蛋白溶酶原.纖維蛋白原溶液混合。反應完成後每30分鐘測定一次OD450。在每個微滴板中，用來自黑素瘤細胞的t-PA(KabiVitrum)製得一條校正曲線。
表10表明10個轉化體的典型分析結果。在用pGBtPA1轉化的乳酸克魯維酵母培養基中發現了t-PA。
表10來自CBS2360的培養物和來自用pGBtPA1轉化的CBS2360培養物的溶解凝塊測定轉化體上清液中t-PA的活性140μg/l26μg/l3＜3μg/l4＜3μg/l525μg/l63μg/l73μg/l8＜3μg/l93μg/l10＜3μg/lCBS23601°)＜3μg/lCBS23602°)＜3μg/lCBS23603°)＜3μg/lCBS23604°)＜3μg/lCBS23605°)＜3μg/l
在某些細胞萃取物中t-PA的活性較低(≤3μg/l)。
在用血纖維蛋白溶酶原/纖維蛋白-瓊脂糖凝膠覆蓋的SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，按照Granelli-Piperno和Reich的方法(J.Exp.Med(1978)也進行了分析。用乙醇使200μlCBS2360或用pGBtPA1轉化的CBS2360培養物上清液沉澱並重新懸浮於20μl樣品緩衝液(62.5mMTris-HCl，pH6.8，2%十二烷基硫酸鈉，10%甘油，溴酚藍)中。樣品不用煮沸就可鋪到凝膠上。結果(見圖16)表明乳酸克魯維酵母分泌出人t-PA。此外，可清楚地看到大多數所分泌的物質是糖基化的。
t-PA的分泌也用酶聯免疫吸附法(ELISA)，用抗人t-PA的單克隆抗體(ESP5，購自Biopool)和通過產色活性測定(來自KabiVitrum的商業試驗)得到了證實。
實施例9用來自人血清清蛋白的信號序列，由乳酸克魯維酵母分泌t-PAA.pGBtPA2的構建用幾個克隆步驟構建pGBtPA2(見圖17和表11)，其含有下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切開的pUCG418;
(2)來自pGB901，含有乳糖酶啟動子的XbaⅠ-SalⅠ片段;
(3)編碼前人血清清蛋白原的合成DNA;
(4)來自t-PAcDNA的2.0KbBglⅡ片段(見實施例8);
(5)含有部分乳糖酶基因3′端非編碼區的合成DNA。
表11質粒pGBtPA2的圖示XbaⅠⅤ
蛋白質合成開始於劃線的密碼子。
B.乳酸克魯維酵母的轉化和轉化體的分析如例8所述用pGBtpA2轉化CBS2360。如前面例中所述步驟培養並處理轉化體和對照菌株。溶解凝塊測定的結果總結在表12。
表12用pGBtPA2轉化的CBS2360和CBS2360培養物的溶解凝塊測定轉化體上清液中t-PA的活性125μg/l225μg/l3＜3μg/l4＜3μg/l56μg/l612μg/l7＜3μg/l8＜3μg/l9＜3μg/l10＜3μg/lCBS23601°)＜3μg/lCBS23602°)＜3μg/lCBS23603°)＜3μg/lCBS23604°)＜3μg/lCBS23605°)＜3μg/l在一些細胞萃取物中發現有少許t-PA活性(3＜μg/l)。
實施例10乳酸克魯維酵母分泌人血清清蛋白A.HSA互補DNA的合成和克隆根據Okayama和Berg的方法(見Mol.Cell.Biol.(1982)2161)用人肝mRNA製備為人血清清蛋白編碼的cDNA。將cDNA克隆到從pBR322衍生的載體中，並轉化大腸桿菌。根據Lawn等人測得的HSAcDNA克隆的序列(見NucleicAcidsRes.(1981)96103)，用寡脫氧核糖核苷酸篩選轉化體。測定所選cDNA克隆的部分順序，將其與Lawn等人測定的序列比較。揭示出前HSA原編碼區的頭五個核苷取沒有了，但編碼區第9-15核苷酸的BstEⅡ點仍存在。這個在3′非編碼區的BstEⅡ點和HindⅡ點(見Lawn等人，如上所述)用於在表達載體中再克隆。
B.構建pGBHSAl用幾步克隆步驟即可構建pGBHSAl，其包括下列成分(1)用XbaⅠ和HindⅢ切開的pVCG418(見例8)。
(2)來自pGB901的XBaⅠ-SalⅠ片段(見實施例1);
(3)合成DNA(SalⅠ-HindⅢ片段)，包括乳糖酶基因3′端非編碼區部分。這個片段的序列在表13給出。
表13pGBHSAl的SalⅠ-HindⅢ片段的序列
C.pGBHSA2的構建用SalⅠ和EcoRV切pGBHSA1，再插入一個合成DNA
下面劃線的ATG碼表示最終的表達構建物(pGBHSA3，見下面)中的起始碼。
所得質粒被命名為pGBHSA2。
D.構建pGBHSA3用HindⅢ切HSAcDNA克隆，用KlenowDNA聚合酶Ⅰ將粘性端填平。再用BstEⅡ切DNA，純化含幾乎完整HSA編碼區的BstEⅡ-HindⅢ(已填平)片段。用XhoⅠ酶解pGBHSA2，用KlenowDNA聚合酶Ⅰ填平粘性端，再用BstEⅡ酶解。在所得載體中。HSA編碼片段CBStEⅡ-HindⅢ(已填平))被插入。得到的pGBHSA3質粒示在圖18。
E.轉化乳酸克魯維酵母並分析轉化體如實施例2所述用pGBHSA3轉化乳酸克魯維酵母菌爪2360。將轉化株和對照株CBS2360於30℃，在YEPD培養基中培養64小時。離心，從培養基中分離細胞。從上清液取30μl樣品，根據Laemmli方法(Natrue227，680(1970))在10%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分析。圖19所示結果說明HSA被用pGBHSA3轉化的乳酸克魯維酵母細胞分泌到培養基中了。還說明在產生HSA細胞中分泌的其它蛋白質量降低了。
上述結果說明在克魯維酵母菌株中可獲得外源基因高效，簡便的表達。此外，凝乳酶原的結果表明克魯維酵母菌株特別適用於提供各種蛋白質的高效表達和加工。提供的組建體和載體可在克魯維酵母有效啟動子的調控下引入外源基因並如上所述，連接到提供外源基因轉移，特別是分泌的信號序列上。因此，發酵系統可商業化生產多種活性或可活性形式的外源蛋白。
下列微生物已於1987年6月30日貯存於美國典型培養物保藏中心並於1988年7月22日貯存於中國典型培養物保藏中心2UV21，ATCC登記號為20855，CCTCC號為M88068;KRN201-6，ATCC登記號為20854，CCTCC號為M88067;HB101pAB307，ATCC登記號為67484，CCTCC號為M88069;HB101pAB312，ATCC登記號為67484，CCTCC號為M88070。
雖然為清楚地理解上述發明已通過說明和實施例較詳盡地作了描述，但在所附權利要求範圍內顯然可實行某些改變和修飾。
權利要求
1.在克魯維酵母宿主中產生所需肽的方法，該方法包括將為所需肽編碼的DNA序列引入該宿主細胞和在培養基中培養含有所述DNA的該宿主細胞，從而所需多肽或其部分分泌到培養基中。
2.根據權利要求1的方法，所述DNA序列構成DNA構建物的部分，它被引入宿主細胞，在轉錄方向包含在該宿主有功能的轉錄起始調節區;為所需多肽編碼的所述DNA序列;和在該宿主細胞有功能的轉錄終止調節區。
3.根據權利要求1或2的方法，其中與所述宿主或所需多肽異源的，或對所述宿主和所需多肽均異源的信號序列，在讀碼順序中連接於該DNA序列的5′端，從而該宿主細胞分泌所述多肽。
4.根據權利要求1-3中任一項方法，其中所需多肽是一種酶。
5.根據權利要求4的方法，其中的酶是凝乳酶或其前體。
6.根據權利要求4的方法，其中所述酶是組織血纖維蛋白溶酶原激活因子(t-PA)或其突變形式。
7.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所需多肽是人血清清蛋白(HSA)。
8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所述宿主細胞是克魯維酵母的工業菌株。
9.根據權利要求1-8中任一項的方法，其中所述宿主細胞是乳酸克魯維酵母或脆壁克魯維酵母。
10.根據權利要求2的方法，其中所述DNA構建物進而包括至少一種選擇標記，所述DNA序列的自主複製系統或一個轉化效率加強序列。
11.根據權利要求10的方法，其中所述複製系統是自主複製系統(ARS)。
12.根據權利要求11的方法，其中所述自主複製序列是克魯維酵母自主複製序列(KARS)。
13.根據權利要求10的方法，其中所述選擇標記是抗G418的。
14.用克魯維酵母作為宿主轉化並表達外源基因，分泌該基因編碼的多肽或分泌該多肽的一部分。
15.含有一個表達暗盒的轉化的克魯維酵母宿主細胞，該暗盒在轉錄方向含有該宿主中有功能的轉錄起始調節區，在讀碼順序與編碼所需肽的DNA序列連接的在宿主中有功能的信號序列，和在該宿主細胞中有功能的轉錄終止調節區。
16.根據權利要求15的細胞，其中所述信號肽是對該宿主細胞或所需多肽異源的，或對該宿主細胞和所需多肽都是異源的。
17.根據權利要求16的細胞，其中所述信號序列是釀酒酵母的α-因子信號序列。
18.根據權利要求16的細胞，其中所述信號序列是來自泡盛麴黴的澱粉葡萄糖苷酶信號序列。
19.根據權利要求15-18中任一項的細胞，其中所需的多肽是凝乳酶或其前體，tPA或HSA。
20.根據權利要求15-16中任一項的細胞，其中連接到所述表達暗盒上的是至少一個選擇標記，一個該DNA序列的自主複製系統或轉化效率加強序列。
21.根據權利要求20的細胞，其中所述的複製系統是自主複製序列(ARS)。
22.根據權利要求21的細胞，其中所述的自主複製系統是克魯維酵母自主複製序列(KARS)。
23.根據權利要求20-22中任一項的細胞，其中所說選擇標記對G418具有抗性。
24.克魯維酵母宿主細胞所用的DNA構建物，包括在轉錄方向上，有一個在該宿主中有功能的轉錄起始調節區;在讀碼區與編碼所需多肽的DNA序列連接的在該宿主中有功能的信號序列;在該宿主中有功能的轉錄終止調節區。
25.根據權利要求24的DNA構建物，其中所述信號序列是對所需肽或該宿主細胞異源的，或對該宿主細胞和所需肽都是異源的。
26.根據權利要求24或25的DNA構建物，進而包括至少一種選擇標記，一個所述DNA構建物的自主複製系統或一個轉化效率加強序列。
27.根據權利要求24-26中任一項的DNA構建物，其中的為信號序列和所需多肽編碼的DNA序列在讀碼區與在克魯維酵母中表達的一個基因融合。
28.根據權利要求27的DNA構建物，其中所述DNA序列在乳糖酶基團N端的至少四個胺基酸處與第二DNA序列融合。
29.質粒pKS105，pGB901，pGBTPA1和pGBHSA3。
30.根據權利要求1-13任一項的方法，其中所需肽或該肽一部分是從培養基中分離的。
全文摘要
克魯維酵母宿主和用在該宿主的DNA表達暗盒用於轉錄內源和/或外源DNA，生產多肽，提高內源產物的產量或生產外源產物。克魯維酵母宿主被發現有分泌所需多肽產品的特殊用途，其中信號序列可是該肽固有的，或來自內源或外源的信號序列，包括合成序列，它們在克魯維酵母中都是有功能的。還提供了高效轉化克魯維酵母的轉化步驟。
文檔編號C12N9/34GK1040052SQ8810467
公開日1990年2月28日 申請日期1988年7月28日 優先權日1987年7月28日
發明者約翰尼斯·安·范·丹博格, 埃爾伯特·吉·范·歐揚, 克瑞恩雷特·弗爾德 申請人:吉斯特布羅卡德斯股份有限公司