提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法

2023-05-15 02:10:51

專利名稱：提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因表達系統，具體涉及一種提高轉基因昆蟲細胞表達 外源基因水平的方法。
背景技術：
目前應用的昆蟲杆狀病毒表達系統主要有兩個，一個以苜蓿尺蠖夜蛾核型 多角體病毒為載體，以秋粘蟲細胞，菜青蟲細胞或昆蟲為宿主另一為以家蠶 核型多角體病毒為載體，以家蠶細胞或家蠶蟲體及蛹體為表達宿主。兩個表達 系統都以各自病毒載體的多角體蛋白基因或P10基因或極早期基因IE-1等強 啟動子為外源基因表達的調控元件，通過將外源目的基因置於強啟動子控制之 下的重組病毒感染宿主細胞，有重組杆狀病毒在宿主和細胞體內進行大量復 制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的轉錄產物大量積累，在較短時間內得 到髙效表達。與上述昆蟲杆狀病毒表達載體系統相比，利用轉化細胞表達外源基因有其 自身的優勢(1) 翻譯後加工完善，天然活性髙且穩定，可持續傳代，生產效率髙；(2) 通過轉化細胞表達，整個過程中不涉及杆狀病毒，生物安全性相對提髙， 並且，外源基因整合進細胞基因組，不會出現因病毒感染而影響細胞功能的現 象，因此，表達產物能夠得到更為有效的加工，如果藉助無血清昆蟲細胞培養 技術和分泌表達技術，表達產物將非常容易純化。通常情況下，通過抗生素壓力篩選可以獲得穩定表達外源基因的轉化細 胞。運用G418篩選哺乳動物轉化細胞已有較多的報導，但通過穩定轉化的昆 蟲細胞表達外源基因的報導並不多見。Jarvis等用攜帶neo標記基因和ie-l(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的極早期基因)啟動子控制e -半乳糖苷酶基因表達盒的質粒轉染sf-9細胞，通過G418壓力篩選，獲得轉化sf-9細胞純系，傳 代50次(約6個月)後的細胞仍保留整合的質粒序列，傳代IOO次的細胞仍能表達同質的e-半乳糖苷酶，但表達水平較低，約為杆狀病毒表達載體系統(BEVS)的1% (J Cell Biochem， 1990,42:181-191)。最近，Invitrogeii公司開發了一種能在昆蟲sf細胞穩定表達外源基因的載 體pIZT/V5-His,該載體利用黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)核型多角體 病毒的ie-2啟動子控制外源基因，通過Zeochi的抗性標記篩選可獲得穩定表 達外源基因的細胞系。鑑於利用轉基因昆蟲細胞表達外源基因具有的優越性，因此，獨立研發提 高穩定轉化昆蟲細胞表達外源基因的水平的方法具有重要意義。發明內容本發明目的是提供一種提髙轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法。 為達到上述目的，本發明採用的技術方案是 一種提高轉基因昆蟲細胞表 達外源基因水平的方法，包括以下具體步驟(1) 構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子X控制外源基因的載體；(2) 構建帶有增強子元件en的基於piggyBAC轉座子的帶有報告基因的載 體pigA3-en;(3) 雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動子X控制外源基因的片段，克隆進 同樣雙酶切的pigA3-en,得帶有增強子en和啟動子X控制外源基因的載體；(4) 構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y控制新黴素抗性基因neo的重組 載體；(5) 酶切步驟(4)所得載體，回收啟動子Y控制新黴素抗性基因的片段 Y-Neo,克隆進同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動子X控制外源基因 表達盒、增強子元件、啟動子Y控制新黴素抗性基因和螢光蛋白報告基因的 重組轉基因載體(6) 將步驟(5)所得重組轉基因載體與表達轉座酶的輔助質粒混合，轉染昆蟲 細胞系，通過G418的分段篩選獲得轉基因昆蟲細胞，其中G418的終濃度為 800-2000fig/ml。上述技術方案中，昆蟲細胞內具有活性的啟動子X和Y選自杆狀病毒的 極早期基因(ie-1)啟動子、家蠶肌動蛋白(actin) A3啟動子、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)的CMV啟動子、昆蟲熱激蛋白(hsp)啟動子中的一種， 啟動子X和啟動子Y可以相同也可以不同；所述的增強子元件en選自家蠶絲 素蛋白輕鏈基因第1內含子序列一一fiben、杆狀病毒的同源區一一hr3en中的 一種報告基因可以為螢光蛋白基因；昆蟲細胞可以是家蠶細胞或者其他昆蟲 組織建立的細胞系。上述技術方案中所述輔助質粒的選擇為該技術領域中常規的技術，該領域 技術人員可以根據最後獲得的具體轉基因載體選擇相應的輔助質粒。優選的技術方案中，昆蟲細胞為家蠶細胞，啟動子為杆狀病毒的極早期基 因(ie-l)啟動子和家蠶肌動蛋白(actin) A3啟動子中的一種。上述技術方案中，轉座子piggyBAC因子又稱IFP2，是目前應用比較廣 泛的昆蟲轉座子，已被證實在多種昆蟲中可以發揮轉座作用，可以通過轉座而 將外源基因重組整合到昆蟲基因組中，但據研究所知，piggyBac介導的轉基 因家蠶細胞表達報告基因的水平較低(周文林等，蠶業科學，2007 ， 33(1):30-35),而且尚無用基於piggyBAC轉座子的轉基因載體提髙昆蟲轉基 因細胞表達外源基因的方法的報導。上述技術方案中，增強子(enhaiicer)指增加同它連鎖的基因轉錄頻率的 DNA序列。增強子是通過啟動子來增加轉錄的。有效的增強子可以位於基因 的5'端，也可位於基因的3'端，有的還可位於基因的內含子中。增強子的 效應很明顯， 一般能使基因轉錄頻率增加10 200倍，有的甚至可以髙達上千 倍。增強子的作用同增強子的取向無關，甚至遠離耙基因達幾千kb也仍有增 強作用。本發明的基本原理為構建帶有啟動子X控制外源基因表達盒、增強子 元件、啟動子Y控制新黴素抗性基因和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體 後，與表達轉座酶的輔助質粒混合，轉染昆蟲細胞系，通過G418的分段篩選， 由於G418對一般細胞有殺傷作用，而轉染的目的質粒上帶有NEO抗藥基因， 因此最後可以獲得將外源基因整合入系統的轉基因昆蟲細胞；同時，為了提髙 轉基因昆蟲細胞對外源基因的表達水平，在構建轉基因載體的過程中，克隆進 了增強子，並使用了 piggyBAC轉座子，而且G418也可以給轉染細胞壓力， 使外源基因不易在染色體複製的過程中丟失。為進一步提髙昆蟲轉基因細胞對外源基因的表達水平，可以採用進一步的 技術方案，將獲得的轉基因細胞通過細胞克隆技術結合外源基因表達水平的實 際檢測，獲得外源基因高水平表達的工程細胞。本發明可以採用分泌表達並結合昆蟲細胞無血清發酵培養技術，製備表達 產物工藝簡單，成本低。由於上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點1. 由於採用轉基因昆蟲細胞表達外源基因，而沒有採用昆蟲杆狀病毒表 達載體系統，因而可以實現外源基因的持續表達；表達產物無杆狀病毒汙染、 生物安全性髙；表達產物後加工完善、天然性好。2. 本發明在轉入外源基因時增加了可用於壓力篩選的抗性基因，不僅提 高轉基因細胞篩選效率，同時G418也可以給轉染細胞壓力，使外源基因不易 在染色體複製的過程中丟失。3. 本發明的技術方案、原理不同於 Jarvis ( J Cell Biochem， 1990,42:181-191)的技術原理，也不同於Invitrogen公司開發的一種能在昆蟲 sf細胞穩定表達外源基因載體pIZT/V5-His的技術原理，並將增強子元件引入 載體，使用了 piggyBAC轉座子，並通過細胞克隆技術，結合外源基因表達水 平的實際檢測，篩選得到外源基因髙水平表達的工程細胞。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步描述實施例一一種提高轉基因家蠶細胞表達人胰島素樣生長因子-I方法(A3 啟動子控制下的IGF-I 、絲蛋白輕鏈基因第1內含子fiben、 IE-1啟動子控制 的neo)，具體包括以下步驟1.人胰島素樣生長因子-I基因的製備根據業已公開的人胰島素樣生長因子-I基因的cDNA序列(GenBank登 錄號M11568)，按常規人工合成人胰島素樣生長因子-I活性肽對應的DNA 序列TGGATATCACCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcagttc gtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaa gcctgccaagtcagctTAAGCTTCTCGAGAT為了便於克隆表達和提高表達水平，在5'端引入起始密碼子ATG和 EcoRV的酶切位點，3'端引入終止密碼子TAA和Xho I的酶切位點。2. 構建帶有cDNA基因的pBluescriptII SK(+)重組質粒 將人工合成的DNA序列用EcoRV和Xho I雙酶切，常規法回收酶切片段，與用EcoRV和Xho I雙酶切的pBluescriptlISK(+)質粒(Stratagene公 司產品)連接。T4DNA連接酶為GIBCO BRL公司產品，連接條件為16'C, 12小時。連接產物轉化大腸桿菌TG1菌株，通過藍白斑培養篩選獲得重組轉化子， 小批量提取質粒DNA (參見《分子克隆》，1989，科學出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鑑定，有一條約230bp的片段被克隆，經測序證明已成功克隆了 IGF-I基因，所獲得的重組質粒稱之為pSK-IGF。3. A3啟動子控制IGF-I基因的構建根據 pigA3GFP(參見Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，設計特異性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg)和A3-2(ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c), 以pigA3GFP為模板，常規PCR擴 增出A3啟動子(約210 bp),經EcoR I 、 EcoRV雙酶切後克隆進同樣雙酶 的pSK-IGF載體，獲重組pSK-A3-IGF載體。根據GenBank已公開的序列(GenBank登錄號M76430)設計特異性引 物TPFib隱L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt "g cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta cce act gtc caa tec acc gtc)，以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴增出約 290 bp的片段，測序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號序列，該片段經Xho I 和Kpnl雙酶切後，與同樣酶切的pSK-A3-IGF載體連接，獲得重組載體 pSK-A3-IGF-polyA。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強子元件的基於piggyBAC轉座子的轉基因載體構建根據已公開的絲蛋白輕鏈基因的序列(GenBank登錄號M76430)設計物 異性弓l物TPFib-L-5 (cgg ata tct atg ggc tcc agt aac c)和TPFib-L-6 (gcg tcg acg gtc agg tta gat taa cgg g),以家蠶基因組DNA為模板，常規PCR擴增， 獲得絲素輕鏈基因第l內含子中具有增強子功能的約400bp左右的序列，Sal I 和EcoRV雙酶切後，克隆進經Sal I和Sma I雙酶切的PigA3GFP質粒，獲 帶有增強子元件的基於piggyBAC轉座子的轉基因載體，命名為pigA3-fiben。5. 帶有增強子元件和A3啟動子控制IGF- I外源基因的轉基因載體的構建pSK-A3-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I雙酶切，回收A3控制IGF- I基 因的片段，克隆進EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-fiben載體，獲得的新載 體命名為pigA3-A3-IGF-fiben6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新黴素抗性基因 neo的重組載體以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，用IE-1基因啟動子的特異性引物 對(5'ttc gaa ttc gat ttg cag "c ggg ac3', 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3') 進行PCR擴增，PCR產物用EcoRl 、 EcoRV雙酶切後，克隆在 pBluescriptnSK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子的載 體pSK隱IE。以pcDNA3.1載體(Invitrogen公司產品)為模板，以Neol (5'ctg ata tea tga "g aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c30為 引物，PCR擴增出neo基因的編碼序列及其下遊的polyA信號序列(約1,1 kb), 經EcoRV、 Xho I酶切消化後，克隆進經過同樣處理的pSK-IE載體中，獲得 pSK-IE-Neo載體。7. 構建帶有A3控制IGF- I表達盒、增強子元件、新黴素抗性基因(neo) 和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動子控制新黴素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-A3-IGF-fiben質粒，獲的重質粒 命名為pigA3-A3-IGF-fiben-neo。8. 轉基因細胞的篩選採用常規脂質體介導法進行細胞轉染。分別取二個eppendorf管，A管加 入重組質粒pigA3-A3-IGF-fiben-neo 2fig,輔助質粒helper 4pg(參見Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-deHved vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培養基(FBSFree)將總體積補至50^L,混勻 備用。B管加入脂質體轉染試劑(Lipofection) 10 ^L，以TC-100培養基(FBS Free)將總體積補至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min後轉染Bm-N 細胞。轉染第4天，添加G418至終濃度1000Hg/mL,篩選培養l個月後，添 加G418至終濃度1，500ng/mL,繼續篩選2個月，獲轉IGF-I基因的細胞。9.克隆髙水平表達IGF- I的轉基因細胞方法獲得的轉IGF- I基因細胞系通過極度稀釋分注到96孔板，倒置螢光顯微 鏡觀察尋找僅有一個螢光細胞的孔，注入正常的Bm-N細胞培養1周，添加 G418至終濃度lOOOjig/mL,篩選培養1個月後，添加G418至終濃度 1，500jig/mL,繼續篩選2個月，獲得克隆細胞株，對克隆細胞株進行ELISA 檢測，篩選出髙水平(4pg/mL)表達IGF-I的克隆細胞，即工程細胞。實施例二 一種提髙轉基因草地夜蛾Sf細胞表達人粒細胞-巨噬細胞集落 刺激因子的方法(A3啟動子控制下的hGM-CSF、絲蛋白輕鏈第1內含子fiben、 IE-l控制的neo),具體步驟包括1. 人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的製備人的T-淋巴樣細胞系細胞100 mg,加液氮磨碎，加入GIBCOBRL公司 生產Trozol RNA提取液lmL,輕輕搖動10分鐘後加入500 U L氯仿，在室溫 下放置10分鐘，12 OOOrpm離心10分鐘，取上清，加入2倍上清體積的100% 冷乙醇，混勻後，12 OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入反轉錄酶及4dNTPs 進行反轉錄，37'C, l小時，獲得由mRNA反轉錄合成的cDNA。將獲得的 cDNA , 加入 hGM-CSF 基因的上遊引物 (tggatatcACCATGGGCatgtggctgcagagcctgc ， atctcgagaagcttatcactcctggac tggctccc，)進行PCR擴增，獲得長度約為450 bp的hGM-CSF的cDNA片段。2. 構建帶有hGM-CSF基因的pBluescriptn SK(+)重組質粒獲得的hGM-CSF的cDNA片段用EcoRV和Xho I雙酶切，常規法回收 酶切片段，與用 EcoRV和 Xho I雙酶切的 pBluescriptll SK(+)質粒 (Stratagene公司產品)連接。T4 DNA連接酶為GIBCO BRL公司產品，連 接條件為16'C, 12小時。連接產物轉化大腸桿菌TGI菌株，通過藍白斑培養篩選獲得重組轉化子， 小批量提取質粒DNA (參見《分子克隆》，1989,科學出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鑑定，有一條約450bp的片段被克隆，經測序證明已成功克隆了 hGM-CSF基因，所獲得的重組質粒稱之為pSK-hGM-CSF。3. A3啟動子控制hGM-CSF基因的構建根據 pigA3GFP(參見Cary, L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，設計特異性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg， ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP為模板，常規PCR擴增出 A3啟動子(約210 bp),經EcoRl 、 EcoRV雙酶切後克隆進同樣雙酶切的 pSK-hGM-CSF載體，獲重組pSK-A3-hGM-CSF載體。根據GenBank已公開的序列(GenBank登錄號M76430)設計特異性引 物TPFib-L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta ccc act gtc caa tec acc gtc)，以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴增出約 290 bp的片段，測序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號序列，該片段經Xho I 和KpnI雙酶切後，與同樣酶切的pSK-A3-hGM-CSF載體連接，獲得重組載 體pSK國A3-hGM-CSF-polyA。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強子元件fibeii的基於piggyBAC轉座子的轉基因 載體構建同實施例一中步驟4。5. 帶有增強子元件fiben和A3啟動子控制hGM-CSF外源基因的轉基因 載體的構建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆進EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-fiben載體，獲得的新載體命名為pigA3-A3-hGM-CSF-fiben。6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新黴素抗性基因 neo的重組載體同實施例一中步驟6。7. 構建帶有A3控制hGM-CSF表達盒、增強子元件、新黴素抗性基因(neo) 和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動子控制新黴素抗性基 因的片段IE-Neo，克隆進同樣酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-fiben質粒，獲的 重質粒命名為pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo。8. 轉基因細胞的篩選採用常規脂質體介導法進行細胞轉染。分別取二個eppendorf管，A管加 入重組質粒pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo 2pg，輔助質粒helper 4pg (參見 Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培養基(FBSFree)將總體積補至50 |iiL,混勻 備用。B管加入脂質體轉染試劑(Lipofection) 10 pL,以TC-100培養基(FBS Free)將總體積補至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min後轉染草地 夜蛾Sf細胞。轉染第4天，添加G418至終濃度lOOOpg/mL,篩選培養1個 月後，添加G418至終濃度1，500ng/mL,繼續篩選2個月，獲轉hGM-CSF基 因的細胞。9. 克隆髙水平表達hGM-CSF的轉基因細胞獲得的轉hGM-CSF基因細胞通過極度稀釋分注到96孔板，倒置螢光顯 微鏡觀察尋找僅有一個螢光細胞的孔，注入正常的sf細胞培養1周，添加G418 至終濃度lOOO^ig/mL,篩選培養l個月後，添加G418至終濃度l，500ng/mL， 繼續篩選2個月，獲得克隆細胞株，對克隆細胞株進行ELISA檢測，篩選出 髙水平(5pg/mL)表達hGM-CSF的克隆細胞，即工程細胞。實施例三 一種提高轉基因家蠶細胞表達hGM-CSF的方法(A3啟動子 控制下的hGM-CSF、 hr3的en、 IE-1控制的neo),具體包括下列步驟1. 人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子基因的製備 同實施實例二中步驟1。2. 構建帶有hGM-CSF基因的pBluescriptII SK(+)重組質粒 同實施實例二中步驟2。3. A3啟動子控制hGM-CSF基因的構建 同實施實例二中步驟3。4. 帶有hr3增強子元件的基於piggyBAC轉座子的轉基因載體構建 根據GenBank登錄號L33180的公開序列設計引物，以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的基因組DNA為模板，以TPhr3-l(ctg gta ccg ccg tgc cca gtc acg tgt acg cc)和TPhr3隱2 (etc ccg ggg tga aca gcc cat tcg agg c) 為弓l物， 常規PCR擴增，獲得家蠶核多角體病毒(BmNPV)同源區序列(homologous region)的hr3中具有增強子功能的約740 bp左右的序列，Kpn I和Sma I雙 酶切後，克隆進經Kpn I和Sma I雙酶切的PigA3GFP質粒，獲帶有hr3增 強子元件的基於PiggyBAC轉座子的轉基因載體，命名為pigA3-hr3en。5. 帶有增強子元件hr3和A3啟動子控制hGM-CSF外源基因的轉基因載 體的構建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆進EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-hr3en載體， 獲得的新載體命名為pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新黴素抗性基因 neo的重組載體同實施例一中步驟6。7. 構建帶有A3控制hGM-CSF表達盒、增強子元件、新黴素抗性基因(neo) 和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有IE啟動子控制新黴素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en質粒，獲的 重質粒命名為pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo。8. 轉基因細胞的篩選同實施實例二中步驟8，所不同的是pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo被pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo所取代，細胞使用家蠶Bm-N細胞。 9.克隆髙水平表達hGM-CSF的轉基因家蠶細胞方法同實施實例二中步驟9。不同的是通過極度稀釋和ELISA實際檢測 獲得髙水平(5jig/mL)表達hGM-CSF的轉基因家蠶細胞。實施例四 一種提高轉基因家蠶細胞表達IGF- I的方法(IE啟動子控制 下的IGF-I、 hr3增強子、IE-l控制的neo),具體包括以下步驟1. 人胰島素樣生長因子-I基因的製備 同實施例一中步驟1。2. 構建帶有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重組質粒 同實施例一中步驟2。3. IE啟動子控制IGF-I基因的構建根據GenBank登錄號L33180的公開序列，以家蠶核型多角體病毒的DNA 為模板，用IE-1基因啟動子的特異性引物(5'ttc gaa ttc gat ttg cag ttc ggg ac3'， 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3')進行PCR擴增，PCR產物用 EcoRl、 EcoRV雙酶切後，克隆進同樣雙酶的pSK-IGF載體，獲重組 pSK-IE-IGF載體。根據GenBank登錄號M76430的公開序列，設計特異性引物TPFib-L-3 (ggc tcg agc aaa "g tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 ( gcg gta ccc act gtc caa tec accgtc),以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴增出約290 bp的片段， 測序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號序列，該片段經Xho I和Kpn I雙酶 切後，與同樣酶切的pSK-IE-IGF載體連接，獲得重組載體pSK-IE-IGF-polyA。4. 帶有hr3增強子元件的基於piggyBAC轉座子的轉基因載體構建 同實施例三中步驟4。5. 帶有增強子元件和IE啟動子控制IGF- I外源基因的轉基因載體的構建pSK-IE-IGF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收IE啟動子控制 IGF-I基因的片段，克隆進EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-hr3en載體，獲 得的新載體命名為pigA3-IE-IGF-hr3en6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動子控制新黴素抗性基因 neo的重組載體同實施例一中步驟6。7. 構建帶有IE控制IGF- I表達盒、增強子元件、新黴素抗性基因(neo) 和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有IE啟動子控制新黴素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-IE-IGF-hr3en質粒，獲的重質粒 命名為pigA3-IE-IGF-hr3en-neo。8. 轉基因細胞的篩選同實施例一中步驟8。所不同的是這裡使用了 pigA3-IE-IGF-hr3en-neo 替代pigA3-A3-IGF-fiben-neo。9. 克隆高水平表達IGF的轉基因細胞方法 同實施例一中步驟9。實施例五 一種提髙轉基因家蠶細胞表達IGF- I的方法(A3啟動子控制 下的IGF- I 、絲蛋白輕鏈第1內含子fiben、 A3控制的neo)，具體包括下列 步驟1. 人胰島素樣生長因子-I基因的製備 同實施例一中步驟1。2. 構建帶有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重組質粒 同實施例一中步驟2。3. A3啟動子控制IGF-I基因的構建 同實施例一中步驟3。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強子元件的基於piggyBAC轉座子的轉基因載體構建同實施例一中步驟4。5. 帶有增強子元件和A3啟動子控制IGF- I外源基因的轉基因載體的構建同實施例一中步驟5。6. 構建帶有家蠶核型多角體病毒A3啟動子控制新黴素抗性基因iieo的 重組載體根據 pigA3GFP(參見Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989, 172:156-69)的 序列，設計特異性引物A3-l "ag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg, ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP為模板，常規PCR擴增出 A3啟動子(約210 bp),經EcoRl 、 EcoRV雙酶切後克隆進同樣雙酶切的 pBhiescriptllSK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒A3啟動子的載體 pSK-A3。以pcDNA3.1載體(Invitrogen公司產品)為模板，以Neol (5'ctg ata tea tga ttg aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c3')為 引物，PCR擴增出neo基因的編碼序列及其下遊的polyA信號序列(約1.1 kb)， 經EcoRV、 Xho I酶切消化後，克隆進經過同樣處理的pSK-A3載體中，獲 得pSK-A3-Neo載體。7. 構建帶有A3控制IGF- I表達盒、增強子元件、新黴素抗性基因(neo) 和螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體pSK-A3-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有A3啟動子控制新黴素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進同樣酶切的pigA3-A3-IGF-fiben質粒，獲的重質粒 命名為pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo。8. 轉基因細胞的篩選釆用常規脂質體介導法進行細胞轉染。分別取二個eppendorf管，A管加 入重組質粒pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo 2pg，輔助質粒helper 4pg (參見 Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori Lu using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84)，以TC-100培養基(FBSFree)將總體積補至50nL，混勻 備用。B管加入脂質體轉染試劑(Lipofection) 10 jiL，以TC-100培養基(FBS Free)將總體積補至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min後轉染Bm-N 細胞。轉染第4天，添加G418至終濃度1000jig/mL，篩選培養l個月後，添加G418至終濃度1，500ftg/mL,繼續篩選2個月，獲轉IGF-I細胞系。 9.克隆髙水平表達IGF-1的轉基因細胞方法 方法同實施實例一中步驟9。
權利要求
1. 一種提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法，包括以下具體步驟(1)構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子X控制外源基因的載體；(2)構建帶有增強子元件en的基於piggyBAC轉座子的帶有報告基因的載體pigA3-en；(3)雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動子X控制外源基因的片段，克隆進同樣雙酶切的pigA3-en，得帶有增強子en和啟動子X控制外源基因的載體；(4)構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y控制新黴素抗性基因neo的重組載體；(5)酶切步驟(4)所得載體，回收啟動子Y控制新黴素抗性基因的片段Y-Neo，克隆進同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動子X控制外源基因表達盒、增強子元件、啟動子Y控制新黴素抗性基因、螢光蛋白報告基因的重組轉基因載體；(6)將步驟(5)所得重組轉基因載體與表達轉座酶的輔助質粒混合，轉染昆蟲細胞系，通過G418的分段篩選獲得轉基因昆蟲細胞。
2. 根據權利要求1所述的一種提髙轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的 方法，其特徵在於所述昆蟲細胞為家蠶細胞。
3. 根據權利要求1所述的一種提髙轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的 方法，其特徵在於所述增強子元件選自家蠶絲素蛋白輕鏈基因第1內含子序 列或杆狀病毒的同源區中的一種。
4. 根據權利要求1所述的一種提髙轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的 方法，其特徵在於所述昆蟲細胞內具有活性的啟動子選自杆狀病毒的極早期 基因IE-1啟動子，也可以為家蠶肌動蛋白A3啟動子、巨細胞病毒的CMV啟 動子、昆蟲熱激蛋白啟動子中的一種。
5. 根據權利要求1所述的一種提髙轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的 方法，其特徵在於將步驟(6)所得的轉基因昆蟲細胞通過細胞克隆技術，結合 外源基因表達水平的實際檢測，獲得表達外源基因的工程細胞。
全文摘要
本發明公開了一種提高昆蟲轉基因細胞表達外源基因的方法，將在昆蟲細胞內具有活性的啟動子控制的新黴素抗性基因表達盒、增強子元件和外源基因表達盒通過基因操作克隆進以轉座子piggyBAC因子為基礎的帶有報告基因的載體，然後與表達轉座酶的輔助質粒混合轉染昆蟲細胞系，通過G418的分段篩選獲得轉基因昆蟲細胞。該轉基因細胞通過細胞克隆技術，結合外源基因表達水平的實際檢測獲得外源基因高水平表達的工程細胞。本發明方法實現了轉基因昆蟲細胞高水平持續表達外源基因，表達產物無杆狀病毒汙染，生物安全性高，後加工完善，天然性好。
文檔編號C12N5/10GK101270366SQ200810025299
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者周文林, 曹廣力, 沈衛德, 薛仁宇, 貢成良 申請人:蘇州大學