定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝的製作方法
2023-05-14 07:30:36
專利名稱：定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，尤其是涉及一種定向誘導合成金屬硫蛋白及分離純化工藝。
背景技術：
金屬硫蛋白是一種含有大量CM和Zn的蛋 白質,廣泛存在於生物體內。金屬硫蛋白相對分子質量600(Γ10000，富含胺基酸和半胱氨酸，並能大量結合金屬離子，具有很強的生物活性。大量研究結果表明，金屬硫蛋白有下列功能I、清除自由基，措抗電尚福射；2、參與微量元素的貯存、運輸和代謝；3、重金屬的解毒作用；4、參與激素和發育過程的調節，增強機體對各種應激反應；5、參與細胞DNA的複製和轉錄,蛋白質的合成與分解，以及能量代謝的調節過程。201110076199. 2公開了一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法。生產步驟為蟲草菌一液體培養一過濾一含金屬硫蛋白菌體一研磨一有機物變性一去雜蛋白一加熱變性一除變性蛋白一超濾濃縮一層析一冷凍乾燥成品。201110063616. X公開了嗜冷紅酵母中金屬硫蛋白的製備工藝,工藝過程為菌株篩選一培養一細胞破壁一凝膠過濾一離子層析一冷凍乾燥成品。200910308720. 3公開了從家蠅幼蟲中誘導並提取金屬硫蛋白的方法。該方法利用富含金屬離子生物誘導劑的培養基加入家蠅幼蟲培育出成蟲，再經漂洗、滅菌、均漿、膜過濾、分離、濃縮、冷凍乾燥成品。01128543. 5公開了液體塗層發酵轉基因工程菌生產人或動物金屬硫蛋白製品的方法。該方法是將轉基因工程菌通過深層發酵、培養工程菌、過濾、洗滌、冷凍乾燥成品。200910309136. X公開了一種富鋅黃粉蟲的飼養方法，該方法包括幼蟲養殖、富鋅養殖，大齡黃粉蟲用硫酸鋅水溶液飼餵得富鋅黃粉蟲。200910309135. 5公開了一種富硒黃粉蟲的飼養方法，該方法包括幼蟲養殖、富硒養殖，大齡黃粉蟲用亞硒酸鈉水飼喂，得富硒黃粉蟲。01131966. 6公開了金屬硫蛋白的製備方法，該方法選擇金屬硫蛋白工程菌，接種於培養液，收集菌體，超聲破碎，層析分離，梯度洗脫，收集目標蛋白。金屬硫蛋白是一種用途廣泛的金屬蛋白物，但是由於來源的局限性，科技人員一直在研究開發產生金屬硫蛋白的原料，產率和效率是一個長期關注的問題。
發明內容
針對現有金屬硫蛋白來源的局限性，本發明提供一種定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝。本發明的目的是通過以下技術方案實現的1、選擇合適的原材料配製培養基；2、培養基二次發酵複製；3、九龍蟲蟲卵培殖；4、九龍蟲蟲卵植入複製培養基中；5、超聲波振蕩培育；6、九龍蟲成蟲處理；7、微濾與超濾；8、超聲駐波液相製備色譜分離純化；9、冷凍乾燥至成品；具體步驟如下
(O選擇合適的原材料配製培養基，所述培養基由IOOOg麥麩或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g 賴氨酸、0 20g 甘氨酸、l(T80g 胱氨酸、l(T20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、0 10gCaS04、OlOgZnSO4 混合而成；
(2)上述培養基噴淋去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，使培養基充分發酵；
(3)將九龍蟲雄蟲與雌蟲按23比例混合，保持溫度25 30°C，溼度60 85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置於前述的發酵培養基中，保持溫度2(T30°C、溼度6(Γ85%培養，待幼蟲第一次脫皮後超聲波振蕩培育；
(5)待幼蟲脫皮6次後的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，用去離子水清洗，甩幹九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩幹的九龍蟲幼蟲搗碎，加熱8(Γ100 ，時間5 10min，離心分離，收集分離液；
(7)分離液進行微濾與超濾處理，收集濃縮液；
(8)100mL濃縮液溶於100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相製備色譜裡連續分尚純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白冷凍乾燥至成品。本發明根據金屬硫蛋白化學成份與結構特徵，選擇並配製合適的培養基；以九龍蟲蟲卵作為生物合成的載體，隨著九龍蟲生長過程，採用化學成分，超聲波定向催化使得九龍蟲機體大量合成金屬硫蛋白，該金屬硫蛋白為白色或微黃色凍幹品，相對分子量6800Da,分子直徑50A，等電點為4，含量為90-99%。本發明不僅為金屬硫蛋白生產提供了一種新的工藝，而且由於分離過程的特殊性，確保了金屬硫蛋白的生物活性，具有工業化生產的價值。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明的技術方案作進一步描述。實施例I :
(1)取IOOOg麥麩，100 200g大豆豆粉，10 20g賴氨酸，50 80g胱氨酸，10 15gCuS04，5 IOgNaCl,及l(T20gCdS04，5 IOg CaSO4混合均勻成為培養基；
(2)上述培養基噴淋50(Tl000mL去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，培養基充分發酵；
(3)選羽化後1(Γ20天的九龍蟲，將雄蟲與雌蟲按2:3比例混合，保持溫度25 30°C，溼度6(Γ85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置前述的發酵培養基中，保持溫度2(T30°C、溼度6(Γ85%培養，待幼蟲第一次脫皮後，用超聲波發生器在頻率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超聲處理2 lOmin，每間隔8 IOh重複超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d ；
(5)待幼蟲脫皮6次後的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，IOOOg九龍蟲幼蟲用2L 10L去離子水清洗3次，甩幹九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩幹的九龍蟲幼蟲放入組織搗碎勻漿機中以1000(Tl5000r/min搗碎，加熱8(Tl00°C，時間5 lOmin，離心機75(Tl250r/min分離，收集分離液；
(7)分離液用膜孔徑O.5^1. O μ m微孔膜過濾機過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機濃縮，收集濃縮液；
(8)IOOmL濃縮液溶於由質量比4. 5%PEG6000-質量比8. 0%葡萄糖T600組成的100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相製備色譜裡，以超聲頻率50(Tl000kHz、功率O. I"!. 5kw、流速2(Tl00ml/min、紫外檢測器波長220nm連續分離純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍乾燥機在真空度l(T50kpa、溫度-3(T50°C、時間15 24h乾燥含水份5 6%為成品，金屬硫蛋白含量為96. 5%。實施例2(1)取IOOOg 米糠，5(Tl00g 大豆蛋白粉，l(T20g 甘氨酸，l(T20g 胱氨酸，l(T20gCuS04，l(T20gNaCl，l(T20gZnS04充分混合成為培養基；
(2)上述培養基噴淋50(Tl000mL去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，培養基充分發酵；
(3)選羽化後1(Γ20天的九龍蟲，將雄蟲與雌蟲按2:3比例混合，保持溫度25 30°C，溼度6(Γ85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲；
(4)將5 8g幼蟲置前述的發酵培養基中，保持溫度2(T30°C、溼度6(Γ85%培養，待幼蟲第一次脫皮後，用超聲波發生器在頻率25(T500kHz、功率O. Γ0. 5kw超聲處理2 lOmin，每間隔8 IOh重複超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d ；
(5)待幼蟲脫皮6次後的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，IOOOg九龍蟲幼蟲用2L 10L去離子水清洗3次，甩幹九龍蟲幼蟲表面水分；
(6)甩幹的九龍蟲幼蟲放入組織搗碎勻漿機中以1000(Tl5000r/min搗碎，加熱8(Tl00°C，時間5 lOmin，離心機75(Tl250r/min分離，收集分離液；
(7)分離液用膜孔徑O.5^1. O μ m微孔膜過濾機過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機濃縮，收集濃縮液；
(8)IOOmL濃縮液溶於100(T2000mL由亞丁醇-乙醚-水按照10 5 12體積比組成的溶劑體系中，注入超聲駐波液相製備色譜中，超聲頻率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min,紫外檢測器波長220nm,連續分離純化金屬硫蛋白；
(9)將分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍乾燥機在真空度l(T50kPa、溫度-3(T50°C、時間15 24h乾燥含水份5 6%為成品，金屬硫蛋白含量為97. 1%。
權利要求
1.定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述工藝如下 (O選擇合適的原材料配製培養基； (2)上述培養基噴淋去離子水，保持溫度25 45°C，時間48 120h，使培養基充分發酵； (3)將九龍蟲雄蟲與雌蟲按23比例混合，保持溫度25 30°C，溼度60 85%，雄蟲與雌蟲交配5 7天產卵，蟲卵在8 12天孵化出幼蟲，收集幼蟲； (4)將5 8g幼蟲置於前述的發酵培養基中，保持溫度2(T30°C、溼度6(Γ85%培養，待幼蟲第一次脫皮後超聲波振蕩培育； (5)待幼蟲脫皮6次後的第4飛天，收集九龍蟲幼蟲，用去離子水清洗，甩幹九龍蟲幼蟲表面水分； (6)甩幹的九龍蟲幼蟲搗碎，加熱8(Γ100 ，時間5 10min，離心分離，收集分離液； (7)分離液進行微濾與超濾處理，收集濃縮液； (8)100mL濃縮液溶於100(T2000mL溶劑體系中，泵入超聲駐波液相製備色譜裡連續分尚純化金屬硫蛋白； (9)將分離純化的金屬硫蛋白冷凍乾燥至成品。
2.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(I)中，培養基由IOOOg麥麩或米糠、5(T200g大豆豆粉、0 20g賴氨酸、0 20g甘氨酸、l(T80g胱氨酸、10 20gCuS04、5 20gNaCl、(T20gCdS04、(Tl0gCaS04、(r20gZnS04 混合而成。
3.根據權利要求2所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述培養基由IOOOg 麥麩、10(T200g 大豆豆粉、l(T20g 賴氨酸、50 80g 胱氨酸、l(Tl5gCuS04、5 lOgNaCl、10 20gCdS04、5 IOg CaSO4 混合而成。
4.根據權利要求2所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述培養基由IOOOg米糠、50 100g大豆蛋白粉、10 20g甘氨酸、10 20g胱氨酸、10 20gCuS04、l(T20gNaCl、l(T20gZnS04 混合而成。
5.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(4)中，每間隔8 10h重複超聲處理一次，幼蟲培育周期5(T80d，超聲波振蕩頻率為250 500kHz，功率為 O. Γθ. 5kw，時間為 2 lOmin。
6.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(7)中，分離液用膜孔徑O. 5^1. O μ m微孔膜過濾機過濾，再用膜孔徑l(Tl20nm超濾機濃縮。
7.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(8)中，溶劑體系由質量比4. 5%PEG6000-質量比8. 0%葡萄糖T600組成。
8.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(8)中，溶劑體系由亞丁醇-乙醚-水按照10 5 12體積比組成。
9.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(8)中，超聲頻率50(Tl000kHz，功率O. Γ1. 5kw，流速2(Tl00ml/min，紫外檢測器波長220nm。
10.根據權利要求I所述的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，其特徵在於所述步驟(9)中，分離純化的金屬硫蛋白用真空冷凍乾燥機在真空度l(T50kPa、溫度-3(T50°C、時間15 24h乾燥含水份5 6%為成品。
全文摘要
定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝，屬於生物工程領域。針對現有金屬硫蛋白來源的局限性，本發明的定向誘導合成金屬硫蛋白的工藝是通過以下技術方案實現的1、選擇合適的原材料配製培養基；2、培養基二次發酵複製；3、九龍蟲蟲卵培殖；4、九龍蟲蟲卵植入複製培養基中；5、超聲波振蕩培育；6、九龍蟲成蟲處理；7、微濾與超濾；8、超聲駐波液相製備色譜分離純化；9、冷凍乾燥至成品。本發明不僅為金屬硫蛋白生產提供了一種新的工藝，而且由於分離過程的特殊性，確保了金屬硫蛋白的生物活性，具有工業化生產的價值。
文檔編號A01K67/033GK102786591SQ201210315550
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月31日 優先權日2012年8月31日
發明者徐華民, 徐萌, 趙豔琨, 趙榮華 申請人:哈爾濱工業大學