蠟狀芽孢桿菌kmsr88及其接種劑和應用的製作方法

2023-05-14 15:27:26 1

專利名稱：蠟狀芽孢桿菌kmsr88 及其接種劑和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蠟狀芽孢桿菌KMSR88及其接種劑和應用，具體涉及一種能有效分解纖維素及生長溫度廣譜的蠟狀芽孢桿菌KMSR88及其堆肥接種劑和應用，屬環境微生物技術領域。
背景技術：
水葫蘆，又名鳳眼蓮，屬雨久花科水葫蘆屬，是一種原產於南美洲的多年生浮水植物。水葫蘆生性喜光，適應於熱帶、亞熱帶氣候(27-30°C為最佳生長溫度)，生長速度快， 在適合條件下，每五日生物量即可增加一倍；單位生物量大，每公頃水面可達200萬株，合 300-400噸；忍耐力極強，不論是在貧營養，還是在富營養湖泊、水庫，甚至在高酸性和高鹼性水體中，水葫蘆都能存活(盛婧等，2010)。近年來，隨著我國許多水體富營養化程度的加劇，水葫蘆的分布面積有不斷增大的趨勢，其在江河、湖泊、水庫大面積覆蓋常見報導，因此，水葫蘆在我國資源豐富。由於水葫蘆大面積覆蓋，易造成水體溶解氧降低、生物多樣性減少、水上交通堵塞等不良影響，每年南方很多地區都需要積極採取措施對其進行打撈防除，但是水葫蘆被打撈後往往直接丟棄，造成嚴重的二次汙染和資源浪費(劉紅江等2011 )。
研究證明，水葫蘆具有較高的利用價值。Gajalakshmi and Abbasi (2002)研究結果表明，利用水葫蘆混合堆肥生產的綠肥，對植物的生長產生明顯的促進效果，而且是安全可行的。Murugesan等以水葫蘆、稻草為原料栽培食用菌，結果表明，水葫蘆處理的收益顯著高於稻草處理。通過水葫蘆的轉化利用來減少水葫蘆數量，使之變廢為寶，是控制水葫蘆水體危害及二次汙染的良好途徑。已有的研究表明，水葫蘆是鉀含量最高的水生植物之一 (Reddy et al.，1991 ；周文兵等，2004)，全株幹基鉀含量能夠達到5%以上，水葫蘆也具有較強的氮吸收能力，氮含量可達3%。由此可見，水葫蘆植株是極好的養分資源。而且，在水葫蘆眾多處置措施中，水葫蘆農田施用是最為經濟有效、環境友好、操作簡單的一種處理方式。由於到水葫蘆打撈和作物生長在時間上可能存在的不同步性，水葫蘆常被簡易堆製成有機肥施用。作為補充土壤鉀的良好措施，水葫蘆有機肥在農田施用在我國南方發展潛力巨大。隨著滇池水葫蘆種植面積的擴大，水葫蘆渣的產生量也急劇增加。水葫蘆渣的處理與處置已成為限制利用水葫蘆去除滇池中的富營養化的限制條件之一。水葫蘆渣堆肥與其他處理方法，如填埋、焚燒相比，具有建設投資少，運行費用低，基本無二次汙染等優點。並且， 水葫蘆渣經堆肥處理後能土地利用，充分利用其有機質和氮、磷等營養元素，是適合我國國情的處置方式。但是，堆肥工廠化的發展一直受到因堆肥時間和場地帶來的成本問題的困擾，堆肥的快速化具有重要的現實意義。
水葫蘆渣堆肥接種已成為提高堆肥質量和發酵效率的重要手段之一。目前，已有多種微生物被應用於堆肥接種。但這些菌株大多分解水葫蘆有機質能力不強，並不是從水葫蘆渣中分離而得，為中溫菌，主要的作用體現在促進堆肥起溫方面，但當堆溫達到 45-50°C以上時，不能繼續有效發揮降解的作用，使有機物的分解效率下降，無害化效果較差，影響堆肥腐熟。因此，迫切需要尋找一類既能在中溫、又能在高溫的條件下，代謝有機物的溫度廣譜性微生物，並且，把這類微生物接種到堆肥中，在堆肥的中溫期和高溫期利用有機物進行生長代謝，促進迅速達到高溫期及維持較長的時間，實現水葫蘆渣的快速腐熟，減少進一步的環境汙染，降低成本，縮短生產發酵時間。
本發明涉及一種生長溫度廣譜的蠟狀芽孢桿菌KMSR88及其應用，能在水葫蘆渣堆肥處理中加快腐熟過程和纖維素分解。經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報導。
參考文獻
[I] Reddy K. R. , Agami M. , D，Angelo E. M. , Tucker J. C, Influence of K supply on growth and nutrient storage of water hyacinth. Bioresource Technol, 1991，37 (I) 79 - 84
[2]劉紅江，陳留根，朱普平，盛婧，張嶽芳，鄭建初，農田施用水葫蘆對水稻乾物質生產與分配的影響，應用與環境生物學報，2011，17(4) =521-526
[3]盛婧，陳留根，朱普平，周煒，薛新紅，高養分富集植物水葫蘆的農田利用研究，中國生態農業學報，2010，18 (I) 46-49
[4]謝建昌，周建民，Harder R.鉀與中國農業.南京河海大學出版社，2000 : 105-106
[5]周文兵，劉大會，朱端衛，不同調理劑對豬糞堆肥過程及其養分狀況的影響， 華中農業大學學報，2004，23 (4) 421 - 42
發明內容
本發明的目的在於提供一種臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)KMSR88及其接種劑和應用。
本發明的目的是這樣實現的
本發明菌株KMSR88是從採自昆明神瑞農業有限公司堆肥發酵車間腐熟的水葫蘆堆肥樣品中分離篩選得到的一株在中高溫範圍均能代謝有機物質進行生長，並且具有良好分解纖維素能力的蠟狀芽孢桿菌菌株，該菌株已於2012年9月21日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCjia :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏號 CGMCC No. 6596。
本發明菌株KMSR88具有如下特性KMSR88菌株菌體細胞杆狀，末端方，成短或長鏈，I. O 1.2X3. O 5. O微米。產芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，I. O I. 5微米。革蘭氏陽性，無莢膜，運動。菌落大，表面粗糙，扁平，不規則。菌落形態在普通瓊脂平板培養基上，37 °C，培養24 h，形成圓形或近似圓形、質地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落(似蠟燭樣顏色)直徑5-7 mm.在MSP培養基上生長更旺盛，菌落直徑達8_10 mm，質地更軟，挑起來呈絲狀，培養時間稍長，菌落表面呈毛玻璃狀，並產生紅色色素。在蛋白腖酶母膏平板上菌落為灰白色，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，菌落較大。
含有蠟樣芽孢桿菌KMSR88的接種劑，經如下步驟得到
(I)、菌種活化取蠟樣芽孢桿菌KMSR88的菌種接種於LB液體培養基胰蛋白腖 10g/L，酵母萃取物 5g/L，NaCl 10g/L, ρΗ7· O 中，在 30-37 °C 條件下培養 3_5d ；
(2)、發酵種子液製備將活化的菌種接種於LB液體培養基中進行一級擴大培養，當培養液0D_在大於I. 5時停止培養，得一級種子；將一級種子按體積比8%接種至LB液體培養基中進行二級擴大培養，當培養液OD6tltl在大於2. 6時停止培養，得發酵種子液；一級、二級培養條件均為30-37°C，轉速為120-180r/min，培養時間為5_7d ；
(3)、接種劑的製備在含水量為40%_50%的稻殼堆中添加尿素和蔗糖，24h後， 再在稻殼堆中均勻潑灑麩皮、玉米粉和發酵種子液進行堆置發酵，期間翻堆，至溫度穩定在環境溫度時，停止發酵，將發酵產物乾燥，製得接種劑；其中
a.尿素和蔗糖的添加方法為分別按稻殼乾重質量比O. 5%和2%稱取尿素和蔗糖，將尿素和蔗糖與水按重量比1:20配成溶液，均勻潑灑稻殼堆中；
b.麩皮、玉米粉和發酵種子液的添加方法為將按稻殼堆乾重1%的麩皮、2%的玉米粉和2%的步驟(2)得到的發酵種子液混合，混拌均勻後潑灑在稻殼堆中，稻殼堆體高度O. 6-1. Sm，佔地面積〈50m 2，蓋上透氣性覆蓋物進行堆置發酵；
c.當發酵溫度達到60_65°C並持續36_48h後，進行第I次翻堆，以後按第I次翻堆的條件再翻堆4-8次，直到溫度穩定在環境溫度後，將發酵產物在45-55°C下烘乾6h， 得固態接種劑。
3、權利要求2所述的接種劑按堆肥總乾重的8%_10%應用於水葫蘆渣堆肥中。
本發明的優點在於
I、蠟樣芽孢桿菌KMSR88能較好的分解纖維素，並能在廣譜性溫度生長；將其製成接種劑用於水葫蘆渣堆肥中，能促進纖維素的分解，快速起溫，迅速進入堆肥高溫階段 (500C以上)並維持較長的高溫(50-70°C )，促進水葫蘆渣脫水和高溫滅菌，加快水葫蘆渣的腐熟進程，提高堆肥的質量和發酵效率。
2、蠟樣芽孢桿菌菌株KMSR88效果明顯，無害、無環境造成汙染具有重要的經濟價值和應用前景，適合大規模應用於大面積水域種植的水葫蘆渣堆肥中。


圖I顯示接種和滅活處理堆肥後的溫度變化。
具體實施例方式
實施例所用的設備均為市場銷售的通用設備。
實施例I :蠟樣芽孢桿菌KMSR88的分離與純化
稱取昆明神瑞農業有限公司堆肥發酵車間的水葫蘆渣堆肥腐熟的樣品有機肥0.5 g,加入大約20 mL無菌水，混勻,使樣品懸浮，取懸浮液I mL接種到含100 mL液體種子培養基的250 mL搖瓶中，45° CU80 r/min培養5 d。取I mL培養液梯度稀釋至102、104、IO6UO8塗布於固體培養基上47° C培養2 d。挑取平板上菌落飽滿、透明圈明顯的單個菌落接種於液體培養基中，47° CU80 r/min再培養2 d。重複液體培養和固體平板分離3次。)，挑取生長旺盛的單菌落，在細菌培養基上，反覆劃線分離純化3次， 再將形態一致的菌落製片，進行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態，多視野下觀察菌體細胞形態，確認菌體形態一致後，接種至細菌斜面培養至豐厚，在4°C下保存，備用。將初篩得到的單菌株進行纖維素分解鑑定和不同溫度活性實驗，最終篩選出一株在40°C 70°C下能同時有效分解纖維素的溫度廣譜性菌株KMSR88。
實施例2 :菌株KMSR88的鑑定
生理生化特徵菌株的生理和生化特徵實驗測定方法及鑑定，革蘭氏染色結果表明，菌株KMSR88為革蘭氏陽性。菌株KMSR88能在多種碳源中生長，能利用葡萄糖、 果糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖作為唯一碳源進行生長；其接觸酶反應陽性，氧化酶反應陽性。根據《伯傑細菌鑑定手冊》，其特徵與芽孢桿菌屬細菌較為相似。菌株KMSR88的 16S rRNA基因序列分析採用PCR技術，成功擴增出菌株KMSR88的16SrRNA基因，然後克隆和測序。測定的序列長度為1370 bp，獲得的16S rRNA基因序列通過GENBANK資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進行比對,結果顯示相似性在99%以上的菌株均為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的菌株，把該菌株編號命名為KMSR88，並於 2012年9月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為 Bacillus cereus，保藏號 CGMCC No. 6596。
實施例3 :蠟樣芽孢桿菌KMSR88分解纖維素活性測定
將實菌株蠟樣芽孢桿菌KMSR88菌株在無菌環境中接種至培養基(胰蛋白腖IOg/ L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, pH7. O)上，在37°C下培活化養3天，然後在無菌環境中，用接種針挑取一環KMSR88，接種至裝有600ml已滅菌的細菌培養基中，在180rpm，37°C 下振蕩培養3天，得發酵液。發酵液經4000 r/min離心10 min,上清液作為粗酶液。用0.5 mL適當稀釋的酶液於70° C恆溫水浴預熱2 min後，加入1.5 mL用醋酸緩衝液 pH 4. 8配製的1%羧甲基纖維素鈉溶液，70° C恆溫水浴酶解30 min,加入I mL濃度為I mol/L的氫氧化鈉搖勻以終止反應。然後加入2 mL的DNS於沸水浴中5 min,用流動的冷水終止反應，冷卻後在540 nm下測定其吸光值，並對照標準曲線後測算酶活力。結果顯示產酶的菌株KMSR88所產生的纖維素酶40°C 70°C下，相對酶活力較高，達到85% 100%。在此溫度範圍之外，相對酶活力較低。
實施例4 :接種劑的製備
含有蠟樣芽孢桿菌KMSR88的接種劑，經如下步驟得到
(I)、菌種活化取蠟樣芽孢桿菌KMSR88的菌種接種於LB培養基胰蛋白腖IOg/ L，酵母萃取物5g/L，NaCl 10g/L, pH7. O中，在30°C或37°C條件下培養3d或5d ;
(2)、發酵種子液製備將活化的菌種接種於LB液體培養基中進行一級擴大培養， 當培養液0D_在大於I. 5時停止培養，得一級種子；將一級種子按體積比8%接種至LB液體培養基中進行二級擴大培養，當培養液OD6tltl在大於2. 6時停止培養，得發酵種子液；一級、 二級培養條件均為30°C或37°C，轉速為120 r/min或150 r/min或180r/min，培養時間為 5d 或 7d ;
(3)、在含水量為40%或50%的稻殼堆中添加尿素和蔗糖，24h後，再在稻殼堆中均勻潑灑麩皮、玉米粉和發酵種子液進行堆置發酵，期間翻堆，至溫度穩定在環境溫度時， 停止發酵，將發酵產物乾燥，製得接種劑；其中
a.尿素和蔗糖的添加方法為分別按稻殼乾重質量比O. 5%和2%稱取尿素和蔗糖，將尿素和蔗糖與水按重量比1:20配成溶液，均勻潑灑稻殼堆中；
b.麩皮、玉米粉和發酵種子液的添加方法為將按稻殼堆乾重1%的麩皮、2%的玉米粉和2%的步驟(2)得到的發酵種子液混合，混拌均勻後潑灑在稻殼堆中，稻殼堆體高度O. 6 m或I. 2m或I. 8m,佔地面積〈50m2，蓋上透氣性覆蓋物進行堆置發酵；
c.當發酵溫度達到60或65°C並持續36h或42h或48h後，進行第I次翻堆，以後按第I次翻堆的條件再翻堆4-8次，直到溫度穩定在環境溫度後，將發酵產物在45°C或 55°C下烘乾6h，得固態接種劑。
實施例5 :接種劑的應用和效果
將實施例4中製備的接種劑按堆肥總乾重的8%或10%的接種量接種於水葫蘆渣堆肥中，並以滅活的該堆肥接種劑為對照，以草炭為輔料，調節碳氮比為25，含水率56%，進行堆肥，堆肥周期為22天，每天測定堆肥溫度，當堆肥溫度上升至60°C並持續24小時後進行翻堆，翻堆後繼續發酵，直至物料均為灰黑褐色時，物料發酵成熟。從圖I可見，與滅活對照比，實施例54的堆肥接種劑接菌處理在第2天就超過了 50°C，使堆肥高溫期(大於 500C )提前；接菌處理的最高溫度比滅活對照高19°C(接菌處理53°C ;滅活對照34°C)， 接菌處理的高溫期比滅活對照長6天(接菌處理16天；滅活對照10天)。說明本接種劑用於水葫蘆渣堆肥中，能促進纖維素有機物的降解，使堆體快速起溫，迅速進入堆肥高溫階段(50°C)並維持較長的高溫(50-70°C)，效果明顯，無害、無環境造成汙染。試驗結果顯示本發明提供的蠟樣芽孢桿菌KMSR88製得的接種劑能夠使堆體快速起溫，迅速進入高溫階段，並維持長時間高溫，有利於有機物的快速降解和腐熟進程，提高了堆肥的質量和發酵效率。
權利要求
1.蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) KMSR88，其保藏編號為 CGMCC No. 6596。
2.含有權利要求I所述蠟樣芽孢桿菌KMSR88的接種劑，其特徵在於該接種劑經如下步驟得到(1)、菌種活化取蠟樣芽孢桿菌KMSR88的菌種接種於LB液體培養基胰蛋白腖IOg/ L，酵母萃取物5g/L, NaCl 10g/L, pH7. O中，在30_37°C條件下培養3_5d ;(2)、發酵種子液製備將活化的菌種接種於LB液體培養基中進行一級擴大培養，當培養液0D_在大於I. 5時停止培養，得一級種子；將一級種子按體積比8%接種至LB液體培養基中進行二級擴大培養，當培養液OD6tltl在大於2. 6時停止培養，得發酵種子液；一級、二級培養條件均為30-37°C，轉速為120-180r/min，培養時間為5_7d ；(3)、接種劑的製備在含水量為40%-50%的稻殼堆中添加尿素和蔗糖，24h後，再在稻殼堆中均勻潑灑麩皮、玉米粉和發酵種子液進行堆置發酵，期間翻堆，至溫度穩定在環境溫度時，停止發酵，將發酵產物乾燥，製得接種劑；其中a.尿素和蔗糖的添加方法為分別按稻殼乾重質量比O.5%和2%稱取尿素和蔗糖，將尿素和蔗糖與水按重量比1:20配成溶液，均勻潑灑稻殼堆中；b.麩皮、玉米粉和發酵種子液的添加方法為將按稻殼堆乾重1%的麩皮、2%的玉米粉和2%的步驟(2)得到的發酵種子液混合，混拌均勻後潑灑在稻殼堆中，稻殼堆體高度 O. 6-1. Sm，佔地面積〈50m2，蓋上透氣性覆蓋物進行堆置發酵；c.當發酵溫度達到60-65°C並持續36-48h後，進行第I次翻堆，按照前述方法再翻堆 4-8次，直到溫度穩定在環境溫度後，將發酵產物在45-55°C下烘乾6h，得固態接種劑。
3.權利要求2所述的接種劑按堆肥總乾重的8%-10%應用於水葫蘆渣堆肥中。
全文摘要
本發明涉及蠟狀芽孢桿菌KMSR88及其接種劑和應用，屬環境微生物技術領域。本發明的內容包括蠟樣芽孢桿菌 (Bacillus cereus) KMSR88，其保藏編號為CGMCC No.6596。含有蠟樣芽孢桿菌KMSR88的接種劑經菌種活化、發酵種子液製備、及接種劑的製備步驟得到。接種劑按堆肥總乾重的8%-10%應用於水葫蘆渣堆肥中。本發明的優點在於蠟樣芽孢桿菌KMSR88能較好的分解纖維素，並能在廣譜性溫度生長；將其製成接種劑用於水葫蘆渣堆肥中，能促進纖維素的分解，快速起溫，迅速進入堆肥高溫階段(50℃以上)並維持較長的高溫(50-70℃)，促進水葫蘆渣脫水和高溫滅菌，加快水葫蘆渣的腐熟進程，提高堆肥的質量和發酵效率。具有重要的經濟價值和應用前景，適合大規模應用於大面積水域種植的水葫蘆渣堆肥中。
文檔編號C12N1/20GK102925396SQ20121047511
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者餘磊, 趙建榮, 張懿萱 申請人:昆明學院, 昆明神瑞農業投資有限公司