紅腺忍冬莖葉提取物、其醫藥用途及藥物組合物的製作方法
2023-05-14 15:34:26
專利名稱：紅腺忍冬莖葉提取物、其醫藥用途及藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及忍冬屬植物紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq)有效部位提取物，即從紅腺忍冬的莖葉提取物，該提取物具有很強的保肝活性。
背景技術：
紅腺忍冬，拉丁學名Lonicera hypoglauca Miq，英文名稱Honeysuckle，為常綠纏繞灌木，長可達8米，莖常中空；分枝多，嫩部被微柔毛。葉對生，紙質，卵形至卵狀矩圓形，長4～11釐米，寬1.5～5釐米，頂端短尖至漸尖，基部圓或近心形，上面近無毛，下面被肉毛，密布紫紅色或褐紅色的腺點，葉柄長約5～8毫米。花夏初開放，白色，後變黃色。花蕾長2.5～4.5cm。無毛或疏被毛，開放者下唇反轉。生於路旁、溝邊、林緣等處的灌叢中。主產浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西、四川等省區。
山銀花系05版《中國藥典》收載品種，紅腺忍冬(L.hypoglauca Miq)即山銀花基源植物之一。山銀花具清熱解毒，涼散風熱作用。用於癰腫疔瘡，喉痺，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發病。至今未見紅腺忍冬的其它有效部位的報導。
發明內容
本發明公開了一種紅腺忍冬的有效部位提取物，即紅腺忍冬的莖葉提取物，通過以下方法製備得到取紅腺忍冬莖葉為原料，用低極性有機溶劑進行脫脂；脫脂後的莖葉，用水或乙醇提取，得提取液；提取液濃縮；濃縮液上大孔樹脂柱，用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；洗脫液濃縮，離心除去沉澱，取上清液；用正丁醇萃取，濃縮萃取液，乾燥，即得。
上述紅腺忍冬莖葉提取物提取方法中，低極性有機溶劑優選石油醚。
其中脫脂時間優選2～10小時。
用水或乙醇提取均可，優選用乙醇提取。乙醇的濃度優選50～100％。更優選60～80％。本發明的乙醇的濃度均為體積百分比。
洗脫時，乙醇的濃度優選10-30％，更優選的濃度是25％。用水洗脫的目的主要是去掉部分溶於水的雜質。
其中大孔樹脂優選自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
萃取時優選用水飽和的正丁醇。
洗脫劑的用量和濃度直接關係到產品得率和生產成本，本發明優選10-30％乙醇作為洗脫劑，在保證樣品完全洗脫完的基礎上有效地控制了乙醇的用量。下面是洗脫用乙醇濃度變化對提取物的影響試驗含量測定方法儀器與試劑 高效液相色譜儀Aglient1100系列，二元泵G1312A，自動進樣器，二極體陣列檢測器，Chemstation A.06.01化學工作站，色譜柱Aglient Zorbax 80A，Extend-C18(4.6mm×250mm，5cm)，純水(自製)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純。
色譜條件 流動相0.1％磷酸溶液-甲醇(80∶20)，維持0-5min；在5-10min流動相比例線性改變至(75∶25)，10-30min維持比例(75∶25)；在30-35min線性改變至(67∶33)；流速為1.0mL·min-1，檢測波長為250nm，柱溫30℃。
分離純化工藝提取液適當濃縮後，大孔樹脂分段，依次分別用水，10％，25％，35％，45％，55％的乙醇洗脫，收集每部分洗脫液，定容至100ml容量瓶，高效液相檢測分析結果顯示獐牙菜苷和馬錢子苷主要集中在水、10％和25％乙醇(即0～25％乙醇)洗脫液中，直至35％乙醇洗脫液中未能檢測出獐牙菜苷和馬錢子苷，說明25％醇已能將兩者洗脫完全。而用水洗脫部分雜質較多，獐牙菜苷和馬錢子苷含量相對較小，因此，用水洗脫部分棄去，收集乙醇部分的洗脫液能保證提取物含量高、純度高。為工業化生產操作簡便，可以優選直接用25％乙醇洗脫，濃縮洗脫液後離心，用水飽和正丁醇萃取，得總環烯醚萜苷。
具體試驗圖譜見圖1～5。
經檢測發現，本發明的紅腺忍冬莖葉提取物富含總環烯醚萜苷類化合物。從經濟效益來說，莖葉的原料價格遠遠低於花蕾的價格，本發明顯著降低了生產成本。總環烯醚萜苷中主要含獐牙菜苷和馬錢子苷，因此，本發明可以以獐牙菜苷、馬錢子苷為指標成分研究本發明提取物的製備工藝，並可將獐牙菜苷、馬錢子苷作為中間體進行質量控制。以獐牙菜苷與馬錢子苷的含量之和計為總環烯醚萜苷含量，本發明提取物的獐牙菜苷與馬錢子苷含量比例在1∶3～1∶7，兩者之和佔總提取物60％以上。用水提取的提取物含量稍低。本發明提取物製備工藝操作，方便，成本低，無有害溶劑，生產安全性高，適合工業化生產。
藥理學試驗表明，本發明的提取物具有保肝作用。
本發明提取物的保肝活性研究試驗材料藥物按本發明方法製備的紅腺忍冬提取物(HG-4，實施例1製備)低、中、高劑量組；馬錢子苷(HG-1)；獐牙菜苷(HG-2)；secologanin(HG-3)。
動物昆明種小鼠，體重18-22克。
試劑及儀器CCL4；羧甲基纖維素鈉；聯苯雙酯；方法急性肝損傷模型與給藥昆明種小鼠100隻，按體重隨即分為9組，即HG-1組、HG-2組、HG-3組、HG-4低劑量組、HG-4中劑量組、HG-4高劑量組、陽性藥(聯苯雙酯)組、模型組、正常組，每組10隻。除正常組及模型組外，各組小鼠分別用HG-1(12mg/kg)、HG-2(12mg/kg)、HG-3(12mg/kg)、HG-4低(10mg/kg)、HG-4中(20mg/kg)、HG-4高(40mg/kg)、聯苯雙酯(200mg/kg)灌胃，0.ml/10g，正常組和模型組給予相同量之CMC-Na 0.1ml/10g，灌胃一周。一周後除正常組外均給予0.1％的CCl4(CCl4∶花生油＝1∶99)，腹腔注射20ml/kg。
試驗樣品製備及測定給予CCl4二十四小時後小鼠摘眼球取血，離心分離血清，血清零下20℃保存，備肝功能檢測。剪取肝右葉，10％福馬林固定，標本做病理切片。另取新鮮肝臟0.5g剪碎，加生理鹽水4.5ml，手動勻漿，4000rpm離心10min，取上清即為10％肝勻漿，測丙二醛(MDA)，勻漿稀釋後測超氧化物歧化酶(SOD)的含量。將10％的勻漿稀釋為2％的勻漿後，考馬斯亮蘭法測組織蛋白含量。按試劑盒方法測血清谷丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)、鹼性磷酸酶(AKP)。
統計學處理設計資料以x±s表示，數據取均值進行組間t檢驗，P＜0.05有統計學意義。
實驗結果表1環烯醚萜苷類化合物保肝活性的比較
*正常與模型組P＜0.05，說明造模成功。
n＝10從表1可以看出，本發明的提取物藥理作用優於馬錢子苷和獐牙菜苷，而馬錢子苷和獐牙菜苷屬天然藥物有效成分，製備工藝複雜，成本高。本發明的提取物製備工藝簡單，成本低，提取物中含有一定量的馬錢子苷和獐牙菜苷，但藥理作用比馬錢子苷和獐牙菜苷強。說明本發明的提取物中還含有其它對保肝藥理活性良好的成分，並且有可能這些成分之間有協同作用。
試驗證明，本發明的紅腺忍冬莖葉提取物對四氯化碳所致小鼠肝損傷有很強的保護作用，並且呈一定的劑量依賴性。
本發明的紅腺忍冬莖葉提取物可以用於臨床，一般的用量為成人每日20～500mg。也可根據不同的疾病嚴重程度及不同的劑型偏離該範圍。
本發明的紅腺忍冬莖葉提取物可單獨或與其它中藥及中藥提取物組配製成藥物。
本發明的紅腺忍冬莖葉提取物可與藥學上可接受的載體混合，用於製備治療用藥物組合物。可製備成藥劑學上通用的劑型，如膠囊、片劑、丸劑、口服液、顆粒劑、酊劑、緩釋劑等胃腸道給藥劑型及注射劑、外用製劑等胃腸外給藥劑型。
圖1是混合標準品的液相色譜2是本發明總環烯醚萜苷部分的液相色譜3大孔樹脂10％乙醇洗脫液的液相色譜4大孔樹脂25％乙醇洗脫液的液相色譜5大孔樹脂35％乙醇洗脫液的液相色譜圖上述圖中各標識峰的含義1-獐牙菜苷(sweroside)；2-馬錢子苷(loganin)具體實施方式
含量測定方法儀器與試劑 高效液相色譜儀Aglient1100系列，二元泵G1312A，自動進樣器，二極體陣列檢測器，Chemstation A.06.01化學工作站，色譜柱Aglient Zorbax 80A，Extend-C18(4.6mm×250mm，5cm)，純水(自製)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純。
色譜條件 流動相0.1％磷酸溶液-甲醇(80∶20)，維持0-5min；在5-10min流動相比例線性改變至(75∶25)，10-30min維持比例(75∶25)；在30-35min線性改變至(67∶33)；流速為1.0mL·min-1，檢測波長為250nm，柱溫30℃。
實施例1取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取4小時進行脫脂後，藥材重量12倍體積的60％乙醇，85℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經D101大孔樹脂分段，先用水洗脫去雜質，再依次用10％、25％乙醇洗脫。將10％和25％醇洗脫液合併，濃縮後，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶6.5，總環烯醚萜苷含量為60.58％。
實施例2取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取4小時進行脫脂後，藥材重量10倍體積的80％乙醇，85℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經HPD100大孔樹脂分段，先用水洗脫去雜，再用30％乙醇洗脫。乙醇洗脫液濃縮後，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶6.6，總環烯醚萜苷含量為59.34％。
實施例3取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取2小時進行脫脂後，藥材重量8倍體積的60％乙醇，85℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、25％乙醇洗脫。乙醇洗脫液合併後濃縮，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶4.7，總環烯醚萜苷含量為60.22％。
實施例4取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取6小時進行脫脂後，藥材重量10倍體積的70％乙醇，85℃熱回流提取二次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經D1大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、25％乙醇洗脫。將10％和25％醇洗脫液合併，濃縮後，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶6.3，總環烯醚萜苷含量為61.27％。
實施例5取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取6小時進行脫脂後，藥材重量12倍體積的70％乙醇，85℃熱回流提取三次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經D101大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、25％乙醇洗脫。將10％和25％醇洗脫液合併，濃縮後，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶5.0，總環烯醚萜苷含量為62.53％。
實施例6取紅腺忍冬莖葉藥材20g，石油醚80℃回流提取2小時進行脫脂後，藥材重量8倍體積的水，加熱回流提取三次，每次1小時。提取液合併，減壓回收溶劑。所得濃縮液經HPD300大孔樹脂分段，先用水洗脫，再依次用10％、25％乙醇洗脫。將10％和25％醇洗脫液合併，濃縮後，離心除去沉澱物，取上清液，用水飽和正丁醇萃取4次，合併萃取液，濃縮真空乾燥即得，獐牙菜苷與馬錢子苷含量比為1∶4.2，總環烯醚萜苷含量為51.53％。
實施例7取實施例1方法製備的提取物100mg與澱粉100mg，糊精100mg混合，用適量30％乙醇作溼潤劑，製成軟材，常規方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，製成片劑。
權利要求
1.一種紅腺忍冬莖葉提取物，其特徵是由下列方法製備得到取紅腺忍冬莖葉為原料，用低極性有機溶劑進行脫脂；脫脂後的莖葉，用水或乙醇提取，提取液濃縮；濃縮液上大孔樹脂柱，用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，離心除去沉澱，取上清液；用正丁醇萃取，濃縮萃取液，乾燥，即得。
2.權利要求1的提取物，其中低極性有機溶劑是石油醚。
3.權利要求1的提取物，其中脫脂時間為2～10小時。
4.權利要求1的提取物，其中提取用的乙醇濃度為50-100％。
5.權利要求4的提取物，其中提取用的乙醇濃度為60-80％。
6.權利要求1的提取物，其中洗脫用的乙醇濃度為10～30％。
7.權利要求6的提取物，其中洗脫用的乙醇濃度為25％。
8.權利要求1的提取物，其中大孔樹脂選自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
9.藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1至8中任一項的提取物及藥學上可接受的載體。
10.權利要求1至8中任一項的提取物用於製備護肝藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及忍冬屬植物紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq)有效部位提取物，即紅腺忍冬的莖葉提取物，可以用以下方法製備得到取紅腺忍冬莖葉為原料，用低極性有機溶劑進行脫脂；脫脂後的莖葉，用乙醇提取，得乙醇提取液；濃縮；濃縮液上大孔樹脂柱，用水洗脫，再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；洗脫液濃縮，離心除去沉澱，取上清液；用正丁醇萃取，濃縮萃取液，乾燥，即得。本發明的提取物具有很強的保肝活性。
文檔編號A61K135/00GK1850143SQ20061003866
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月7日 優先權日2006年3月7日
發明者李萍, 賀清輝, 李會軍, 畢志明 申請人:中國藥科大學