一種無標籤結核融合蛋白tb10-tb8的製作方法

2023-05-14 07:48:46

專利名稱：一種無標籤結核融合蛋白tb10-tb8的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程重組蛋白，具體地說是一種無標籤結核融合蛋 TB10-TB8，屬於疫苗製造技術領域。
背景技術：
結核病是長期危害人類健康的嚴重疾病之一，全世界仍有近1/3的人感染過結核分枝桿菌，大約有5%的結核感染者在2-5年內會發展為肺結核病人，其餘的有可能會形成結核病的潛伏感染者。我國是結核病高負擔的國家之一，每年約有13萬人因結核病而死亡。目前，卡介苗(BCG)的接種是有效預防結核病的重要措施。然而，不同研究顯示， BCG在不同人群中的保護性不穩定，尤其是對成人肺結核的保護效率介於0-80%不等。因此，研製和開發全面高效的抗結核疫苗是控制結核病的重要途徑。可供研究的抗結核疫苗有亞單位疫苗，重組BCG，減毒的結核分枝桿菌(MTB)活疫苗。亞單位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒為載體的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明確，使用安全等優點，相對易於被人們接受。大量研究表明，與單個抗原相比，融合抗原的免疫原性會增強，顯示出更好的保護效果；因此受到國內外研究的重視。然而在以往的研究中，為了後期簡便的純化方法，往往構建成帶有各種標籤(如His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，卻未考慮這種融合蛋白所帶有的標籤是否會影響到動物實驗以及更進一步的臨床學試驗的認可。

發明內容
本發明的目的在於，針對上述為了後期簡便的純化方法，而構建帶有各種標籤形式的融合蛋白問題，本發明通過基因重組、表達方法，提供了一種不帶有標籤的結核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，為預防和控制結核病提供有效的亞單位疫苗。抗原TB10. 4是早期分泌蛋白ESAT-6家族中的一員(ESAT-6，CFP-10, TB10. 4， TB10.3，etc)，且與ESAT-6相比，TB10. 4能在BCG接種人群中引起強烈反應，尤其是結核感染者中反應更強。其次，低分子質量蛋白TB8. 4是一種與結核分枝桿菌潛伏感染相關的重要抗原， 能誘導強烈的體液免疫反應，產生高水平的IgGl和IgGh，能誘導C57BL/ 6小鼠產生強烈的TB8. 4特異性Thl型細胞免疫反應，分泌高水平的IFN- Y，產生對感染細胞有強溶解能力的細胞毒性T細胞(CTL)，減少免疫鼠脾臟和肺中的細菌載量，保護小鼠抵禦毒性結核分枝桿菌的攻擊。本發明的技術方案為
一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其由以下步驟製備而成
(1)將結核分枝桿菌的基因TB10.4和TB8. 4進行重組融合，構建重組質粒；
(2)將上述步驟(1)中製備的質粒進行轉化，挑選陽性克隆進行誘導表達，獲得重組基
3因的表達物；
(3)對上述步驟(2)中的重組基因表達物進行純化。所述的步驟(1)的重組質粒的構建方法為根據GenBank中H37Rv中的TB10. 4和 TB8. 4的基因序列，應用分子克隆技術設計含有不同酶切位點的TB10. 4引物和TB8. 4引物， 以H37RV-DNA為模板PCR擴增出相應大小的基因片段，通過雙酶切和T4連接酶的作用將擴增的基因片段連接，將連接產物轉化入大腸桿菌克隆載體。所述的連接產物轉化入大腸桿菌克隆載體後，挑選陽性克隆進行PCR驗證並測序，測序結果見SEQ ID NO :1，測序正確的重組質粒再次轉化入大腸桿菌表達載體。PCR擴增獲得的TB10. 4和TB8. 4序列與GenBank中完全一致，二者融合後在大腸桿菌中表達產物大小約19KD，與預計大小相吻合。所述的步驟(2)的誘導表達方法為將步驟(1)中獲得的含有重組質粒的表達載體接入含有卡那黴素的LB液體培養基中，35 40°C振蕩培養10 14小時；再將Iml的該菌液移入IOOml的LB液體培養基中，35 40°C振蕩培養2 4小時，至吸光度A600值為 0. 6 0. 8，誘導振蕩培養6 他後，離心，收集菌體。所述的步驟(3)的融合基因以上清液表達為主，採用離子交換層析和疏水層析的兩種色譜分析方法進行最終的蛋白純化。一種無標籤結核融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，其特徵在於作為用於製備結核病疫苗的抗原。本發明的優點在於利用基因工程技術，克隆構建了不帶有任何標籤的結核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4，解決了融合蛋白所帶有的標籤會影響到動物實驗以及更進一步的臨床學試驗的後續問題，並且通過利用不同的色譜分析方法使融合蛋白得到了有效的純化，有望成為結核病預防的候選疫苗。


圖1結核分枝桿菌基因TB10. 4與TB8. 4體外擴增圖譜； 圖2重組質粒pET30a-TB10. 4的鑑定圖譜；
圖3重組質粒pET30a-TB10. 4與基因TB8. 4的連接圖譜； 圖4融合基因TB10.4-TB8.4的表達結果圖譜；
圖5無標籤結核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4第一步純化即離子交換層析圖； 圖6無標籤結核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4第二步純化即疏水層析圖； 圖7無標籤結核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-TB8. 4的純化結果圖譜； 圖3中1雙酶切以及純化的基因TB8. 4、2雙酶切以及純化的質粒pET30a-TB10. 4、3未酶切的質粒 pET30a-TB10. 4、M Marker ；
圖 4 中1 Marker,2 BL21 空菌上清、3 BL21 空菌沉澱、4 TB10. 4-TB8. 4 上清、5 TB10. 4-TB8. 4 沉澱；
圖 7 中1 Marker,2 純化前的 TB10. 4-TB8. 4、3 第一步純化後的 TB10. 4-TB8. 4、4 第二步純化後的TB10. 4-TB8. 4 ；
SEQ ID NO: 1 融合基因TB10. 4-TB8. 4的DNA測序結果(注GAATTC為EcoR I的酶切位點)。
具體實施例方式以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用於說明和解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例一
重組質粒pET30a-TB10. 4-TB8. 4的克隆構建
1、主要材料結核分枝桿菌株H37Rv來自甘肅省疾病控制中心；質粒pET30a、Ε. coli DH5a與BL21(DE3)由復旦大學王洪海教授惠贈；引物由上海生物生工工程有限公司合成； 基因測序由北京華大基因科技完成；PCR試劑盒、產物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自大連寶生物有限公司；基因組提取試劑盒、DNA Marker III購自蘭州市鵬程生物有限公司；質粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶I ,Η η lll,Nde I購自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；電熱鼓風乾燥箱(上海一恆科學儀器有限公司);超低溫冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超純水機AFZ0502U (重慶頤洋科技有限公司)；超淨工作檯(蘇州淨化)；東盛龍PCR儀；DYY12電泳儀及水平電泳槽(北京六一儀器廠)；IF258全自動凝膠成像分析系統(上海嘉鵬科技有限公司)；電子天平BT124S ；電熱恆溫培養箱(上海一恆科學儀器有限公司)；Beckman低溫高速離心機 (USA) ； JB3型定時恆溫磁力攪拌器(上海雷磁新徑儀器有限公司)；PH儀(PB-16) ；DK80電熱恆溫水槽(上海一恆科學儀器有限公司)
3、重組質粒pET30a-TB10. 4-TB8. 4的克隆構建方法
(1)根據GenBank中H37Rv中的TB10. 4和TB8. 4的基因序列，設計4對引物，分別為 TB10. 4上遊引物(10. 4s)含酶切位點Mfe I及起始密碼子；TB10. 4下遊引物(10. 4a)含酶切位點AcoR I ；TB8. 4上遊引物(8. 4s)含酶切位點I ；TB8. 4下遊引物(8. 4a)含酶切位點歷/2d III及終止密碼子。以H37Rv的DNA為模板，PCR擴增288bp的TB10. 4基因和249bp 的TB8. 4基因(見圖1)。TB10. 4基因的PCR條件為98°C變性10 s，55°C退火15 s，72°C聚合30 s,共30個循環。TB8.4基因的PCR條件為98°C變性10 s，61°C退火15 s，72V聚合 30 s,共30個循環。i2)Nde I ,EcoR I雙酶切並純化後的TB10. 4基因和質粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進行連接，轉化入E. coli DH5a中。PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑑定(北京華大基因科技完成測序)(見圖2)。即保存菌種為pET30a-TB10. 4 (DH5 α )。(3)提取以上鑑定正確的重組質粒pET30a_TB10. 4。￡coR I和歷idIII雙酶切TB8. 4 基因和重組質粒pET30a-TB10. 4，分別純化後用T4連接酶進行連接，轉化入E. coli DH5 α (見圖3)。PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑑定(北京華大基因科技完成測序)。即保存菌種為 pET30a-TB10. 4-TB8. 4 (DH5 α )。實施例二
融合基因ΤΒ10. 4-ΤΒ8. 4的誘導表達
1、主要材料低分子量蛋白Marker購自大連寶生物有限公司；卡那黴素、LB培養基成分(胰蛋白腖、氯化鈉、酵母提取物)及蛋白電泳相關試劑(丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺、 Tris、過硫酸銨、甘氨酸、SDS、TEMED, β巰基乙醇、G250等)、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉等試劑均購自蘭州市鵬程生物有限公司；IPTG購自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；電熱鼓風乾燥箱(上海一恆科學儀器有限公司);超低溫冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超純水機AFZ0502U (重慶頤洋科技有限公司)；超淨工作檯(蘇州淨化);DYY12電泳儀及垂直電泳槽(北京六一儀器廠);IF258全自動凝膠成像分析系統(上海嘉鵬科技有限公司);電子天平BT124S;電熱恆溫培養箱(上海一恆科學儀器有限公司)；Beckman低溫高速離心機(USA) ； JB3型定時恆溫磁力攪拌器(上海雷磁新徑儀器有限公司);PH儀(PB-16)；脫色搖床TS-I (海門市麒麟醫用儀器廠)；恆溫振蕩器IS-RDVl ；超聲波細胞破碎儀(寧波新芝)。3、融合基因TB10. 4-TB8. 4的誘導表達方法
(DUE. coli pET30a-TB10. 4-TB8. 4(DH5 α )提取重組質粒pET30a- TB10. 4- TB8. 4， 轉化入Ε. coli BL21(DE3)中，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑑定(北京華大基因科技完成測序)。即為保存菌種為pET30a-TB10. 4-TB8. 4 (BL21)。(2)將菌種 pET30a-TB10. 4-TB8. 4 (BL21) 10 μ 1 接入含有 50 μ g/ml 卡那黴素的 5ml的LB液體培養基中，37 °C振蕩培養約12小時；再將Iml的該菌液移入IOOml的LB液體培養基中(含有50 yg/ ml卡那黴素)，37 °C振蕩培養約3小時，至A600值為0. 6 0.8，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L ,25 °C誘導振蕩培養6 8h後，將菌液4°C離心， 10，OOOrpmX 20min 收集菌體。(3)將上述菌體按照5ml/g重懸於20mM PB緩衝液中，冰浴條件下超聲破碎細菌 40min lh左右(200W，超聲2s停2s)至液體澄清，4°C，10，OOOrpm離心20min後，將上清和沉澱分別進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(注將大腸桿菌BL21同等條件下誘導表達作為陰性對照！)。(4)經SDS-PAGE分析，與BL21空菌相比，分子量在19KD左右有明顯的特異蛋白表達條帶，而且以上清液表達為主，沉澱中蛋白極少(見圖4)。實施例三
無標籤融合蛋白TB10. 4-TB8. 4的純化
1、主要材料低分子量蛋白Marker購自大連寶生物有限公司；蛋白電泳相關試劑(丙烯醯胺、甲叉雙丙烯醯胺、Tris、過硫酸銨、甘氨酸、SDS、TEMED, β巰基乙醇、G250等)、 尿素、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉、MW8000-14000透析袋等均購自蘭州市鵬程生物有限公司； IPTG購自上海生物生工工程有限公司。2、主要儀器純化儀(ΑΚΤΑ purifierTM UPC100 Sweden) ；DYY12 電泳儀及垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；脫色搖床TS-I (海門市麒麟醫用儀器廠)；IF258全自動凝膠成像分析系統(上海嘉鵬科技有限公司)；PH儀(PB-16)；濾器及0. 45 μ m濾膜；酶標儀；離子交換柱(DEAE)；疏水層析柱(Butyl FF)03、配製緩衝液I 液 20mM PB (ρΗ7· 4)； II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4);ΙΙΙ液 20mM ΡΒ+2 M NaCl (ρΗ7· 4)。4、大量表達融合蛋白ΤΒ10. 4-TB8. 4，收集的菌體重懸於20mM PB緩衝液中，冰浴下超聲破碎40mirTlh至液體澄清，4°C，10, OOOrpm離心20min離心後取上清液，0. 45 μ m濾膜進行過濾。5、測定蛋白濃度(mg/ml)，根據所選層析柱的載量，計算確定蛋白的上樣量。
6
6、第一步純化離子交換層析。選用弱陰離子交換柱DEAE進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得初步純化物。具體步驟如下⑴用5-10個柱體積的起始緩衝液A液即I液平衡分離柱，或直到基線，pH及電導穩定後。⑵將樣品調整至I液的起始 PH和離子強度，並加載至分離柱。⑶用5-10個柱體積的A液(I液)衝洗分離柱，或直到基線，PH及電導穩定，即所有未結合物質均被衝洗出分離柱。⑷用10-20個柱體積的梯度進行洗脫，離子強度逐漸增加(0%B-100%B，注B液為II液)，直至目的蛋白被洗脫下來。收集不同的洗脫成分進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分析(見圖5和圖7)。7、第二步純化疏水層析。經過離子交換層析初步純化後的蛋白，加入等體積的III 液，使蛋白含高鹽上柱。選用Butyl FF柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE 分析得最終純化物。具體步驟如下⑴用5-10個柱體積的起始緩衝液A液即II液來平衡柱子，或直到紫外吸光回到基線，電導平衡。⑵調節樣品到選擇的A液的鹽濃度和pH。過濾， 上樣到柱子上。⑶用5-10個柱體積的A液衝洗或直到紫外吸光回到基線，電導平衡，此時所有的未結合的蛋白被從柱子上洗脫掉。W傭10-20個柱體積開始洗脫，增加B液(I液) 的比例，直到鹽濃度達到最低，就是無鹽緩衝液(100%的B液)。收集不同的洗脫成分進行聚丙烯醯胺凝膠電泳分析(見圖6和圖7)。8、將最終的蛋白純化產物凍存待用。最後應說明的是以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明， 儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於由以下步驟製備而成(1)將結核分枝桿菌的基因TBio.4和TB8. 4進行重組融合，構建重組質粒；(2)將上述步驟(1)中製備的質粒進行轉化，挑選陽性克隆進行誘導表達，獲得重組基因的表達物；(3)對上述步驟(2)中的重組基因表達物進行純化。
2.根據權利要求1所述的一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於所述的步驟(1)的重組質粒的構建方法為根據GenBank中H37Rv中的TB10.4和TB8. 4的基因序列，應用分子克隆技術設計含有不同酶切位點的TB10. 4引物和TB8. 4引物，以H37Rv_DNA為模板 PCR擴增出相應大小的基因片段，通過雙酶切和T4連接酶的作用將擴增的基因片段連接， 將連接產物轉化入大腸桿菌克隆載體。
3.根據權利要求2所述的一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於所述的連接產物轉化入大腸桿菌克隆載體後，挑選陽性克隆進行PCR驗證並測序，測序正確的重組質粒再次轉化入大腸桿菌表達載體。
4.根據權利要求1所述的一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於所述的步驟(2)的誘導表達方法為將步驟(1)中獲得的含有重組質粒的表達載體接入含有卡那黴素的LB液體培養基中，35 40°C振蕩培養10 14小時；再將Iml的該菌液移入IOOml的LB 液體培養基中，35 40°C振蕩培養2 4小時，至吸光度A600值為0. 6 0. 8，誘導振蕩培養6 後，離心，收集菌體。
5.根據權利要求1所述的一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於所述的步驟(3)採用離子交換層析和疏水層析的兩種色譜分析方法進行最終的蛋白純化。
6.根據權利要求1所述的一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，其特徵在於作為用於製備結核病疫苗的抗原。
全文摘要
本發明涉及一種無標籤結核融合蛋白TB10-TB8，利用基因工程技術，將結核分枝桿菌的基因TB10.4和TB8.4進行重組融合，構建重組質粒pET30a-TB10.4-TB8.4，進行誘導表達，獲得重組基因的表達物，最後將重組基因表達物進行純化，克隆構建了不帶有任何標籤的結核分枝桿菌融合蛋白TB10.4-TB8.4。本發明的優點在於解決了融合蛋白所帶有的標籤會影響到動物實驗以及更進一步的臨床學試驗的後續問題，並且通過利用不同的色譜分析方法使融合蛋白得到了有效的純化，有望成為結核病預防的候選疫苗。
文檔編號C12R1/19GK102174113SQ20111002808
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月26日 優先權日2011年1月26日
發明者萬豔, 張穎, 王秉翔, 祝秉東, 章國平, 胡麗娜, 達澤蛟, 高娃 申請人:蘭州大學