一種異源藍舌病毒雙鏈rna內源性幹擾素誘導劑的製備方法

2023-05-15 01:46:06

專利名稱：一種異源藍舌病毒雙鏈rna內源性幹擾素誘導劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥技術領域，具體涉及一種異源藍舌病毒雙鏈RNA內源性幹擾素誘導劑的製備方法，該誘導劑可直接用於人體，誘導人體產生各種內源性幹擾素(ENIs)， 賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強體質的功能。
背景技術：
由於具有廣泛的疾病防治功能的幹擾素(Interferon，IFN)(董長垣主編，《現代分子病毒學》，武漢大學出版社，1996年10月)是人類至今所發現的最好的一類細胞因子； 也由於內源性幹擾素(Endodnterferon，ENI)較外源性幹擾素(Exo-Interferon，EXI)有無可比擬的優點，以及人類至今尚未獲得理想的內源性幹擾素誘導劑(Endo-hterferon Inducer, EnII)等原因，人類一直在追求安全而有效的醫用ΕηΙΙ。一、幹擾素及其分類IFNs是由幹擾素誘導劑誘導多種細胞產生的一組多功能的可溶性糖蛋白，通過與細胞受體結合，至少可轉錄活化300多種IFN刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs), 發揮多種生物學活性。IFN不僅具有抗腫瘤和抗病毒作用，而且具有增強體質的調理作用；既能治療疾病，又能預防疾病；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如 SARS-CoV、禽流感病毒)。國際IFN命名委員會規定，先根據IFN的動物來源進行初分類；再根據IFN的抗原特性和分子結構的差異分成不同的型；在特定的型內，按胺基酸序列或組成差異又可分為若干亞型。於是，根據胺基酸序列和受體的不同，IFN被分為I、II和III三種類型(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4-6) I型IFN包括a、3、r和ω亞型，主要參與抗病毒、抗腫瘤；II型IFN只有IFN-γ，主要參與誘導MHC類抗原的表達和免疫調節效應，其抗病毒作用比 I 型 IFN 弱；III 型 IFN 又稱為 IFN-λ，包括 IFN-λ 1、IFN-λ 2 禾口 IFN-λ 3，或 IL-29、 IL-28a和IL-28b等，在抗病毒、抗增殖及體外抗腫瘤等方面發揮近似於而又不同於I型幹擾素的作用。IFN-α、IFN-β、IFN-γ均有抗病毒作用。但是，IFN-γ抗病毒活性遠較I 型IFN低；IFN-α和IFN-β能相互加強抗病毒作用。IFN抗病毒具有廣譜性，但它對細胞的抗病毒作用是間接的，而且是非特異性(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction,signalling,antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4_6)。根據來源，IFNs可分為內源性幹擾素(Endo-Interferon，ENI)和外源性幹擾素 (EXI)。EXI就是在體外應用外源性幹擾素誘導劑(Exo-Interferon Inducer, ExII)刺激離體培養細胞所生產的或基因工程合成的，而後用於機體的IFNs ；ENI則是用內源性幹擾素誘導劑(EnII)於體內，直接誘導機體產生的IFNs。
近年來，有關誘導IFN產生機理的研究，IFN抗病毒、抗腫瘤和調理機體功能的藥理和生理作用的研究取得了令人滿意的結果，顯示了其符合機體自然防禦功能的特性，理所當然地為抗病毒和抗腫瘤治療開闢了新途徑。二、幹擾素的產生與幹擾素誘導劑細胞基因組密碼著IFN基因。由於IFN基因抑制物(IFN suppressor)與IFN基因結合，所以，在一般情況下，IFN基因處於抑制狀態。能誘導IFN產生的物質統稱為幹擾素誘導劑(Interferon inducer)。當幹擾素誘導劑作用於細胞膜，便會解脫IFN基因抑制物與IFN基因的結合，IFN操縱子開始轉錄，合成mRNA，mRNA迅速轉移至胞漿，在核糖體上轉譯出IFN前體，切除信號肽後，成熟的IFN分泌到細胞外。研究表明，病毒感染細胞後，經相同機制可同時誘生III型和I型幹擾素，但兩者表達量不同(Osterlund P, Veckman V, Siren J, et al. Gene expression and antiviral activity of alpha/bela intederons and interleukin-29 in virus-infected human myeloid dendritic cells. J Virol,2005,79 [15] :9608-9617, Contoli M, Message SD, Laza-Stanca V, et al. Role of deficient typeIII interferon-lambda production in asthma exacerbations. Nat Med,2006,12[9] :1023-1026, Khaitov MR, Laza-Stanca V, Edwards MR, et al. Respiratory virus induction of alpha-, beta一and lambda一interferons in bronchial epithelial cells and peripheral blood mononuclear cells. Allergy, 2009,64[3] :375-386)，表達的組織也不同，例如，IFN-λ 應答主要產生於上皮細胞，尤其是在肺、皮膚和腸道，而幾乎所有類型的細胞均能產生I型幹擾素(Sommereyns C, Paul S, Staeheli P, et al. IFN-Iambda(IFN-Iambda) is expressed in a tissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo. PLoS Pathog，2008，4[3] :el000017)。在某些條件下，IFN-λ和I型幹擾素並不同時表達(Doyle SE, Schreckhise H, Khuu-Duong K, et al. Interleukin-29 uses a type I interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes. Hepatology,2006,44[4] :896-906)。幾乎所有的脊椎動物(包括人)細胞都可產生IFN， 但無論在體內還是體外，必須由IFN誘導劑誘導產生。按照幹擾素誘導劑的本質，可將其分為病毒IFN誘導劑、雙鏈RNA IFN誘導劑、 代謝物IFN誘導劑和一些病原菌IFN誘導劑等。RNA病毒具有良好的IFN誘導作用，如新城疫病毒(NDV)、豬冠狀病毒(TGEV)、豬水泡病病毒(SVDV)、豬口蹄疫病毒(FMDV)、雞傳染性氣管炎病毒(BV)等。一些DNA病毒也有誘導IFN產生的能力，例如雞馬立克氏皰疹病毒 (MDHV)，但其誘導IFN產生的能力較RNA病毒低。除病毒外，衣原體、立克次體、細胞內毒素、 真菌提取物等也能誘導IFN產生。儘管如此，病原體是不能用作幹擾素誘導劑的。目前主要是滅活的新城疫病毒(NDV)用作外源性幹擾素誘導劑(EXI)。三、內源性幹擾素的優點和內源性幹擾素誘導劑EXI存在諸多缺點，如所用INF的種類單一，所以，相對於ENI，其藥物和生理功能較差；INF屬蛋白質多肽類，所以，EXI用於人體為異源抗原蛋白，發揮具有免疫原性，會引起機體異源反應和依賴性，同樣具有較大的毒副作用；而且其製備複雜、價格昂貴，保存和運輸麻煩，所以，限制了 EXI的大量生產和普及應用。ENI則是用內源性幹擾素誘導劑(EnII)於體內，直接誘導機體產生的IFNs。在這種情況下，機體變成了生產幹擾素的複合工廠，以生產各型幹擾素，發揮抗腫瘤、抗感染和調理作用。ENI是由機體自身產生的天然的複合型幹擾素，即白細胞幹擾素、纖維母細胞型幹擾素和免疫型幹擾素等，由多種不同類型的細胞誘導生成(Sang-Myeong L，Susan KS, Steven B. Kleiboeker Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes Veterinary Veterinary. Immunology and Immunopathology，2004，102，217-231)。所以，用 EnII 在人體內直接誘導產生的·Ι能克服EXI的諸多不足，如誘生的IFN種類齊全、體內濃度高、沒有異源蛋白質的免疫原性(即過敏反應和排斥反應)、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、……等。也由於 IFNs具有相對種屬特異性，所以，內源性幹擾素的抗病毒、抗腫瘤以及調理功能活性最強。 同時，EOT既可作為治療用藥，也可以作為預防用藥。可見，具有廣泛的疾病防治功能的IFNs是人類至今所發現的最好的一類細胞因子；內源性幹擾素(ENI)較外源性幹擾素(EXI)有無可比擬的優點。然而，欲想得到ENI， 關鍵是要獲得能安全應用於人體的、能有效誘導人體產生ENI的、造價低廉的、便於工業化生產的、不汙染環境的、資源豐富的內源性幹擾素誘導劑(EnII)。目前用於人體的商業化EnII主要是多聚肌苷酸(Polyinosinic Polycytidylic Acid，Poly [I: C]，PIC)，為人工合成的小分子雙鏈 RNA (Chadha KC, Dembinski WE, Dunn CB, et al. Effect of increasing thiolation of the polycytidylic acid strand of poly I :poly C on the alpha, beta and gamma interferon-inducing properties,antiviral and antipmliferative activities. Antiviral Res,2004，64[3] :171-7),國內於 1983 年廣泛用於臨床，作為廣譜抗病毒藥物使用。Poly[I:C]的藥理是通過刺激在體細胞產生內源性IFNs(ENI)來發揮其臨床效應，它能增強巨噬細胞的吞噬功能、殺傷病毒感染的細胞、阻止病毒蛋白的合成、抑制病毒在宿主細胞內的複製繁殖、抑制病毒從細胞內釋放、阻止病毒進入細胞、防止病毒擴散、保護正常細胞不受病毒侵犯、增強未感染細胞的抗病毒能
力......等；同時，它具有免疫調節功能，刺激和促進細胞活性從而增強清除病毒感染細
胞的能力，臨床已用於腫瘤和白血病的治療，病毒性肝炎、痘類病毒性感染等的治療。然而，近年發現Poly[I:C]在人體和其他靈長類體內易被血清核酸酶破壞、誘生 IFN產生的效能低。更有文獻報導Poly[I:C]會引起自身免疫性疾病，會導致機體發熱、造血機能下降、促紅細胞生成素減少、白細胞減少、肝脾細胞破壞、血壓及凝血功能失常、轉氨酶升高、腎功能損傷等一系列毒副作用，從而大大限制了 Poly[I:C]的市場和臨床應用(聶實踐、胡冬琴，錯位雙鏈核糖核酸的熱原反應，中國生物工程，2003，23[2] :97-98)。所以，尋找和開發新的第二代醫用EnII是全世界生物醫學家們角逐的領域，人類一直在追求安全而有效的醫用EnII。四、BTV NdsRNA具備發展成理想的醫用EnII的潛能人類已認識到「病毒具有誘導IFN的作用」、「人工合成的dsRNA具有誘導IFN的作用」，那麼，在理論上講，來自dsRNA病毒基因組的dsRNA分子應該具有發展成EnII的潛能。動物藍舌病毒(Bluetongue Virus,BTV)(董長垣主編，《現代分子病毒學》，武漢大學出版社，1996 年 10 月，Hu J，Dong CY，Jos印h L，Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta 0ncologica，2008，47 :124-134)是家畜綿羊的一種dsRNA病毒，與人類及其他動物等存在種族屏障。數百年的觀察已經結論BTV宿主範圍非常狹窄，對同科的牛不致病，對山羊兄弟也很少輕微致疾病；系異源動物病毒，不引起人類任何疾病；含分段dsRNA，帶依賴 RNA的RNA聚合酶，故提取和純化的dsRNAs沒有感染性；為dsRNA病毒，沒有腫瘤源性；系天然病毒，其核酸是天然核酸，毫無影響生態平衡的後顧之憂；BTV本身就是最好的天然幹擾素誘導劑。BTV基因組為雙鏈RNA分子，耐RNA酶(RNAase)；便於離體增殖和純化製備， 有利於產業化。這些特點賦予了它極其顯著的醫用和生物工程價值。人類早已結論，BTV不引起人類任何疾病；近年又有力地證明了 「dsRNA分子的安全性」。過去的近十年，申請人和國際同行又已反覆證明了 dsRNA病毒科成員，如人呼腸孤病毒(Reovirus，RV)、BTV 既具有靶向抗人癌作用(Hu J，Dong CY, Joseph L，Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica，2008，47 :124-134 ；陳杰、胡俊、董長垣、梁科、戴瑩、高婧，藍舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549細胞死亡機理的研究， 中華腫瘤學雜誌，2007，四[7] :505-509，陽海燕、董長垣、劉軍、李小成、鄧庚糧、畢國明，五株藍舌病毒對宮頸癌HeLa細胞作用特性的比較研究，中華微生物學和免疫學雜誌，2010， 30 [7] :621-625，杜賢進、周峰、董長垣、郭應祿、張杰，藍舌病毒HbC3對人腎癌細胞的感染殺傷作用，中華實驗外科雜誌，2010，27 [4] =504-506)，又對人體十分安全，並有顯著誘導實驗動物產生IFN的作用。最近，我們亦證實了 BTV對人正常細胞如人胚肺細胞、人氣管平滑肌細胞等無感染性；用實驗動物小鼠(非敏感動物)作半數致死量測定尚未尋找到LD5tl，顯示了 BTV dsRNA對實驗小鼠的安全性。須知，人對BTV也是非敏感性的。近年，申請人又在離體培養的人源細胞(正常/腫瘤細胞)上比較研究了 BTV、BTV 裸露的dsRNA分子(NdsRNA)和商業化的Poly [I C]的安全性和誘導IFN的能力，結果表明 ① BTV 對人源正常細胞安全(Hu J，Dong CY, Joseph L，Chen J, Chen DE, Liang K，Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica, 2008，47 :124-134，陳杰、胡俊、董長垣、梁科、戴瑩、高婧，藍舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549細胞死亡機理的研究，中華腫瘤學雜誌， 2007, 29 [7] :505-509，陽海燕、董長垣、劉軍、李小成、鄧庚糧、畢國明，五株藍舌病毒對宮頸癌HeLa細胞作用特性的比較研究，中華微生物學和免疫學雜誌，2010，30 [7] =621-625, 杜賢進、周峰、董長垣、郭應祿、張杰，藍舌病毒HbC3對人腎癌細胞的感染殺傷作用，中華實驗外科雜誌，2010,27 ] =504-506)；②BTVNdsRNA對離體培養的人正常細胞安全；③BTV NdsRNA能有效地誘導離體培養的人源細胞(包括正常細胞和腫瘤細胞)產生IFN-β ；
④BTVNdsRNA體外誘導IFN-β的產量顯著高於目前臨床上應用的Poly [I C] (P <0.01)；
⑤BTVNdsRNA能通過誘導產生IFN而殺死離體培養的人癌細胞等等(戴瑩、陳冬峨、高婧、胡俊、董長垣，異源藍舌病毒dsRNA與Poly[I:C]誘導人源體細胞產生IFN-β的比較研究，中華微生物學和免疫學雜誌，2008二8[3] :218-221，王海琪、董長垣、陳東娥、陳曉、 郭淑芳、劉文培，BTV及其dsRNA分子誘導IFN產生和細胞凋亡，中國病毒學，2005，20 [3] 268-271)。近來，申請人進而又在實驗動物體內比較研究了 BTV裸露的dsRNA分子(BTV NdsRNA)和商業化的Poly[I:C]的安全性和誘導IFN的能力。結果顯示了 ①BTV NdsRNA 對實驗動物的安全性；②BTV NdsRNA能有效地誘導實驗動物產生內源性幹擾素(ENIs)，如IFN-a、IFN- β、IFN- γ等；③BTV NdsRNA誘導實驗動物產生ENI- β的水平高於 ENI-α ；④BTV NdsRNA誘導實驗動物產生ENI-β的水平具有一定的量效關係；⑤同劑量的BTV NdsRNA誘導實驗動物產生ENI-β的能力顯著高於Poly [I :C] (P < 0. 01)；⑥BTV NdsRNA在實驗動物體內誘導IFN-a、IFN-i3產生的速度快，在完成動物接種後約池即達高峰;……。最近，我們建立起了流感病毒Hmi感染小鼠模型和疾病模型，並藉助該動物模型，以動物模型組為空白對照、以病毒感染動物模型組為條件對照、以目前最好的商業化幹擾素誘導劑Poly[I:C]為陽性藥物對照，系統地開展了 BTVNdsRNA體內預防流感病毒感染的作用研究、BTV NdsRNA體內治療流感肺炎的作用研究；並進一步驗證了 BTV NdsRNA對疾病動物的安全性、誘導疾病動物產生EOT的有效性、以及體內誘導內源性幹擾素EOT的種類，從而進一步確認了 BTV NdsRNA分子的醫用內源性幹擾素誘導劑EnII的極大潛能。研究結果顯示(I)BTVNdsRNA處理的小鼠，無明顯不良反應出現，再一次提示了 BTVNdsRNA在機體內的安全性。(2)real time RT-PCR試驗結果顯示BTV NdsRNA處理對於流感病毒Hmi感染小鼠，不管是預防還是治療，均能有效抑制鼠肺內的流感病毒的複製，且效果均優於 Poly[I:C]。(3)在有限觀察時間內(僅7天)，HE染色病理切片顯示BTV NdsRNA能有效預防流感病毒Hmi感染，高度顯著地減輕小鼠肺炎；並且，BTV NdsRNA預防流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果顯著地優於Poly [I C]。(4)在有限觀察時間內(僅7天)，HE染色病理切片顯示=BTVNdsRNA能高度有效地治療流感病毒Hmi感染導致的小鼠肺炎；並且，其治療流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果顯著地優於Poly[I:C]，流感病毒感染小鼠肺組織病變改善更為明顯。根據趨勢，隨著觀察的時間延長，BTV NdsRNA治療組動物肺組織病變會恢復得更好。(5) ELISA檢測結果顯示BTV NdsRNA和Poly [I C]都能有效誘導Hmi感染小鼠血清IFN-α、IFN-β、IFN-γ產生，並且，BTV NdsRNA誘導內源性幹擾素產生的能力顯著地優於 Poly [I: C]。我們的以上研究明顯地提示申請人BTV NdsRNA具備發展成理想的醫用內源性幹擾素誘導劑(ENI Inducer, EnII)的潛能，具有顯著的發展成新型抗病毒藥物的潛能。申請人:研究BTV NdsRNA ΕηΙΙ，無論體內還是體外，均以Poly [I C]為對照。無論在理論上，還是在體內、體外研究結果上，BTV NdsRNA EnII均優於Poly [I: C]。申請人考慮， 其原因可能是(A)Poly[I:C]為人工合成的dsRNA，而BTV NdsRNA則是天然的dsRNA ； (B) Poly [I C]為較小分子dsRNA，而BTVNdsRNA則是大分子dsRNA。五、dsRNA分子誘導細胞產生IFNs的細胞分子機理已很成熟Poly [I C]、黴菌和細菌的dsRNA、核酸類，以及我們的BTVNdsRNA等都是dsRNA分子，均能誘導IFN產生。近年已證實，TLR3 (Toll like receptor 3)和RIG-I/MDA5細胞信號轉導通路是識別dsRNA、誘導I型IFN表達的重要分子。TLR3主要表達於免疫細胞，定位於細胞內涵體(endosome)膜上的模式識另授體(pattern recognition receptor, PRR), 可識別經內吞作用進入細胞囊泡的dsRNA分子，誘導I型IFN表達。RIG-I/MDA5定位於細胞質內的PRR，識別胞質內dsRNA，通過不依賴TLR3的方式誘導IFN合成。這些研究成就為外源dsRNA通過受體結合，激活細胞信號通路，誘導IFN產生顯示了亮點(Alexopoulou L， Holt AC,Medzhitov R,et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature, 2001,413 [6857] :732-738)。有關幹擾素誘導劑、IFNs的產生和IFNs發揮各種重要生理功能的細胞分子機理已經研究得很清楚。關於TLR3細胞信號轉導通路與dsRNA分子。TLRs是單次跨膜受體，分為胞外區、 跨膜區和胞內區。胞外區有LRRs(leucine-rich repeats)結構域，由18 31個富含亮氨酸的重複序列和半胱氨酸結構所組成，識別特定的病原相關分子模式(PAMP)配體，如病原體組分、病原體產物、dsRNA。胞內區是TLR向下遊傳遞信號的核心元件，由大約200個胺基酸殘基組成，因其與IL-I受體的胞內區相似，故稱之為Toll/IL-Ι受體同源區(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)(Martin MU, Wesche H. Summary and comparison of the signaling mechanisms of the To 11/interleukin-1 receptor fam ily.Biochim Biophys Acta, 2002,1592 [3] :265-280)。TLRs家族成員的胞外區結構的差異性較大，是結合不同配體的結構學基礎。在已知的11個TLRs中，只有TLR3識別外源dsRNA、誘導I型 IFN合成(Alexopoulou L,Holt AC,Medzhitov R, et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature,2001,413[6857] 732-738)。TLR3主要在DC細胞和成纖維細胞中表達，主要定位於DC細胞內涵體(Matsumoto M, Funami K, Tanabe M, et al. Subcellular localization of Toll-like receptor 3 in human dendritic cells. J Immunol, 2003,171 [6] :3154 3162.)和成纖維細胞表面 (Matsumoto Μ, Kikkawa S, Kohase Μ, et al. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 293 [5] :1364 1369)。TLR3 信號通過絲氨酸/蘇氨酸(kr/Thr)磷酸化、二聚化及其核置換激活IFN調節因子-3(IRF-3)。Ser/ Thr激酶TBK-I是TLR3介導活化及磷酸化IRF-3的關鍵。關於RIG-I/MDA5細胞信號轉導通路與dsRNA分子。動物細胞還存在不依賴TLR3 識別dsRNA的受體。視黃酸誘導基因蛋白I(RIG-I)是細胞內識別病毒雙鏈RNA的一種受體，屬含 DexD/H box的dsRNA解旋酶家族成員。RIG-I的C端是解旋域，可以藉助解旋酶結構域結合 dsRNA(人工合成的和病毒的)，並以ATP酶依賴的方式解開雙鏈RNA ；N端是2個串聯的半胱天冬酶募集結構域(CARD)。誘導IFN-β表達需要RIG-I，但是，RIG-I並不參與IFN-β 下遊的信號通路(Kato H, Sato S, Yoneyama M, et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity, 2005，23 [1] : 19 28)。MDA5 也是一個能結合 dsRNA、激活 IRF-3 (IFN regulatory factor 3)、誘導 IFN 表達的信號分子(Kata H, Takeuchi 0, Sato S,et al. Differential roles of MDA5 and RIG—I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature, 2006,441 [7089] :101 105)。MDA5N 端也有 CARD 結構域，C端也有結合dsRNA的DExD/H box RNA解旋酶結構域。全長MDA5並非誘導IRF3 激活和IFN表達的必要條件。只要C端DExD/H box RNA解旋酶結構域結合dsRNA，MDA5才被激活(Yoneyama M, Kikuchi M, Matsumoto K, et al. Shared and unique functions of the DExD/H-box helicases RIG-I, MDA5, and LGP2 in antiviral innate immunity. JImmunol, 2005,175 [5] J851 沘58)。MAVS和CARDIF在RIG-I信號通路中具有重要作用。 MAVS定位於細胞線粒體外膜，是RIG-II下遊信號通路中的重要功能分子，為RIG-I和MDA5 下遊的信號分子，將信號傳遞給激酶IKK ε和ΤΒΚ1，進而激活IRF3(kth R B, Sun L, Ea C K, et al. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell,2005,122[5] 669 ~ 682)。TLRs誘導I型IFN表達。I型幹擾素包括IFN- α、IFN- β、IFN- ε和IFN- λ，是連接天然免疫和獲得性免疫的關鍵樞紐分子。TLRs能誘導樹突狀細胞(DC)產生I型幹擾素(Hoebe K, Janssen E M, Kim S 0, et al. Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways. Nat Immunol, 2003, 4[12] :1223 1229)。不同的 TLRs 誘導產生I型幹擾素能力並不相同，111 3、11^4、11^7、11^9能誘導產生IFN-α / β，而其他 TLRs似乎不能。同樣地，不同的DC細胞亞群產生I型幹擾素的能力也不一樣。pDC是I型幹擾素分泌細胞，高表達TLR7和TLR9，受到相應配體刺激時誘導大量的IFN- α ；mDC雖然也表達TLR7和TLR9，但是受體被激活後產生的細胞因子是IL-12。人類基因組中編碼有各種幹擾素基因，人類細胞有複雜的幹擾素調控系統。目前已發現有二條途徑介導TLRs信號轉導，一為髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88MyD88) it Wi^k^ (Akashi S, Shimazu R, Ogata H, et al. Cutting edge cell surface expression and lipopolysaccharide signaling via the toll-like receptor 4—MD—2 complex on mouse peritoneal macrophages. J Immunol.2000, 164[7] :3471-3475)；另一條為 MyD88 非依賴性途徑(Kawai Τ, Adachi 0，Ogawa Τ, et al. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin. Immunity,1999,11[1] 115-12 。MyD88分子是大多數TLRs信號轉導中的接頭分子，但是，MyD88功能缺失並不能完全終止所有的TLRs信號。所以，TLRs信號轉導必然還存在MyD88非依賴信號途徑。 dsRNA被TLR3胞外LRR結構域識別，引起胞內IlR結構域變化，與TRIF的TIR結構域相互作用，通過接頭分子Trif介導下遊的信號轉導，其中Trif-RIPl或者Trif_TRAF6通路激活 NF-k B誘導炎症因子的分泌，而Trif-TBKl/IKK ε通路激活IRFs，誘導I型IFN分泌(Kawai T，Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ, 2006,13 [5] :816 825)。TLRs 的胞外 LRR結構域識別不同的PAMP，引起胞內IlR結構域的構象變化，再招募下遊含IlR結構域的細胞信號轉導分子MyD88、TRIF (TICAM-I)、TRAM、TIRAP (Mal)等向細胞核內傳遞信號，激活 NF-k B、IRF-3, AP-I (activation protein 1)等家族的轉錄因子，後者在IFN基因的增強子上形成轉錄複合物，調控I型IFN基因表達。六、幹擾素受體及其信號通道產物IFN釋出胞外，與靶細胞特異性受體結合後，激活與受體胞漿端相連的「兩面神」激酶(Janus kinases, JAKs)，JAKs再磷酸化激活信號轉導子和轉錄激動子(signal transducers and activators oftranscription, STATs)中的酷氛酸殘基，使信號放大。 粦酸化激活的STATs酪氨酸殘基與磷酸化酪氨酸的Src同源區2 (Sffi)形成同二聚體和異二聚體。異二聚體和同二聚體都可與IRF結合，組成不同的三聚體。不同的三聚體與IFN激活的調節序列(IFN stimulated regulatory elements, ISREs)結合以分別驅動 IFN-α /β調控的基因表達或IFN-Y調控的基因表達。以前認為 dsRNA 依賴蛋白激 Bl (double-stranded RNA-dependent Protein Kinase, PKR)是細胞內信號傳導通路的重要因子，dsRNA誘導的PKR途徑是IFN產生的主要信號傳導通路。近年的研究工作已經搞清，蛋白激酶HiR以及2' -5'寡聚腺苷酸合成酶 (OAS)處於幹擾素介導的抗病毒反應的下遊，並不參與幹擾素本身的基因表達的調控過程， 而是蛋白激酶PKR和2' -5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)參與IFN介導的抗病毒反應(Smith E J, Marie I，Prakash A, et al. IRF3 and IRF7 phosphorylation in virus-infected cells does not require double-stranded RNA-dependent protein kinase R or Ikappa B kinase but is blocked by Vaccinia virus E3L protein. J Biol Chem,2001,276[12] 8951 8957)。dsRNA分子及其誘導I型幹擾素產生的細胞信號轉導通路的研究成績為潛在地使用BTV NdsRNA作醫用內源性IFN誘導劑以誘導人體內源性IFN提供了理論依據。這一系列的基礎理論研究成績結合申請人的前期應用基礎理論研究成績已經為申請人提出的本發明專利奠定了堅實的理論基礎和技術條件。利用體外培養細胞增殖BTV，提取dsRNA，製備內源性幹擾素誘導劑，直接用於人體，遵循機體自身防禦反應方式誘導各種內源性幹擾素，賦予人體以抗病毒病臨床治療和預防、抗腫瘤的治療和聯合治療、以及廣泛的防病、治病和增強體質的功能，具有高度的安全性和高效性。七.小結本發明是在我們前期以BTV NdsRNAs作為外源性幹擾素誘導劑(ExII)誘導體外培養細胞產生外源性幹擾素(EXI)的基礎上發展起來的。如前所述，IFNs可分為內源性幹擾素(ENI)和EXI。EXI就是在體外用ExII刺激離體培養細胞所生產的或基因工程合成的而後用於機體的IFN。EXI存在諸多缺點，如所用INF的種類單一，所以，相對於ENI，其藥物和生理功能較差；INF屬蛋白質多肽類，所以， EXI用於人體為異源抗原，發揮免疫原性，會引起機體異源反應和依賴性，同樣具有較大的毒副作用；而且其製備複雜、價格昂貴，保存和運輸麻煩，所以，限制了 EXI的大量生產和普及應用。亦如前所述，ENI則是用內源性幹擾素誘導劑(EnII)於體內，直接誘導機體產生的內源性IFNs。用EnII在人體內直接誘導產生的ENI能克服EXI的諸多不足，如誘生的 IFN種類齊全、體內濃度高、沒有異源蛋白質的免疫原性(即過敏反應和排斥反應)、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、……等。也由於IFNs具有相對種屬特異性，所以，ENI的抗病毒、抗腫瘤以及調理功能活性最強。同時，EOT既可作為治療用藥，也可以作為預防用藥。然而，欲想得到ENI，關鍵是要獲得能安全應用於人體的、能有效誘導人體產生EOT的、造價低廉的、便於工業化生產的、不汙染環境的、資源豐富的ΕηΙΙ。目前，人類所用的最好的商業化的EnII是Poly [I: C]。如前所述，Poly [I C]具有一系列的缺陷，市場和臨床應用都受到極大限制。所以，尋找和開發新的第二代醫用EnII 是全世界生物醫學家們角逐的領域，人類一直在追求安全而有效的醫用ΕηΙΙ。本發明正是提供了這樣一種全新的優於Poly[I:C]的內源性幹擾素誘導劑 (EnII)。

發明內容
針對現有技術中存在的不足，本發明的目的在於提供了一種應用於人體產生內源性幹擾素的全新的異源藍舌病毒雙鏈RNA內源性幹擾素誘導劑(BTV NdsRNA EnII)。為了實現臨床應用，本發明採用以下技術措施一種異源藍舌病毒雙鏈RNA內源性幹擾素誘導劑的製備方法，其步驟是1.細胞培養以世界衛生組織推薦為生產人用疫苗的理想細胞，一非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)或幼倉鼠腎傳代細胞(BHK-21)為病毒擴增培養細胞。細胞在37°C、5% C02、10%小牛血清、DMEM培養基常規培養。2. dsRNA BTV增殖待細胞長至80% _90%匯合時，棄培養液，用pH 7. 4的IXPBS 洗滌貼壁細胞1-2次，接種BTV病毒株懸液1. Oml於培養瓶，37°C吸附1_2小時後，棄病毒液，以含2%小牛血清的添加DMEM培養基在37°C，5% CO2條件下維持培養。隨後每12小時光鏡下觀察一次，至細胞出現明顯細胞病變效應(CPE)，即當CPE達90%時收穫病毒。3. dsRNABTV的提取和純化收穫培養的dsRNABTV按本研究室獲得的高活性、高純度、高通量製備病毒的「反向免疫共沉澱技術」(PARA ；)工藝(中國專利ZL2004100U605. 9) 提取和純化dsRNA BTV。4. BTV dsRNA 的提取(a) PEG6000濃縮上述提取和純化的BTV ；(b)裂解液裂解BTV ；(c)磁珠法提取 BTV dsRNA ；(d)蔗糖濃縮純化的dsRNA ；(e)-20°C保存，備用。5.病毒基因組dsRNA的鑑定採用瓊脂糖凝膠電泳技術和聚丙烯醯胺凝膠電泳技術，分析電泳圖譜鑑定。6.提取dsRNA純度鑑定採用紫外分光光度法(根據0擬60/0擬80比值)結合聚丙烯醯胺凝膠電泳技術判斷所提取dsRNA的純度。7.雙鏈RNA濃度的測定採用紫外分光光度法測定雙鏈RNA含量，根據dsRNA濃度=OD260 X 稀釋倍數 Χ40(μ g/ml)。8.製備成注射劑型，經肌內注射使用。實驗研究統計分析結果及說明本發明所作的BTV dsRNAs體內誘導內源性幹擾素產生的研究是在我們前期在體外培養細胞上所作的BTV dsRNAs誘導外源性幹擾素的基礎上開展的。與現有技術相比，本發明具有如下優點和有益效果1.能非常安全地運用於人體。BTV不引起人類任何疾病；含分段dsRNA，帶依賴 RNA的RNA聚合酶，故提取和純化的BTV dsRNAs沒有感染性；BTV為dsRNA病毒，沒有腫瘤源性；為天然病毒，不會影響生態平衡。所以，本發明製備的新的內源性幹擾素誘導劑BTV NdsRNAEnII系天然病毒雙鏈RNA，能非常安全地運用於人體。2.為新的理想的天然核酸藥物。本發明製備的EnII能直接誘導機體產生種類齊全的內源性幹擾素(ENIs)。幹擾素(Interferons，IFNs)是人類至今所發現的最好的一類細胞因子，不僅具有抗腫瘤和抗病毒作用，而且具有增強體質的調理作用；既能治療疾病， 又能預防疾病；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如SARS-CoV、禽流感病毒)。本發明製備是醫用內源性幹擾素誘導劑(Endo-hterferon Inducer, ΕηΙΙ)，直接用於人體內誘導機體產生ENIs。在這種情況下，機體變成了生產幹擾素的複合工廠，以生產各型幹擾素，發揮抗腫瘤、抗感染和調理作用。EOT是天然幹擾素，所以，用EnII在人體內直接誘導產生的MI能克服EXI的諸多不足，如誘生的IFN種類齊全、體內濃度高、沒有異源蛋白質的免疫原性(即過敏反應和排斥反應)、沒有依賴性、無需提純、造價低廉、既可用作治療用藥，也可以作為預防用藥等。也由於IFNs具有相對種屬特異性，所以，內源性幹擾素抗病毒、抗腫瘤以及調理功能活性最強。並且，本發明製備的EnII用於人體完全遵循機體產生幹擾素的防禦反應機制，能更有效誘導內源性幹擾素產生。3.本發明的臨床效果顯著地優於目前所用的最好的商業化的Poly[I:C]。 Poly[I:C]為人工合成的小片段dsRNA分子，誘生IFN的能力低，伴有許多副作用，且價格昂貴，市場受到極大的限制。本發明在研究BTV NdsRNA EnII過程中，無論體內還是體外，均以Poly[I:C]為對照；無論在理論上，還是在體內、外實驗結果上，BTV NdsRNA EnII均優於 Poly[I:C]。4.具有顯著的資源優勢。(A)BTV NdsRNA是一種全新的對人安全的天然的可無限再生的綠色生物材料，取之不盡，用之不竭。BTV NdsRNA EnII正是以之為資源而提取製備的天然EnII ； (B)申請人擁有22個(幾乎全部)血清型BTV資源、人癌細胞和動物癌細胞資源；形成了全套管理、保管、使用、監測.......等技術系統。5.具有潛在的其他生理學功能。申請人的前期工作也提示了，BTVNdsRNA不僅具有誘導ENIs產生的生理功能，而且具有誘導白細胞間介素-2 (IL-2)產生的生理功能。BTV NdsRNA EnII理所當然地也能用作BTV NdsRNA ExII06.全新的系統和理論。其作用機理是利用「裸露的動物病毒基因組 dsRNA(NdsRNA)直接調控人源細胞幹擾素基因的表達」。這是一個全新的系統，揭示了裸露的病毒基因組dsRNA無須用轉基因技術而直接通過注射的方式應用於人體，並安全而有效地誘導機體產生各種ENIs，發揮其藥理和生理作用。7.本發明所用資源便於離體增殖和純化製備，有利於產業化，生產成本低，容易獲取。8.由於EnII體內誘導ENIs產生的速度快、安全、高效、造價低廉，所以，既能用於臨床疾病的常規預防和治療，也可應對突發性公共衛生事件。9.本發明製備的EnII市場很大。申請人的前期工作已經展示了理想的EnII的醫學價值和市場前景。BTV NdsRNA具有誘導IFN產生的生理功能，具有選擇性抗癌的作用，而病毒病和腫瘤這兩類疾病都是目前對人類健康和生命威脅最大的疾病之一。從近年新的病毒病等(如AIDS、SARS、禽流感、結核等)的出現和流行來看，新的傳染病的預防顯得特別重要，在這一點上，更是EnII的用武之地。所以，EnII既在新、老傳染病預防和治療上有廣闊的市場，又具有應對突發性公共衛生事件的重大價值，比如說，它是抗B型肝炎的首先藥物，可見一斑。由於ENI較EXI有無可比擬的優點，所以，理想的EnII將會佔據IFN相關生產的95%以上的市場，並會極大地擴大現有IFN市場。


圖1. BTV dsRNA基因組聚丙烯醯胺凝膠電泳圖譜和瓊脂糖凝膠電泳圖譜圖2.實驗動物體內比較研究BTV dsRNA與Poly [I C]誘導IFN- α產生的消長曲線圖(有限觀察時間6小時)圖3.實驗動物體內比較研究BTV dsRNA與Poly [I: C]誘導IFN-β產生的消長曲線圖(有限觀察時間6小時)圖4.小鼠體內BTV dsRNAs預防和治療流感病毒Hmi感染性肺炎的組織學切片 (HE染色)圖4-A.正常組鼠肺組織(HE染色，x400)，可見肺泡組織結構正常，間隙清楚，無滲
出ο圖4-B.病毒模型組鼠肺組織(HE染色，x400)，可見肺泡間隔不清，肺泡有大量滲出，大量炎性細胞聚集。圖4-C. Poly[I:C]預防組鼠肺組織(HE染色，x400)，與圖4-B比，病變較輕，可見肺泡組織結構，肺泡間隔少量滲出，有炎性細胞聚集。圖4-D. BTVNdsRNA預防組鼠肺組織(HE染色，x400)，與圖4_B比較，僅少量滲出， 些許炎性細胞聚集；與圖4-C比較，組織病變明顯較輕，肺泡組織結構清楚，肺間隔滲出少， 伴少許炎性細胞。圖4-E. Poly [I C]治療組鼠肺組織(HE染色，x400)，與圖4_B比較，病變組織有所好轉，肺組織輪廓可見，但肺間隔仍有大量炎性滲出，伴炎性細胞浸潤。圖4-F. BTVNdsRNA治療組鼠肺組織(HE染色，x400)，與圖4_B比較，肺泡間隙清楚，病變明顯改善；與圖4-E比較，肺組織病變顯著輕微，肺組織輪廓清晰，肺間隔少許滲出ο圖5.流感病毒核酸RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜A為Marker ；B為PCR產物條帶；C為未加模板的陰性對照。圖6. Real-time PCR檢測各實驗組小鼠肺組織流感病毒HmiRNA載量曲線6-A.正常對照組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線；圖6-B.模型對照組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線；圖6_C.Poly[I:C]預防組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線；圖6-D. BTV dsRNA預防組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線；圖6_E.Poly[I:C]治療組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線；圖6-F. BTV dsRNA治療組鼠肺組織流感病毒Hmi RNA Real-time PCR擴增曲線。圖7.各實驗組鼠肺組織內流感病毒Hmi RNA載量比較圖(PIC即Poly [I :C])圖8.各實驗組小鼠血清IFN- α、IFN- β、IFN- γ等內源性幹擾素濃度比較(觀察 7 天；PIC 即 Poly[I:C])
具體實施例方式下面結合具體的實施例進一步詳細闡述本發明。應當說明的是，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求的保護範圍。我們前期在體外培養細胞上所作的BTV dsRNAs誘導外源性幹擾素的研究中，均以目前最好的已商品化的Poly[I:C]為對照，開展BTV dsRNAs體外誘導幹擾素的有效性研究；以人源正常細胞和惡性腫瘤細胞對照研究了 BTV dsRNAs體外誘導幹擾素的有效性和安全性。部分結果見表1-4。表1.不同濃度BTV分別誘導Hela細胞和HEL細胞產生β-IFN含量的直線回歸
權利要求
1. 一種異源藍舌病毒雙鏈RNA內源性幹擾素誘導劑的製備方法，其步驟如下(1)細胞培養以非洲綠猴腎細胞或幼倉鼠腎傳代細胞為病毒擴增培養細胞，在37°C、 5% CO2、10%小牛血清、DMEM培養基常規培養；(2)dsRNABTV增殖待細胞長至80% -90 %匯合時，棄培養液，用pH 7. 4的IXPBS洗滌貼壁細胞1-2次，接種BTV病毒株懸液1. Oml於培養瓶，37°C吸附1_2小時後，棄病毒液， 以含2%小牛血清的添加DMEM培養基在37°C，5% CO2條件下維持培養，隨後每12小時光鏡下觀察一次，至細胞出現明顯細胞病變效應，即當CPE達90%時收穫病毒；(3)dsRNA BTV的提取和純化收穫培養的dsRNA BTV按中國專利ZL200410012605. 9的 「反向免疫共沉澱技術」工藝提取和純化dsRNA BTV ；(4)BTV dsRNA 的提取(a)PEG6000濃縮上述提取和純化的BTV；(b)裂解液裂解BTV;(c)磁珠法提取BTVdsRNA ；(d)蔗糖濃縮純化的dsRNA；(e)-20°C保存，備用；(5)病毒基因組dsRNA的鑑定採用瓊脂糖凝膠電泳技術和聚丙烯醯胺凝膠電泳技術， 分析電泳圖譜鑑定；(6)提取dsRNA純度鑑定採用紫外分光光度法結合聚丙烯醯胺凝膠電泳技術判斷所提取dsRNA的純度；(7)雙鏈RNA濃度的測定採用紫外分光光度法測定雙鏈RNA含量；(8)製備成注射劑型，經肌內注射使用。
全文摘要
本發明公開了一種異源藍舌病毒雙鏈RNA內源性幹擾素誘導劑的製備方法。該誘導劑是從動物藍舌病毒中提取裸露的dsRNA分子製備而成的，直接用於人體，誘導人體產生內源性幹擾素，賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強體質的功能。主要優點A)直接誘導人體產生種類齊全的ENI、體內濃度高、抗病毒和抗腫瘤活性最強、沒有異源蛋白的免疫原性、沒有依賴性、無須提純、造價低廉。B)沒有感染性；系dsRNA病毒，沒有腫瘤源性；為天然病毒，不會影響生態平衡。C)是一種全新的對人安全的天然的綠色生物材料，用之不竭、可無限再生，便於離體增殖和純化製備。D)高度符合種屬特異性，在人體內的藥理作用最強。
文檔編號C12N15/113GK102350001SQ201110325180
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者劉軍, 方蘭, 楊繼紅, 董長垣, 鄧庚糧, 陳冬娥 申請人:武漢大學