基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片的製作方法

2023-05-14 20:27:26

專利名稱：基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片，屬 於分析測試領域。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是由梅毒螺旋體(T. pallidum, TP)引起的一種性傳播疾病 (Sexually transmitted disease, STD)。在自然情況下梅毒螺旋體只感染人類， 人是梅毒唯一傳染源，主要通過性接觸傳播。另也可通過胎盤垂直傳播，引起 胎兒先天性梅毒。少數人也可經輸血感染。80年代以來，梅毒在我國再次死灰復 燃,據全國性病控制中心統計,我國梅毒發病率年增長率達52.7%，且先天性梅毒 和神經梅毒發病率增加明顯，在全球亦有逐漸上升的趨勢，梅毒不僅已經成為 世界性的嚴重社會和公共衛生問題，而且也是危害人群健康的主要疾病之一。 因此，選擇簡單、快速、高敏感性和特異性診斷方法和試劑，對梅毒早期診斷, 發現傳染源，控制梅毒傳播具有重要意義。
目前常用的梅毒診斷方法有病原學檢查、非梅毒螺旋體抗原血清試驗、梅 毒螺旋體血球凝集試驗(TPHA)、聚合酶鏈反應(PCR)和TP快速檢測試紙條 等。病原學檢査的原理是取患者損害的滲出物或淋巴結穿刺術得到的組織液， 觀察螺旋體的特徵性形態和運動方式，在理論上對早期梅毒有較高的檢出率， 但受到條件的制約(包括就診用藥、高質量的螢光顯微鏡、試劑和技術等)也 較多，因此實際檢出率並不高。非梅毒螺旋體抗原血清試驗的原理是目前診斷 梅毒常用的血清學初篩試驗，在很多文獻中都提到非梅毒螺旋體抗原血清試驗雖然簡易、快速、易於觀察結果，適合於大量人群的血清篩査，但敏感性、特 異性較差，有時會出現生物學假陽性和假陰性反應，容易造成漏檢和誤檢，所
以不適合用於一期梅毒、先天梅毒、神經梅毒的診斷。TPHA雖然其敏感性和 特異性高，主要被用於梅毒確診試驗，但對療效觀察意義不大。TP快速檢測試 紙條雖克服了檢測對間長、試劑昂貴等缺陷，但國內暫時未有詳細報導其靈敏 性和特異性效果，因此不可用於確診試驗。PCR法是較新的診斷方法，它能對 生殖器潰瘍進行早期鑑別診斷，區分梅毒、生殖器皰疹及軟下疳。但當前診斷 梅毒的PCR法仍存在引物的非特異性、對血清/全血等敏感性低等缺點。而且當 皮損開始癒合、分泌物減少、血清學試驗陽性反應時，採用PCR方法就不合適。 另外，PCR方法易受標本中的組織和細胞碎片等物質抑制，導致PCR假陰性結 果，所以PCR檢測不宜用作判愈。
非梅毒螺旋體抗原血清試驗、TPHA、以及PCR和TP快速檢測試紙條等檢 測方法均屬於免疫分析。以上免疫分析本身有很強的選擇性，對傳染病的早期 診斷，判斷療效及預後等方面均有重要的意義。然而重大傳染病的檢測非常復 雜，傳統的免疫分析通常只針對單一抗體進行檢測。由於一種診斷抗體可出現 在不同致病菌，或不同診斷抗體可在同一致病菌同時出現，因此，開展高效的 多重免疫分析方法(SMIAs)，從生物相關性的角度真實地定性、定量反映各 種致病菌抗體的種類和數量，在早期預防和聯檢多種傳染病、判斷傳染病菌發 展程度、觀察和評價治療效果等方面都具有重要的醫學價值。
電化學免疫傳感器具有自動化程度高、廉價、易製備、快速靈敏等獨特優 勢，配合免疫反應的高效專一，非常適合構建重大傳染病多重免疫分析檢測的 分析儀。有"生命科學集成電路"之稱的微流控晶片(lab-on-chip)是構建微型 化、集成化的電化學免疫傳感器的理想技術。微流控晶片技術是將採樣、預處理、加試劑、反應、分離、檢測等集成在一塊微晶片上完成的一門前沿技術， 具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、汙染小、操作費用低、儀器使用簡
便等優點。且非常適合工業化生產。微流控技術代表著21世紀分析儀器走向微
型化、集成化的發展方向。構建適合於重大傳染病檢測的微流控安培檢測晶片
具有以下優勢(1)通過微加工技術很容易在晶片上集成多個檢測通道和檢 測電極，做到多目標物同時分析，技術可行性高。(2)通過微流動注射技術， 樣品在管路中流動保證了電極表面時刻更新，較好克服了電極易被汙染，造成
假陽性率高、結果平行性差等問題。(3)微流控傳感器上管路直徑只有pm級， 反應池體積也只有(jL級，分析時所需試劑用量極少，分析物到達電極表面的擴 散距離短、因此可以大大減少溫育時間，實現快速聯檢目標。(4)目前微流 控傳感器多基於光學檢測系統，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成本 很高，限制了其推廣。而傳感器中採用電化學檢測，體積小、自動化程度高、 成本低。
目前，在微流控晶片技術領域，利用梅毒多種特異性抗原來同時檢測、快 速診斷多種梅毒抗體的相關技術和方法尚未見報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是，在微流控晶片技術這樣一個總的技術框架 內，研發出一種能夠利用梅毒多種特異性抗原來對多種梅毒抗體進行同時檢測、 快速診斷的專用微流控晶片及其檢測方法。
本發明通過如下方案解決所述技術問題，該方案提供的裝置是一種基於電 極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片，該微流控晶片的結構包括貼合 裝設在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控晶片的蓋片以及微流 控晶片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯通， 管道的另一端與餘下的一個池狀物聯通，以及，依序分別裝設在所述管道內不 同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由導電性電極以 及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性抗原的金膠敏感膜構成，本案 特別之處在於，所述管道的構造呈並聯構造，所述呈並聯構造的管道由四條分 支管道並聯構成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電極的裝設 位置分別位於所述四條分支管道內，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜 結構中的特異性抗原物質分別是對梅毒抗體能特異性結合的四種梅毒抗原物
質，該四種抗原物質分別是梅毒特異性抗原TP0684、TP0453、TP0821及TP0319， 以及，每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。
所述微流控晶片結構中的所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體 通道，其內徑尺寸均可以是任意選定的尺寸，但是，出於儘量少用待測液樣以 及降低試劑損耗等方面的考慮，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流 體通道最好均選用毛細管級的通道，所述毛細管級的通道意即毛細管通道，其 內徑與通常意義上的毛細管的內徑相當。所述毛細管其內部通道的橫截面形狀 可以是任意的形狀，所述橫截面形狀例如圓形、橢圓形、方形、矩形、條形， 當然也可以是任意的存在彎曲的線形，並且，所述毛細管的內部形狀隨著管道 的延伸，不同部位的橫截面形狀也可以允許是不同的形狀。僅就毛細管一詞而 言，其技術含義是公知的。
所述金膠敏感膜是將殼聚糖金膠溶液與梅毒特異性抗原溶液充分混合均 勻，噴塗在設定的結構部位，並使其乾燥成膜而成。所述金膠敏感膜已包含為 固定上述各梅毒特異性抗原而引入其中的輔助性介質，所述輔助性介質例如殼 聚糖、醋酸纖維素、明膠其中的一種或它們的混合物。結構中涉及的對電極以及參比電極均為微小尺寸的電極，其電極形狀均可 以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方片形狀、矩形片狀、條狀或 圓形片狀等等。
本案晶片中的工作電極呈串珠狀，其串珠狀電極外形有助於大幅度地擴展 它的有效工作界面，並且，進一步地，串珠狀形貌還使得該工作電極具有良好 的擾流性，這有助於強化工作電極與流經其周邊的被測物液流之間的接觸。
本案微流控晶片結構中涉及若千個池狀物，所述池狀物是用於過渡性儲液 的池形或囊形構造，其中的每一個池狀物的內腔其形狀均可以是任意選定的形 狀，所述內腔形狀例如圓柱形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀或球形空 腔狀等等。所述池狀物的尺寸可以是任意選定的尺寸，但是，為了能夠儘量少 用待測液樣以及降低試劑損耗，所述池狀物最好是能夠與毛細管匹配的微小型 的池狀物。
本案裝置當然還可以進一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學工作 站以及微流動泵等等，所述多道電化學工作站的技術含義以及微流動泵的技術 含義是公知的。本案微流控晶片結構中涉及的各個工作電極以及對電極以及參 比電極等，可以分別經由相應的專用串線與所述多道電化學工作站的相應接口 進行聯接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學工作站的各相 應接口進行相互聯接的專用電纜。所述微流動泵專用於驅動微量液體流動，所 述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述池狀物聯通。
所述形貌呈串珠狀的工作電極，既可以是一體化壓製成型的串珠狀導電性 電極，也可以是澆注成型的串珠狀導電性電極；所述工作電極其結構當然也可 以允許是導電性的磁珠串結構，在這一情形下，所述形貌呈串珠狀的工作電極 其材質是具有導電能力的四氧化三鐵材質，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電極是由許多的四氧化三鐵材質的磁珠在外加磁場條件引導下相互拼接而成的準 一維導電性電極。
所述形貌呈串珠狀的工作電極，即所述磁珠串結構的工作電極，其結構中 的磁珠直徑不限，所述磁珠的直徑可以是根據需要設定的任意的尺寸，但是，
所述磁珠的優選直徑範圍是介於20納米至2000納米之間，以及，每一個所述 工作電極的結構中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數可以允許是根據需要 設定的任意的個數，所述個數不限，但是，構成一個所述工作電極的磁珠的個 數的優選值是在100個至100000個之間。
鑑於每一支所述串珠狀工作電極佔用的空間寬度較小，該工作電極能夠允 許被直接安置於毛細管通道內，相對窄小的流體通道更有利於展現串珠狀電極 的對周邊流動液體的擾動能力，並且，還有利於將其有效工作界面的潛力充分 發揮出來。
通過噴塗或點樣儀點樣或其它合適工藝塗布裝設於所述工作電極表面層的 所述金膠敏感膜，其膜層厚度可以允許是任意設定的可對待測樣液發生電性信 號響應的厚度，但是，推薦的厚度或者說是優選的厚度是介於10納米與200 納米之間。
本案微流控晶片的使用方法
採用外加微泵驅動液流在四通道微流控晶片的毛細管通道中穩定流動，利 用四通道電化學分析儀器分別對四種梅毒診斷抗體加以檢測。 本案微流控晶片的具體檢測使用步驟如下-
1、 在微管路中加入血清樣品液，在外加微泵驅動下，各種梅毒抗體分子 被各通道中電極表面上金膠敏感膜包埋的相應梅毒特異性抗原捕獲。
2、 加入辣根過氧化物酶標記的酶標二抗，通過夾心法結合酶標"二抗"形成免疫複合物。
3、 採用多通道電分析儀，加入鄰苯二酚等電子媒介體，採用安培法檢測"二
抗"上酶引起H202還原的電流變化，由此獲得各分析物的種類和含量。
4、 將結果進行綜合分析，對梅毒抗體進行綜合診斷。
有必要在這裡作一個看似多餘的補充說明抗體與抗原是彼此相關的但又
不同的物質，它們之間的相互關係，通俗一點地比喻，就好比是一套鎖具中的 鎖與鑰的關係。
本發明的優點是，在一塊微流控晶片上集成了分別包覆有四種梅毒特異性 抗原物質的四個串珠狀工作電極，該四個串珠狀工作電極分別針對檢測梅毒的 四種特徵診斷抗體，本案微流控晶片是一種能夠利用梅毒多種特異性抗原進行 同時檢測的梅毒診斷專用微流控晶片，其集成構造的結構特點決定了該晶片的 使用有助於加快梅毒診斷速度、提高診斷準確率、降低梅毒診斷費用，晶片結 構中的工作電極其串珠狀形貌還有助於強化工作電極與被測樣液流相互之間的 流動衝擊和化學接觸。


圖1是本案微流控晶片實施例構造示意圖，所展示的是該例結構的俯視角 度下的透視的形態，圖中未描繪出所述附件，圖中也未對所述串珠狀工作電極 的結構細節進行放大的詳細的描繪。
圖中，1、 2、 10分別是三個裝設位置不同的池狀物，3是歧管狀流體通道， 4、 7、 11、 14分別是裝設位置不同但相互並聯形成並聯聯通結構的四條分支 管道，5是裝設在分支管道4內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質 為梅毒特異性抗原TP0684的串珠狀工作電極，6是裝設在分支管道7內的其表 層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質為梅毒特異性抗原TP0453的串珠狀工作電極，12是裝設在分支管道11內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原 物質為梅毒特異性抗原TP0821的串珠狀工作電極，13是裝設在分支管道14 內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質為梅毒特異性抗原TP0319的 串珠狀工作電極，8是對電極，9是參比電極。
具體實施例方式
在圖1所展示的本案實施例中，該微流控晶片的結構包括貼合裝設在一起 的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控晶片的蓋片以及微流控晶片的基片， 在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有管道，以及，三個池狀物，該三 個池狀物分別是池狀物1、池狀物2和池狀物10，所述管道的一端經由歧管狀 流體通道3分別與池狀物1以及池狀物2聯通，所述管道的另一端與餘下的一 個池狀物10聯通，以及，依序分別裝設在所述管道內不同位置上的工作電極 以及對電極8以及參比電極9，工作電極由導電性電極以及貼附在所述導電性 電極上的包埋了梅毒特異性抗原的金膠敏感膜構成，所述管道的構造呈並聯構 造，該呈並聯構造的管道由四條分支管道並聯構成，該四條分支管道分別是分 支管道4以及分支管道7以及分支管道11以及分支管道14，以及，串珠狀工 作電極的數量是四個，該四個串珠狀工作電極分別是串珠狀工作電極5以及串 珠狀工作電極6以及串珠狀工作電極12以及串珠狀工作電極13，其中，串珠 狀工作電極5是裝設在分支管道4內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原 物質為梅毒特異性抗原TP0684的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極6是裝設 在分支管道7內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質為梅毒特異性抗 原TP0453的串珠狀工作電極，串珠狀工作電極12是裝設在分支管道11內的 其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質為梅毒特異性抗原TP0821的串珠 狀工作電極，串珠狀工作電極13是裝設在分支管道14內的其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質為梅毒特異性抗原TP0319的串珠狀工作電極。圖1 中沒有繪出作為附件的微流動泵及多道電化學工作站等附屬件，也沒有詳盡展 示串珠狀工作電極的結構細節。本例結構中的各池狀物可以根據需要與作為附 件的微流動泵按任何方式聯通。本例結構中的各工作電極以及對電極以及參比 電極可以分別經由各自專用的電纜或曰串線分別與作為附件的多道電化學工作 站的對應電纜接口或曰串線接口聯接。
權利要求
1.基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片，該微流控晶片的結構包括貼合裝設在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是微流控晶片的蓋片以及微流控晶片的基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設有管道，以及，三個池狀物，管道的一端經由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯通，管道的另一端與餘下的一個池狀物聯通，以及，依序分別裝設在所述管道內不同位置上的工作電極以及對電極以及參比電極，所述工作電極由導電性電極以及貼附在所述導電性電極上的包埋了梅毒特異性抗原的金膠敏感膜構成，其特徵是，所述管道的構造呈並聯構造，所述呈並聯構造的管道由四條分支管道並聯構成，以及，所述工作電極的數量是四個，該四個工作電極的裝設位置分別位於所述四條分支管道內，以及，該四個工作電極其表層金膠敏感膜結構中的特異性抗原物質分別是對梅毒抗體能特異性結合的四種梅毒抗原物質，該四種抗原物質分別是梅毒特異性抗原TP0684、TP0453、TP0821及TP0319，以及，每一個工作電極其形貌均呈串珠狀。
2. 根據權利要求1所述的基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控 晶片，其特徵在於，所述管道以及所述分支管道以及所述歧管狀流體通道均為 毛細管通道。
3. 根據權利要求1所述的基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控 晶片，其特徵在於，所述形貌呈串珠狀的工作電極其材質是具有導電能力的四 氧化 三鐵材質，以及，所述形貌呈串珠狀的工作電極是由許多的四氧化三鐵材 質的磁珠在外加磁場條件引導下相互拼接而成的準一維導電性電極。
4. 根據權利要求3所述的基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控 晶片，其特徵在於，所述磁珠的直徑介於20納米至2000納米之間，以及，每一個所述工作電極的結構中所含有的相互拼接在一起的磁珠的個數在100個至 100000個之間。
5.根據權利要求1所述的基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控 晶片，其特徵在於，所述金膠敏感膜的厚度介於10納米與200納米之間。
全文摘要
本發明涉及一種基於電極修飾技術的梅毒診斷專用多通道微流控晶片，屬於分析測試領域。快速且廉價地診斷梅毒病患是相關診療技術進步的目標之一，本發明提供一種指向上述目標的微流控晶片。本案要點是，晶片內含有呈並聯構造的管道，該並聯構造含有四條相互並聯的分支管道，共有四個磁珠串工作電極分別裝設在所述四條分支管道內，所述磁珠串工作電極由磁珠串電極以及貼附在所述磁珠串電極上的包埋了梅毒特異性抗原的金膠敏感膜構成，該四個磁珠串工作電極表層的各自的金膠敏感膜分別包埋了四種不同的梅毒特異性抗原物質，該四種抗原物質分別是梅毒特異性抗原TP0684、TP0453、TP0821及TP0319。本案微流控晶片有助於提高梅毒診斷效率。
文檔編號G01N33/571GK101625359SQ20091015121
公開日2010年1月13日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者巫遠招, 寧 幹, 李天華, 李榕生, 欣 楊, 峰 王, 王魯雁 申請人:寧波大學