表達外源基因的重組豬細小病毒vp2病毒樣粒子的製作方法

2023-05-15 02:04:56

專利名稱：表達外源基因的重組豬細小病毒vp2病毒樣粒子的製作方法
技術領域：
本發明涉及在腺病毒表達系統中表達外源基因的重組豬細小病毒(PPV) VP2病毒樣粒子的構建 及應用，屬於基因工程疫苗領域。
二背景技術：
PPV (Porcine Parvovirus)不僅是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，而且能夠引起多種豬病。 VP2是病毒粒子主要成分，約佔80%，在自然狀態下可自主裝配。VP2具有良好的免疫原性，眾多的 科學家利用VP2的良好免疫特性構建重組疫苗來預防本病，取得了很好的效果，同時還是具有血凝活 性的物質。Martinez等將PPVVP2基因克隆到杆狀病毒表達系統中，並成功地在昆蟲細胞中高效表達， 表達的VP2多肽能自我裝配成病毒樣粒子(Virus-Like Particles, VLPs)，用其免疫母豬能誘導產生免疫 應答。儘管未見有關該種疫苗進一步研究和應用的報導，但是VP2基因在體外表達的蛋白能自我包裝 成病毒樣粒子的特性，為重組多價亞單位疫苗的研究打下了基礎。Sedlik等將PPV VP2和包含淋巴細 胞脈絡叢腦炎病毒(LCMV)的118-132位胺基酸的抗原決定簇區相連，然後克隆於杆狀病毒表達載體 PACYM，轉染表達PPV:VP2-LCMV蛋白。利用該重組蛋白免疫鼠可以誘導強烈的CTL反應，在體內 持續時間長達9個月，並可抵抗致死量的LCMV攻擊。之後，Sedlik又將LCMV的CD8+T細胞抗原 決定簇多膚共價結合於l nm的脂質微球上，與上述表達的PPV:VP2-LCMV蛋白一起進行了免疫小鼠 的比較，結果發現二者都能誘導產生很強的CD8+T細胞反應。但是PPV:VP2-LCMV攜帶的抗原量比 脂質體微球少100倍時，誘導的CTL活性仍比脂質體微球誘導的CTL活性高6倍，並且只有 PPV:VP2-LCMV免疫的小鼠能抵抗致死量的LCMV的攻擊。Richard等用PPV VP2共價結合B肝病毒 HBSAg的抗原決定簇區多肽，然後免疫小鼠誘導產生了很強的針對插人的HBSAg決定簇的T細胞反 應，並能抵抗B肝病毒的致死性攻擊。這些結果均說明PPVVP2病毒樣粒子作為一種抗原的轉運載體 具有很大的潛在價值，並為進行多價重組疫苗的研究創造了良好的條件。
豬圓環病毒2型(PCV2)與多種豬病相關，主要引起仔豬多系統衰弱症候群(PMWS)、豬皮炎腎病綜 合徵(PDNS)、繁殖障礙、豬呼吸症候群、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴腺炎、也可能引起滲出性皮炎、 仔豬先天性震顫等。尤其PMWS，自1991年加拿大首次報導以來，現已證實呈世界性流行,我國的一 些豬場也普遍存在本病。大量報導證明易感豬單獨感染PCV2後會出現典型的病理變化，但不表現或 只出現輕微的臨床徵狀，但在感染其他病原如PPV、 PRRSV、各種致病菌等、飼養條件改變或外界刺 激條件下表現臨床徵狀。PCV2與PPV和PRRSV混合感染引起的PMWS很難治癒，國外研究表明在 實驗條件下PCV2與這兩種病毒混合感染可以複製出典型的PMWS,但單獨感染這三種病毒不表現臨 床徵狀,因此有人認為PCV2與其他病原可能有協同作用，但其機理還不清楚。豬一旦感染圓環病毒病， 無有效治療的藥物，因此研究安全、有效的疫苗是預防本病的主要途徑。已有研究表明PCV2 Cap蛋 白成為疫苗研究的候選基因，PCV2抗原決定簇主要集中在Cap蛋白第47 85， 165 200及C端最後 4個胺基酸。
三、發現內容
技術問題
本發明目的在於1)利用腺病毒表達系統構建表達外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子的方法， 及以該重組PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原轉運載體進行多價重組疫苗的研製；2)構建了在腺病 毒表達系統中表達2型豬圓環病毒Cap基因的重組PPV VP2病毒樣粒子及其在疫苗上的應用。
技術方案表達外源基因的重組豬細小病毒(PPV) VP2病毒樣粒子，其特徵在於，是利用腺病毒表達系統 表達PPVVP2C端1640bp基因片段AVP2構建而成的PPVVP2病毒樣粒子。構建方法為
1) 獲取AVP2目的基因並克隆入pMD9-T載體
以GenBank中基因登錄號為NC:001718的NADL-2菌株基因序列為模板，用軟體Primer 5.0設
計引物
P1 5 '-gaggtaccgggggggttggt卿國3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'
分別加入ATp"I和Afe/1酶切位點，以PI, P2引物擴增PPV弱毒株NADL-2的DNA,擴增的PCR 產物含VP2基因1740 bp中的1640 bp片段AVP2，在1%瓊脂糖凝膠上電泳後，回收並將其與pMD19-T Vector連接，轉化￡.co//DH5a，鹼裂解法提取質粒，《p71和Afort雙酶切鑑定，獲得陽性質粒pTAVP2;
2) 重組質粒pAd-AVP2的構建與鑑定
利用雙酶切位點A^ I/AtoI將目的片段克隆至穿梭載體pShuttle-CMV中；用A:/7wIM^ I雙酶切及 測序分析進行鑑定，命名為rShuttle-AVP2;用屍附e I酶切該重組質粒，使其線性化，然後與pAdEasy mVector在1.8 kV、 25 和200 Q條件下電轉化至大腸桿菌A/57W感受態細胞，使rShuttle-AVP2 與pAdEasyTM Vector發生同源重組，轉化至DH5(x宿主菌，挑選出陽性克隆，用PCR，酶切鑑定 重組是否正確，構建成重組質粒，命名為pAd-AVP2;
3) 重組PPV VP2病毒樣粒子的獲得
將重組質粒pAd-AVP2轉染轉染HEK-293A細胞，獲得重組腺病毒pAd-AVP2，重組腺病毒表達 的AVP2蛋白在該重組腺病毒感染的HEK-293A細胞中自我裝配成病毒樣粒子PPV:VLPs，即為構建 的在腺病毒表達系統中表達外源基因的重組PPVVP2病毒樣粒子。
上述重組PPVVP2病毒樣粒子作為抗原轉運載體的應用所獲得的產品，其特徵在於，將表達2型 豬圓環病毒PCV2 Cap的165-200位胺基酸基因(ACap)嵌合在PPV VP2病毒樣粒子AVP2的N端，然 後克隆到腺病毒表達系統中所獲得的病毒樣粒子或疫苗產品。
有益效果
本發明的特點和優點如下
1、 本發明應用的腺病毒表達系統是缺失了El和E3基因的人腺病毒血清5型(Ad5)，具有無致病 性、複製效率高、克隆空間大(可容納7.5 Kb的外源片段)、能在大多數哺乳動物細胞和組織中表達重 組蛋白、在同種細胞和組織中可同時表達多個基因等特點，可對外源基因進行正確的翻譯和修飾，使 表達的蛋白具有與天然蛋白相同的生物活性。使用該系統構建的重組病毒用於豬體，還可以避免由於 豬體自身產生的腺病毒抗體影響免疫效果。
2、 利用腺病毒表達系統構建表達外源基因的重組PPVVP2病毒樣粒子將PPVVP2C端基因片 段AVP克隆到腺病毒表達系統中，轉染HEK-293 A細胞，RT-PCR、間接免疫螢光及Western-blotting 實驗結果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A細胞中高效表達；表達產物的粗提物用3%的磷鎢酸負染後 經透射電鏡觀察，在電鏡下可以看到大量病毒樣顆粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形態大 小均與全病毒粒子相似。
3、 利用腺病毒表達系統構建了表達外源基因的重組PPVVP2病毒樣粒子，以PPVVP2病毒樣粒 子作為一種抗原轉運載體，為重組多價亞單位疫苗的研製打下了基礎。
4、 本發明以PPV VP2病毒樣粒子作為PCV2抗原的轉運載體將PCV2 Cap的165-200位胺基酸 (ACap)基因嵌合在PPV VP2的N端(AVP2)，然後克隆到腺病毒表達系統中，轉染HEK-293 A細胞， RT-PCR、間接免疫螢光及Western-blotting實驗結果表明，AVP2蛋白在HEK-293 A細胞中高效表達； 表達產物的粗提物用3%的磷鎢酸負染後經透射電鏡觀察，在電鏡下可以看到大量病毒樣顆粒子存在， 呈圓型，直徑為30nm左右，其形態大小均與全病毒粒子相似。5、本發明構建的重組腺病毒表達的嵌合病毒樣粒子，免疫小鼠實驗結果顯示在首免後第14天 實驗組能檢測到PCV2特異性抗體，抗體的滴度隨著時間的延長而增高，在二免後35天時杭體水平達 最高為1:10000; 二免後35天，實驗組PPV中和抗體滴度為20， PCV2中和抗體滴度位16; 二免後 28至42天實驗組和對照組Con A/LPS刺激指數差異極顯著。說明重組的嵌合病毒樣粒子具有良好的 PPVVP2和PCV2Cap的免疫原性，免疫動物後可誘導產生保護性免疫反應。
6、本發明構建的重組腺病毒表達的嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]作為一種蛋白質載體多價 重組疫苗不但安全性高、價廉，而且可以有效的預防PCV2感染及由PCV2與PPV混合感染而導致的 PMWS的發生，是一種新型的安全有效的後選疫苗。 四

圖1: PPVAVP2目的基因擴增片段
圖2:重組質粒rShuttle-AVP2尺pj I /Wo/1雙酶切酶切鑑定圖譜 圖3:重組質粒pAd-AVP2屍acl酶切鑑定圖譜
圖4:重組腺病毒rAd-AVP2間接免疫螢光圖重組腺病毒(a)和細胞對照(b) 圖5:表達AVP2蛋白的免疫轉印鑑定 圖6: PPVVP2病毒樣粒子電鏡圖 圖7: PCV2 ACap目的基因擴增片段
圖8:重組質粒rShuttle-ACap-AVP2《戸I/AfeH雙酶切酶切鑑定圖譜 圖9:重組質粒pAd-ACap-AVP2 Pacl酶切鑑定圖譜 圖10:重組病毒間接免疫螢光圖豬抗PPV(a)和PCV2(b)血清的對應孔， 細胞對照孔(c)
圖ll:表達嵌合蛋白的免疫轉印鑑定豬抗PPV(1)和PCV2(2)血清，細胞對照孔(3)
圖12:嵌合病毒樣粒子電鏡圖
圖13: PCV2特異性抗體圖
圖14:淋巴轉化實驗圖(ConA刺激)
圖15:淋巴轉化實驗圖(LPS剌激)
圖16:嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)構建示意圖
五具體實施例方式
1、表達外源基因的PPVVP2病毒樣粒子的構建及應用
1) 獲取AVP2目的基因並克隆入pMD19-T載體
以GenBank中NADL-2基因登錄號為NC:001718基因序列為模板，用軟體Primer 5.0設計引物 分別加入Kp"I和A^I酶切位點。PPV弱毒株(NADL-2)購自中國獸藥監察所。 P1 5 '-gaggtaccgggggggttggtgtgt-3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'
以Pl， P2引物擴增含VP2(1740 bp)基因C端1640 bp的片段(圖1)。擴增的PCR產物在1%瓊脂 糖凝膠上電泳後，回收並將其與pMD19-T Vector連接，轉化DH5a，鹼裂解法提取質粒，《pwl 和A^I雙酶切鑑定，獲得陽性質粒(pTAVP2)。
2) 重組質粒pAd-AVP2的構建與鑑定
利用雙酶切位點(《F2lMfert)將目的片段克隆至穿梭載體pShuttle-CMV中；用K/M/M^I雙酶切(圖 2)及測序分析進行鑑定，命名為rShuttle-AVP2;用Ane I酶切該重組質粒，使其線性化，然後與腺 病毒骨架載體(pA犯asyTMVector)在1.8 kV、 25 和200 Q條件下電轉化至大腸桿菌&/57 感受態細 胞，使rShuttle-AVP2與pAdEasyTM Vector發生同源重組，轉化至DH5a宿主菌，挑選出陽性克隆，用 PCR、屍acl酶切(圖3)鑑定重組是否正確，構建成重組質粒，命名為pAd-AVP2。3) 重組病毒的獲得
按照脂質體轉染試劑操作方法，將預先用屍flcl線性化的重組質粒pAd-AVP2轉染HEK-293A細 胞，5%C02， 37'C靜置培養10d以上，顯微鏡觀察細胞病變，當細胞病變達70%時，收毒。經3次噬 斑純化實驗，獲得重組病毒(rAd-AVP2)的滴度為10112TCID5/mL。
4) 病毒樣粒子的生物學特徵研究
① 間接免疫螢光
將重組腺病毒稀釋後接種於長滿單層的HEK-293A細胞，5%C02、 37'C培養，約24 h，棄去上清， 用PBS洗滌一次，37'C乾燥45min， -20匸冷凍45 min，再以冷的無水乙醇4'C固定45 min， PBST洗 滌3次；加入50 nL 1:40稀釋的豬抗PPV的血清，37。C作用1 h，用PBST洗滌3次；加入1:100 F1TC陽SPA， 37'C作用1 h，洗滌3次；顯微鏡觀察。重組腺病毒rAd-AVP2對應孔(a)中呈現較強的螢光，而細胞 對照孔(b)沒有螢光出現(圖4)，說明重組腺病毒rAd-AVP2在細胞中表達了 PPV: AVP2蛋白。
② 蛋白質印記
用8。/。PEG-6000濃縮重組腺病毒HEK-293A細胞培養物，同時設定正常HEK-293A細胞培養物為 對照。將上述濃縮蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉印到硝纖膜後，10%脫脂乳封閉過夜；加入1:40豬抗 PPV的血清室溫作用2 h;洗滌3次，加入1:20000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG，室溫作 用1.5 h;充分洗滌後，加入化學發光法顯色液(DAB)，觀察特異蛋白條帶。濃縮的重組腺病毒經電 泳轉印顯色後顯示，在66 KD處均有一條明顯的條帶，而對照正常的HEK-293A細胞沒有(圖5)， 說明重組腺病毒rAd-AVP2在細胞中表達了 PPV: AVP2蛋白。
③ 病毒樣粒子的粗純化與電鏡觀察
收集病變細胞，用PBS洗兩次，1000 r/min 15 min離心，重懸於50 mmo1/1 NaHC03中，超聲波裂 解後，24 000r/min離心5min，上清液中含有表達的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸銨至終濃度20。/0， 4'C攪拌過夜進行沉澱，然後離20 000r/min離心10min ，沉澱重懸於中，透析除鹽即為嵌合病毒樣 粒子的粗提物。腺病毒野毒做同樣處理後做對照。加入1:10稀釋的豬抗PPV血清37'C作用lh後再 4'C過夜，以12 000r/min離心90min,沉澱重懸於少量水中，用3%的磷鉤酸負染後經透射電鏡觀察。 在電鏡下可以看到大量病毒樣粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形態大小均與全病毒粒子相 似(圖6)，說明重組腺病毒rAd-AVP2在細胞中表達的PPV:AVP2蛋白能自我組裝成病毒樣粒子。
紅細胞凝集試驗
參照《動物病毒學》，使用0.7。/。豚鼠紅細胞的生理鹽水懸液。重組腺病毒rAd-AVP2血凝效價為l:64， 空的腺病毒野毒沒有血凝活性，說明rAd-AVP2表達的AVP2蛋白保持PPV原有的生物學活性。
2、以PPV VP2病毒樣粒子作為一種抗原轉運載體,構建表達2型豬圓環病毒Cap基因的重組PPV VP2病毒樣粒子(圖16)
1)獲取ACap-AVP2目的基因並克隆入pMD19-T載體
以GenBank中PCV2-js2002基因登錄號為AY691679和PPV VP2重組質粒的基因序列為模板， 用軟體Primer 5.0設計引物P3， P4， P5， P6和P7，分別加入酶切位點，PCV2 js2002由本實驗室 分離鑑定(公知公用，見參考文獻潘群興等，檢測PCV2、 PPV、 PRV疫苗株與野毒株的多重PCR 方法，中國病毒學，2005， 20 (6) 603 60)。
P3 5' - ctggtaccatggtccaccgcccaggag - 3' Kpnl
P4 5'-cagctagccgttaccgctggagaagg-3' Nhel
P5 5'-gagctagcgggggggttggtgtgt-3' Nhel
P6 5' -cggctgcagctagtataa加cttgg -3' Pstl
P7 5'-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3' 油,I 以P3， P4引物擴增PCV2Cap蛋白的165-200位胺基酸基因108 bp (圖7)的片段ACap，以P5，P6引物擴增PPV VP2蛋白C端1640 bp (圖1)的片段AVP2，擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上 電泳後，回收並將其與pMD19-T Vector連接，轉化￡co//DH5a，鹼裂解法提取質粒，分別用K/wI/滿el 和^/^1/屍^1雙酶切鑑定，獲得陽性質粒(pTAC叩，pTAVP2)。
利用引物上的內切酶A%d和pMD19-T Vector上的屍wl將陽性質粒pTACap雙酶切，回收2.8 Kb 的片段，同時利用引物上的內切酶Mzel和屍sfl將陽性質粒pTAVP2雙酶切，回收1.64Kb的小片段， 然後將回收的兩片段用T4DNAUgase連接，轉化DH5a,鹼裂解法提取質粒，^pwI/屍Wl雙酶切 鑑定，陽性質粒命名為pTACap-AVP2。
2) 重組質粒pAd-ACap-AVP2的構建與鑑定
以P3， P7為引物，陽性質粒pTACap-AVP2為模板，PCR擴增ACap-AVP2片段，並引入內切 酶A:/wI/Mrfl。按照pAdEasy Vector載體系統操作說明，利用雙酶切位點C^p"I/M rt)將外源片段 (ACap-AVP2)克隆至轉移載體pShuttle-CMV中；用PCR、 /^"I/Afe/I雙酶切及測序分析進行鑑定 (圖8)，命名為rShuttle-ACap-AVP2。
用屍wel酶切該重組質粒，使其線性化，然後與pAdEasyTMVector在1.8kV、 25 和200 Q條件 下電轉化至大腸桿菌^a/5JW感受態細胞，使rShuttle-ACap-AVP2與骨架載體(pAdEasy Vector) 發生同源重組，轉化至DHsa宿主菌，挑選出陽性克隆，用PCR、屍acl酶切鑑定重組是否正確(圖9)， 構建成重組質粒，命名為pAd-ACap-AVP2。
3) 重組病毒的獲得與純化
按照脂質體轉染試劑操作方法，將預先用線性化的重組質粒pAd-ACap-AVP2轉染 HEK-293A細胞，5%C02， 37。C靜置培養10 d以上，顯微鏡觀察細胞病變，當細胞病變達70%時，收 毒。經3次噬斑純化實驗，獲得重組病毒(rAd-AVP2)的滴度為10118TCID5/mL。
4) 嵌合病毒樣粒子的生物學特徵研究
① 間接免疫螢光
將重組腺病毒稀釋後接種於長滿單層的HEK-293A細胞，5%C02、 37'C培養，約24 h，棄去上清， 用PBS洗滌一次，37'C乾燥45min， -20°<:冷凍45 min，再以冷的無水乙醇4'C固定45 min, PBST洗滌 3次；分別加入50 nL 1:40稀釋的豬抗PCV2血清(a)和豬抗PPV的血清(b)， 37。C作用1 h，用PBST洗 滌3次；加入1:100 FITC-SPA， 37。C作用lh，洗滌3次；顯微鏡觀察。重組腺病毒rAd-ACap-AVP2 呈現較強的螢光，而細胞對照孔(c)沒有螢光出現(圖10)。說明重組腺病毒rAd-ACap-AVP2在細胞 中表達了 PPV: AVP2和PCV2: ACap蛋白。
② 蛋白質印記
用8。/。PEG-6000濃縮重組腺病毒HEK-293A細胞培養物，同時設定正常HEK-293A細胞培養物為 對照。將上述濃縮蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉印到硝纖膜後，10%脫脂乳封閉過夜；加入1:40豬抗 PCV2血清和豬抗PPV的血清室溫作用2h;洗滌3次，加入l:20000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊 抗豬IgG，室溫作用1.5h;洗滌4次，加入化學發光法顯色液(DAB)，觀察特異蛋白條帶。濃縮的重 組腺病毒經電泳轉印顯色後顯示， 一抗為豬抗PPV血清或豬抗PCV2血清時，在66KD處均有一條明 顯的條帶，而對照正常的HEK-293A細胞沒有(圖11)，說明重組腺病毒在細胞中表達了ACap-AVP2 蛋白。
③ 嵌合病毒樣粒子的粗純化與電鏡觀察
收集病變細胞，用PBS洗兩次，1000 r/min離心15 min，重懸於50 mmo1/1 NaHC03中，超聲波 裂解後，24 000r/min離心15min，上清液中含有表達的嵌合蛋白。收集的上清中加入硫酸銨至終濃度 20%, 4°C攪拌過夜進行沉澱，然後離20 000 r/min離心10 min，沉澱重懸於中，透析除鹽即為 嵌合病毒樣粒子的粗提物。腺病毒野毒做同樣處理後做對照。加入1:10稀釋的豬抗PPV血清37°C作用1 h後再4'C過夜，以12 000 r/min離心90 min，沉澱重懸於少量水中，用3%的磷鴇酸 負染後經透射電鏡觀察。在電鏡下可以看到大量病毒樣粒子存在，呈圓型，直徑為30nm左右，其形 態大小均與全病毒粒子相似(圖12)，說明重組腺病毒rAd-ACap-AVP2在細胞中表達的ACap-AVP2 蛋白能自我組裝成病毒樣粒子。
紅細胞凝集試驗
參照《動物病毒學》，使用0.7%豚鼠紅細胞的生理鹽水懸液。重組腺病rAd-ACap-AVP2 血凝效價為1:64，空的腺病毒野毒沒有血凝活性，說明rAd-ACap-AVP2表達ACap-AVP2蛋白保持PPV
原有的生物學活性。
5)小鼠免疫實驗
① 免疫程序
6-8周齡的雄性小鼠60隻，隨機分為2組，每組30隻。第一組背部皮下多點注射101TCID50 重組腺病毒rAd-ACap-AVP2;第二組每隻小鼠皮下注射101Q TCID5fl重組腺病毒rAd-Cap;第三組每 只小鼠皮下注射IO1。 TCID5。沒有外源基因的空的腺病毒作為陰性對照；第四組每隻小鼠皮下注射適量 的PBS作對照；兩周後進行相同的免疫。分別在首免、首免後14， 28， 35， 42， 49和56天，採集血 清測定PCV2抗體及PPV/PCV中和抗體。首免後28， 42和56天，每組宰殺3隻小鼠，取其脾臟，分 離淋巴細胞，測定淋巴增殖能力。
② ELISA抗體的檢測
PCV2 0RF2原核表達產物(本實驗室製備)經His-band純化試劑盒純化，測定蛋白的平均濃度 為1.10mg/mL。由ELISA方陣試驗可以得出，當抗原包被濃度為1.8 ng/mL，抗體稀釋100倍， 一抗 37'C分別孵育1.5h，酶標二抗37r孵育45min，加TMB-H202 (四甲基聯苯胺-過氧化氫)溶液顯色， 37'C反應10-15 min。加2MH2S04溶液，終止反應，50nL/孔。反應條件比較合適，此時P/N值較大， 且f月性血，的pD值較小，即非特異性比較/J二。結,判^_: Pi-N^XH5時實，有效。(樣品OD值-Ni)/(P^-Ni)20.45陽性；(樣品OD值-Ni)/(P^-N^〈0.45陰性。其中pi表示陽性對照平均 值；N 表示陰性對照平均值。
間接ELISA抗體檢測結果rAd-ACap-AVP2免疫組小鼠在首免後第14天能檢測到PCV2特異性 抗體，抗體的滴度隨著時間的延長而增高，在二免後35天時ELISA杭體水平達最高為1:10000，明顯 高於rAd-Cap免疫組；而空的腺病毒和PBS免疫組小鼠沒有產生PCV2特異性抗體(圖13)，說明表達
嵌合病毒樣粒子的重組腺病毒具有良好的免疫原性，免疫動物後可誘導產生特異性免疫保護反應。
③ 中和抗體的檢測
用IFA檢測PCV2的中和抗體。具體方法如下小鼠血清56。C滅活30 min， 12000 r/min離心10 min， 取上清，用含2。/。FCS的1640培養基按1:4， 1:8， 1:16， 1:32和1:64倍比稀釋病毒PCV2被稀釋為 2000 TCID5。/mL;上述血清和病毒的稀釋液各取50 ^L,混合均勻，37。C水浴1 h;取出後加入已長滿 細胞單層的PK-15細胞，每孔100pL，每個血清稀釋度接種四孔，同時設定只接種病毒PCV2的陽性 對照孔和正常細胞陰性對照孔，37t靜置培養72h。按常規方法進行IFA實驗，以減少70%或更多熒 光的血清最高稀釋度的倒數為中和抗體滴度。在IFA中，所有陽性對照細胞均出現明顯的螢光，陰性 對照無螢光，而加入免疫小鼠血清的孔沒有或僅有微弱的螢光。同一組在不同時間中和抗體滴度不同， 首免後14天所有小鼠中和抗體滴度均<4，到二免後35天rAd-ACap-AVP2免疫組的中和抗體平均滴 度為16，高於rAd-Cap免疫組(12);空的腺病毒和PBS免疫組中和抗體滴度幾乎為0。
用TCID5Q降低試驗測定PPV的中和抗體。具體方法如下小鼠血清56'C滅活30 min, 12000 r/min 離心10min，取上清，用含2。/。FCS的1640培養基按1:4, 1:8， 1:16， 1:32和1:64倍比稀釋;病毒PPV 被稀釋為2000TCID5o/mL;上述不同稀釋度的血清和病毒的稀釋液等體積混合，37'C水浴1 h;取出接 種40 50%融合的PK-15細胞，每孔100 nL,每個血清稀釋度接種4孔，同時設定只接種病毒的PK-15 陽性對照孔和正常細胞陰性對照孔。37'C靜置培養4-5天；顯微鏡觀察。能100%抑制病變的血清最高 稀釋度的倒數為中和抗體滴度。所有陽性對照細胞均出現明顯的細胞病變，陰性對照細胞均沒有出現細胞病變rAd-ACap-AVP2免疫組PPV中和抗體滴度判定為20。rAd-Cap免疫組，空的腺病毒組和PBS 對照組中和抗體滴度幾乎為0。
④淋巴細胞轉化試驗
宰殺小鼠，無菌取其脾臟，剝離結締組織，置於無菌平皿中加入少量的無菌PBS，用針頭刺脾 髒，然後用彎針頭擠壓，擠出其中的細胞；用彎針頭研磨均勻，棄去多餘的結締組織和大的組織塊； 在10mL的離心管中加入6mL的淋巴細胞分離液，再輕輕地加入研磨地組織勻漿液；2000 r/min離心 15 min:取中間雲霧狀的白色細胞層，置於新的離心管中，加入適量的Hank'液；2000 r/min離心1 0 min; 棄上清，加入適量的含10%FCS的1640營養液重懸細胞，然後進行細胞計數；根據計數結果將細胞濃 度調整為5 x 106/mL，加入96孔細胞板中，每孔100 細胞懸液，每隻小鼠鋪12孔；其中4孔加入 終濃度為20 pg4iL的ConA，另4孔加入終濃度為15 ng/pL的LPS，其餘4孔作為陰性對照；37°C， 5%C02靜置培養44 h;每孔加入20 nL MTT(濃度5 mg/mL),培養4 h;棄去上清，每孔加入100 DMSO， 使結晶溶解，振蕩；測定OD57。nm，計算ConA刺激孔地平均OD57Qnm/未刺激孔的平均OD57。nm ( SI 值)。用t檢驗法檢驗免疫組和對照組的SI值差異是否顯著。二免後14天，四組的刺激指數(SI)接近， 從第二次免疫後28天到42天rAd-ACap-AVP2免疫組的SI值迅速升高，而Wild Ad和對照組的SI 值變化不大，經t檢驗分析二免後28至42天免疫組和對照組的SI值差異極顯著((PO.Ol)，說明重組 腺病毒rAd-ACap-AVP2能增強小鼠細胞免疫(圖14)。
本發明構建的重組腺病毒表達的嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]，具有良好的免疫原性，免 疫動物後可誘導產生保護性免疫反應。嵌合病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]作為一種蛋白質載體多價重組 疫苗不但安全性高、價廉，而且可以有效的預防PCV2感染及由PCV2與PPV混合感染而導致的PMWS 的發生，是一種新型的安全有效的後選疫苗。序列表
江蘇省農業科學院
〈120〉表達外源基因的重組豬細小病毒VP2病毒樣粒子
說明書
00
2008-03-25
〈160〉 7
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
<211〉 24
<212〉 腿
人工合成
<220〉
引物P1
〈222> (1).,(24) 〈400〉 1
gaggtaccgg gggggttggt gtgt 24
<210〉 2
<211〉 29
<212〉 醒 〈213〉人工合成 〈220〉
<221〉 引物P2
<222〉 (1). . (29)
<223〉 2
cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
3
27
<212〉 D貼 〈213〉人工合成 〈220〉
〈221〉 引物P3
<222〉 (1)..(27) 〈223〉
〈400〉 3
ctggtaccat ggtccaccgc ccaggag 27
〈210〉 4
26
<212〉 醒
<213〉人工合成

引物P4
(1)..(26)
〈223〉 4 cagctsgccg ttaccgctgg 3gaagg 26
<210〉 5
〈211〉 24
<212〉 腿 人工合成 <220〉〈221〉 引物P5
<222〉 (1),.(24) <223〉
5
gagctagcgg gggggttggt gtgt 24
6
27
腿
<213〉人工合成
〈220〉
<221〉 引物P6
(1)..(27)
<400〉 6
cggctgcagc tagtataatt ttcttgg 27
7
29
<212〉 腿
〈213>人工合成
<220〉
引物P7
<222〉 (1)..(29)
7
cgggcggccg cctagtataa ttttcttgg 29
權利要求
1、表達外源基因的重組豬細小病毒(PPV)VP2病毒樣粒子，其特徵在於，是利用腺病毒表達系統表達PPV VP2C端1640bp基因片段ΔVP2而構建成的重組PPV VP2病毒樣粒子。
2、 根據權利要求1所述的重組病毒樣粒子，其特徵在於，是由以下方法構建而成的1) 獲取AVP2目的基因並克隆入pMD19-T載體以GenBank中NADL-2基因登錄號為NC:001718基因序列為模板，用軟體Primer 5.0設計引物 P1 5 '-gaggtacc鵬ggggttggtgtgt-3' P2 5 '-cgggcggccgcctagtataattttcttgg-3'分別加入《/wl禾口 Wo/I酶切位點，以P1， P2引物擴增PPV弱毒株NADL-2的DNA，擴增含VP2 基因1740 bp中的C端1640 bp片段AVP2，擴增的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳後，回收並將其 與pMD19-T Vector連接，轉化￡.co//DH5a，鹼裂解法提取質粒，K/wI和Mwl雙酶切鑑定，獲得陽性 質粒pTAVP2;2) 重組質粒pAd-AVP2的構建與鑑定利用雙酶切位點A^/IMfe/I將目的片段克隆至穿梭載體pShuttle-CMV中；用A^"IM/oH雙酶切及 測序分析進行鑑定，命名為rShuttle-厶VP2;用Pme I酶切該重組質粒，使其線性化，然後與pAdEasy TMVector在1.8 kV、 25 和200 Q條件下電轉化至大腸桿菌A/5/W感受態細胞，使rShuttle-AVP2 與pAdEasy Vector發生同源重組，轉化至DH5(x宿主菌，挑選出陽性克隆，用PCR，屍czcl酶切鑑定 重組是否正確，構建成重組質粒，命名為pAd-AVP2。3) 重組PPV VP2病毒樣粒子的獲得將重組質粒pAd-AVP2轉染轉染HEK-293A細胞，獲得重組腺病毒pAd-AVP2，重組腺病毒表達 的AVP2蛋白在該重組腺病毒感染的HEK-293A細胞中自我裝配成病毒樣粒子PPV:VLPs，即為構建 的在腺病毒表達系統中表達外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子。
3、 權利要求1或2所述表達外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子作為抗原轉運載體的應用所獲 得的產品。
4、 根據權利要求3所述重組PPV VP2病毒樣粒子作為抗原轉運載體的應用所獲得的產品，其特 徵在於，將表達2型豬圓環病毒PCV2 Cap的165-200位胺基酸基因ACap嵌合在權利要求1或2所述 PPVVP2病毒樣粒子AVP2的N端，然後克隆到腺病毒表達系統中所獲得的病毒樣粒子或疫苗產品。
全文摘要
本發明涉及表達外源基因的重組豬細小病毒(PPV)VP2病毒樣粒子的構建及應用，屬於基因工程疫苗領域。將PPV VP2基因的C端基因片段克隆於人5型腺病毒穿梭載體，獲得重組腺病毒rAd-ΔVP2，ΔVP2蛋白成功的高效表達，並能自我裝配成病毒樣粒子[PPV:VLPs]。以PPV VP2病毒樣粒子作為抗原轉運載體，將2型豬圓環病毒核衣殼蛋白(Cap)基因嵌合在PPV VP2基因的N端，獲得重組腺病毒rAd-ΔCap-ΔVP2。嵌合的VP2(ΔCap-ΔVP2)蛋白成功的高效表達，並能自我裝配成病毒樣粒子[PPV:VLP(PCV2)]。本發明還涉及該重組病毒及其表達外源基因的重組PPV VP2病毒樣粒子在疫苗免疫等方面的應用。
文檔編號C12N15/861GK101289657SQ20081002464
公開日2008年10月22日 申請日期2008年3月28日 優先權日2008年3月28日 公開號200810024643.發明者何孔旺, 俞正玉, 倪豔秀, 呂立新, 張雪寒, 溫立斌, 潘群興, 琦 肖, 茅愛華, 郭容利, 黃克和 申請人:江蘇省農業科學院 被以下專利引用 (4),