一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法與流程

2023-05-14 07:34:56 2

本發明屬於藥物檢測
技術領域：
，具體來說，涉及到一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法。
背景技術：
：溴芬酸鈉是2-氨基-3-苯甲醯基苯乙酸類衍生物，其結構與酮洛芬和雙氯芬酸類似，能抑制環氧合酶介導的前列腺素類炎症介質的合成，是最有效的環氧合酶抑制劑之一，具有強力消炎鎮痛作用，作用強度是其它的非甾體抗炎藥(NSAIDs)的10倍。藥理實驗顯示,溴芬酸鈉對花生四烯酸、角叉菜膠所致的大鼠實驗性急性結膜浮腫有抗炎作用；幾乎完全抑制家兔前房穿刺後雷射照射所致的房水蛋白濃度增加。日本已於2000年批准Senju公司溴芬酸鈉滴眼液上市，商品名為XibromTM，規格為5ml:5mg，臨床用於外眼部及前眼部的炎症性疾病的對症治療：眼瞼炎、結膜炎、強膜炎(包括上強膜炎)、術後炎症等。溴芬酸鈉滴眼液在放置的過程中，會產生降解雜質，而影響產品的質量。這幾個雜質即藥物質量控制中的有關物質，對於溴芬酸鈉滴眼液控制的雜質主要有三個：雜質1：2-氨基-3-(4-溴代苯甲醯基)苯甲酸、雜質2：2-氨基-3-(4-溴代苯甲醯基)苯甲醯甲酸、雜質3：7-(4-溴代苯甲醯基)吲哚啉-2,3-二酮。對與降解產生的有關物質，在製劑中需要進行質量控制的，因此，實現溴芬酸鈉與其有關物質的分離與分析，對於溴芬酸鈉滴眼液的質量控制具有重要的現實意義。技術實現要素：為解決上述技術問題，本發明提供了一種分離度好，專屬性強、靈敏度高的溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法。本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述測定方法具體步驟為：採用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱或N-氧化石松鹼M鍵合矽膠柱，以磷酸鹽緩衝液-乙腈為流動相，進行梯度洗脫，檢測波長為250-280nm，柱溫為10-30℃，流速為0.8-3ml/min，進樣量為20-70uL。本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述柱溫為室溫；所述檢測波長為266nm；本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述流速為調節溴芬酸鈉的出峰時間為18min；所述進樣量為60uL。本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述洗脫梯度：時間(分鐘)流動相A(％)流動相B0100020.1100060.1109060.21000801000其中所述的流動相A為磷酸鹽緩衝液:乙腈＝75:25；流動相B為磷酸鹽緩衝液-乙腈＝30:70；所述磷酸鹽緩衝液為取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解並稀釋至1000ml，用磷酸調節pH值至7.3所得。本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述N-氧化石松鹼M鍵合矽膠柱的製備步驟為：1)取20g活化的矽膠於500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基矽烷，120℃下油浴，攪拌回流13h，待冷卻後，產物依次用甲苯，乙醇洗滌抽濾至無膠狀物存在；在60℃下乾燥24h，乾燥箱內冷卻；2)在500mL的單口瓶中加入步驟1)的產物，然後依次加入120mL35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室溫攪拌反應2h，經無水乙醇抽濾後，置於500mL三口瓶中備用；取N-氧化石松鹼M4g溶於適量水溶液中，調節溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃攪拌下反應10h；待產物冷卻，依次用大量二次水、無水乙醇洗滌抽濾至濾液清亮；60℃恆溫乾燥6h，於乾燥箱內冷卻後裝棕色瓶內得N-氧化石松鹼M鍵合矽膠；3)將N-氧化石松鹼M鍵合矽膠常規裝柱，即得。本發明所述的一種溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法，所述測定方法具體步驟為：1)精密量取溴芬酸鈉滴眼液5ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；2)精密稱取溴芬酸鈉水合物對照品25mg，置25ml量瓶中，加流動相溶解並稀釋至刻度，製成每1ml中約含無水溴芬酸鈉0.93mg的溶液，搖勻，作為對照品溶液貯備液；另精密量取對照品溶液貯備液1ml，置200ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；3)精密稱取聚維酮K30對照品200mg，置10ml量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，製成每1ml中含20mg的溶液，搖勻，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液；4)精密量取對照品溶液、對照溶液、空白溶液和供試品溶液各60μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，其他單一雜質峰面積與對照溶液主峰面積相比較；除聚合物外，各雜質峰面積的和與對照溶液主峰面積相比較；5)計算公式式中：SK為空白溶液中聚維酮K30的峰面積；SX為供試品溶液中與空白溶液聚維酮K30峰保留時間相對應峰的峰面積；S對為對照品溶液的峰面積；C樣為供試品溶液的標示濃度；C對為對照品溶液的濃度；W對為對照品的重量，mg；1.076為溴芬酸鈉的水合物與無水溴芬酸鈉的換算因子。式中：S雜、S對分別為其它單個雜質峰面積與對照溶液的主峰面積；S和為除聚合物外，各雜質峰面積的和。與現有技術相比，本發明所述溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法實現了溴芬酸鈉與其有關物質的分離與分析，並且分離度好，專屬性強、靈敏度高，可以採用不加校正因子的自身對照法對這三個已知雜質進行定量。該測定方法對於溴芬酸鈉滴眼液的質量控制具有重要的現實意義。具體實施方式下面結合具體的實施例對本發明所述溴芬酸鈉滴眼液有關物質的測定方法做進一步說明，但是本發明的保護範圍並不限於此。實施例1利用液相色譜法分析溴芬酸鈉滴眼液的有關物質，採用N-氧化石松鹼M鍵合矽膠柱，以磷酸鹽緩衝液-乙腈為流動相，進行梯度洗脫，檢測波長為266nm，流速為調節溴芬酸鈉的出峰時間為18min左右，柱溫為室溫，進樣量為60uL；洗脫梯度程序具體為：時間(分鐘)流動相A(％)流動相B0100020.1100060.1109060.21000801000其中所述的流動相A：磷酸鹽緩衝液(取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解並稀釋至1000ml，用磷酸調節pH值至7.3)-乙腈(75:25)；流動相B：磷酸鹽緩衝液(取磷酸氫二銨2.64g，加水溶解並稀釋至1000ml，用磷酸調節pH值至7.3)-乙腈(30:70)。所述N-氧化石松鹼M鍵合矽膠柱的製備步驟為：1)取20g活化的矽膠於500mL三口瓶中，再量取100mL甲苯和40mL的γ-氨丙基三乙氧基矽烷，120℃下油浴，攪拌回流13h，待冷卻後，產物依次用甲苯，乙醇洗滌抽濾至無膠狀物存在；在60℃下乾燥24h，乾燥箱內冷卻；2)在500mL的單口瓶中加入步驟1)的產物，然後依次加入120mL35％的甲醛溶液和2mL的乙酸溶液，室溫攪拌反應2h，經無水乙醇抽濾後，置於500mL三口瓶中備用；取N-氧化石松鹼M4g溶於適量水溶液中，調節溶液的pH值至8.0，加入上述三口瓶中，60℃攪拌下反應10h；待產物冷卻，依次用大量二次水、無水乙醇洗滌抽濾至濾液清亮；60℃恆溫乾燥6h，於乾燥箱內冷卻後裝棕色瓶內得N-氧化石松鹼M鍵合矽膠；3)將N-氧化石松鹼M鍵合矽膠常規裝柱，即得。確證試驗：1.波長的選擇精密稱取雜質1、雜質2和雜質3各約10mg，分別置100ml量瓶中，均用乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，於200～400nm進行紫外掃描，雜質1、雜質2和雜質3在266nm波長處有較大吸收。2.分離專屬性試驗供試品溶液：精密稱取溴芬酸鈉原料約10mg，置100ml量瓶中，加流動相A溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為供試品溶液。對照溶液：精密量取供試品溶液1ml，置200ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。中間體Ⅴ溶液：精密稱取中間體Ⅴ約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為中間體Ⅴ溶液。雜質1溶液：精密稱取雜質1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質1溶液。雜質2溶液：精密稱取雜質2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質2溶液。雜質3溶液：精密稱取雜質2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為雜質3溶液。空白輔料溶液：按處方量的輔料，配製空白輔料溶液。混合溶液：精密稱取溴芬酸鈉原料約20mg，置200ml量瓶中，加入上述雜質溶液各1ml，加流動相A溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每1ml中約含溴芬酸鈉0.1mg、雜質各0.5μg的溶液，作為混合溶液。取對照溶液60μl注入液相色譜儀，調整流速使溴芬酸鈉水合物的保留時間約為18分鐘，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20％～30％；再取空白輔料溶液、雜質1溶液、雜質2溶液、雜質3溶液、中間體Ⅴ溶液、混合溶液及供試品溶液各60μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。出峰順序為雜質1、溴芬酸鈉、雜質2、雜質3、中間體Ⅴ。試驗結果表明，和以往採用十八烷基矽烷鍵合矽膠柱相比，採用N-氧化石松鹼M鍵合矽膠柱後，各雜質峰之間分離更好，溶劑峰及輔料峰不影響主峰及雜質峰的檢出，同時對流動相的梯度洗脫條件選擇性要求相對可以更低。3.檢出限(1)溴芬酸鈉精密稱取溴芬酸鈉約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置200ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，從圖中可看出，此時信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，溴芬酸鈉的檢測限為0.15ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.0025％。(2)雜質1精密稱取雜質1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置25ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取2ml，置10ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出,此時信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質1的最小檢出量為0.24ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。(3)雜質2精密稱取雜質2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出，此時信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質2的最小檢出量為0.24ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。(4)雜質3精密稱取雜質Ⅲ約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置100ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，從圖中可看出，此時信噪比(S/N)約為3，即在該色譜條件下，雜質3的最小檢出量為0.24ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的最小檢出限為0.004％。4.定量限(1)溴芬酸鈉精密稱取溴芬酸鈉約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，從圖中可看出，此時信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，溴芬酸鈉的定量限為0.6ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測定液連續進樣6次的標準偏差RSD小於2.0％。(2)雜質1精密稱取雜質1約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質1的定量限為0.6ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測定液連續進樣6次的標準偏差RSD小於2.0％。(3)雜質2精密稱取雜質2約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質2的定量限為0.6ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測定液連續進樣6次的標準偏差RSD小於2.0％。(4)雜質3精密稱取雜質3約10mg，置100ml量瓶中，加乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1ml，置200ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取1ml，置50ml量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，精密吸取60μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時信噪比(S/N)約為10，即在該色譜條件下，雜質3的定量限為0.6ng，相對於供試品溶液中溴芬酸鈉的定量限為0.01％，測定液連續進樣6次的標準偏差RSD小於2.0％。5.雜質校正因子的測定精密稱取溴芬酸鈉對照品、雜質1、雜質2和雜質3各約10mg，分別置100ml量瓶中，用乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，各精密量取1ml，分別置200ml量瓶中，用流動相A溶解並稀釋至刻度，搖勻。分別精密取上述溶液各60μl進樣，記錄色譜圖，同法，分別測定六次，具體結果見下表。由以上數據可知，雜質1、雜質2和雜質3相對響應因子均在0.9-1.1範圍內，所以可以採用不加校正因子的自身對照法對這三個已知雜質進行定量。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp