C型肝炎病毒體外複製模型及其構建方法與應用的製作方法
2023-05-14 21:45:51
專利名稱：C型肝炎病毒體外複製模型及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及C型肝炎病毒體外複製模型及其構建方法與應用，屬於病 毒學技術及醫藥生物技術領域。
背景技術：
C型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,簡稱HCV)是單股正鏈RNA病 毒，屬黃病毒家族。HCV引起的C型肝炎是一種嚴重威脅人類健康的傳染 病，全球統計有1.7億人受到感染，而且每年新增300 ~ 400萬例患者。由 於HCV容易變異，迄今還沒有疫苗問世，這使得C型肝炎的危害從某種意 義上說比B肝更為嚴重。
現有技術中，C型肝炎病毒基因組長約9. 6kb,由相對較長的5， NCR(341nt)、 一個大的開放讀碼框、較短的3， NCR及polyA或polyU構成。 HCV的5， NCR在所有HCV分離抹中是最保守的區域，屬非編碼區，含有內 在IRES,它可能介導多聚蛋白前體的帽非依賴性翻譯，屬調控單位；同屬 非編碼區的3， NCR對HCV的複製起重要作用。編碼區含有結構蛋白和非結 構蛋白，僅有一個起始密碼子，翻譯成一個多聚蛋白前體，由病毒和宿主 的酶分別對該蛋白進行切割；其中，來自宿主的酶切割ns3編碼的NS3病 毒酶類，再由病毒酶類對其它蛋白進行切割；ns5b基因編碼病毒的NS5B 蛋白，具有RdRp活性，是HCV複製的關鍵酶。HCV在細胞內的複製是以正 鏈為模板複製出其中間體負鏈，再以負鏈為模板複製出其正鏈，因此HCV 負鏈的存在是HCV複製的標誌。
現有技術中，HCV在被感染組織和血清中濃度較低，長期以來缺乏合適 的細胞培養系統和實用的動物模型。HCV體外感染細胞模型對於深入認識HCV病原學特點、病毒複製機制及 致病機理、HCV保護性抗原的鑑定、疫苗研製及特異性抗HCV藥物篩選等 是極為重要的工具。為此，國內外學者作了大量探索，主要有HCV感染細 胞模型和HCV轉基因細胞模型兩大類。HCV是一種嗜肝性病毒，人們首先 選用肝源性細胞來建立模型；此外，臨床上發現HCV還可以侵犯肝外組織 如外周血細胞、腎細胞、精子細胞等。但這些HCV複製模型中，普遍存在 複製率低、周期長、不能用常規核酸雜交技術^r測病毒複製，而僅靠RT-PCR 測定正、負鏈的合成。另外，人們試圖加強複製採用基因轉染的方法構建 的HCV複製模型大都沒有肯定的病毒顆粒形成。因此提高HCV在體外培養 細胞中的感染率，尤其獲得能夠傳代培養的適應體外細胞培養的毒株，為 HCV複製機制、藥物篩選和疫苗研製提供接近自然感染狀態的理想細胞模 型是本領域內研究人員急需解決的課題之一。
發明內容
本發明的一個目的在於提供一種接近自然感染狀態的C型肝炎病毒體 外複製模型。
本發明提供的C型肝炎病毒體外複製模型，是感染了人C型肝炎病毒的 體外培養細胞，其中的C型肝炎病毒來自C型肝炎患者血清。該C型肝炎 病毒體外複製模型是人C型肝炎病毒多次在宿主細胞上活化、傳代而獲得 的具有較高複製率的感染細胞。所述宿主細胞為哺乳類細胞，包括肝源細 胞、淋巴源細胞、腎源細胞、精子細胞等。其中優選宿主細胞為腎源細胞、 肝源細胞、淋巴源細胞。
本發明的另一個目的在於提供一種構建C型肝炎病毒體外感染複製模 型的方法。本發明提供的C型肝炎病毒體外複製模型的構建方法，是通過以下技
術方案實現的
1. 選擇一種病毒接種方法，將1個及以上C型肝炎病毒感染患者血清混
合，以振搖法進行接觸、吸附，以離心法進行培養。
2. 選擇一種培養基，該培養基含有促進C型肝炎病毒複製的鐵離子。
3. 選用感染細胞裂解上清液反覆感染正常宿主細胞，經多次培養以獲得具 有較高感染率、能引起細胞形態改變的C型肝炎病毒毒抹。
本發明所述的C型肝炎病毒體外感染模型的構建方法，具體有如下步
驟
(1) 篩選接種物；
(2) 篩選敏感宿主細胞林；
(3) 進行病毒接種與培養；
(4) 優化病毒培養條件；
(5) 細胞培養適應毒抹的獲得；
其中所迷步驟(1)是將一個或一個以上C型肝炎病毒感染患者血清混合； 所述步驟(2)中的敏感宿主細胞為哺乳類細胞，包括肝源細胞、淋巴源細 胞、腎源細胞、精子細胞的一種；所述步驟(3)是以振搖法常溫進行接種， 吸附後，離心法進行培養；所述步驟(4)是常規細胞培養基成分中含有 10-300)iM的鐵離子；所述步驟(5)是HCV感染細胞裂解上清液反覆感染 正常宿主細胞，並經多次培養以獲得體外細胞培養適應毒抹。
本發明優點在於本發明所述的C型肝炎病毒體外複製模型是採用現 有的病毒學技術，並在此基礎上對接種病毒的種類、接種方法、培養基成 分進行了改造，從而獲得能夠進行體外傳代，且能保持較高複製效率的C型肝炎病毒體外複製模型，並獲得了體外細胞培養適應抹。可以採用免疫 細胞化學及核酸雜交技術檢測到該複製模型中C型肝炎病毒特異性抗原的 表達及C型肝炎病毒正、負鏈的表達。
本發明所述的C型肝炎病毒複製模型的構建方法首次設計了上述(l)一
一(4)重要步驟篩選含高滴度的HCV-RNA陽性血清，採用離心培養法，獲 得的初次體外感染細胞裂解上清液再感染正常宿主細胞，並改變HCV培養 液中鐵離子濃度以提高複製率。本發明首次設計的上述(l)—一(4)步驟，其 方法簡便，切實可行；該步驟中的接種物選擇方式、接種方法，可以縮短 HCV感染時間；首次設計的該上述C型肝炎病毒培養基增加了體外細胞中 C型肝炎病毒的複製水平。本發明在上述步驟(2)中的細胞可以是肝源細胞、 淋巴源細胞、腎源細胞及精子細胞。
本發明的複製模型已通過鑑定，並利用其進行抗C型肝炎病毒藥物篩 選及疫苗研究。
圖1為C型肝炎病毒(HCV )感染細胞RT-PCR分析圖。
M: DNA Marker, DL2000; 1:正鏈RM的RT-PCR; 2:負鏈RM的 RT-PCR;
3， 4:對照細胞RNA的RT-PCR 圖2為C型肝炎病毒(HCV)陽性血清體外感染Vero細胞原位雜交結
果圖
A:正鏈探針原位雜交IO x, B:正鏈探針原位雜交25x
C:負鏈探針原位雜交IO x， d:負鏈探針原位雜交25x
圖3為C型肝炎病毒(HCV)陽性及陰性血清體外接種Vero細胞免疫細胞化學檢測圖。
A:陰性對照Vero細胞；B:感染Vero細胞 圖4 HCV陽性血清體外感染HepG2細胞免疫細胞化學檢測圖 圖5為感染細胞裂解上清感染正常Vero細胞原位雜交結果圖
A:正鏈探針原位雜交IO x， B:正鏈探針原位雜交25 x
C:負鏈探針原位雜交IO x, D:負鏈探針原位雜交25x
圖6為感染細胞裂解上清感染正常Vero細胞免疫細胞化學檢測圖。 圖7為復甦第8代HCV感染的Vero細胞免疫細胞化學檢測圖 圖8為獲得的適應抹HCV感染Vero細胞的形態 A:為正常短梭型Vero細胞，B:為感染長梭型Vero細胞
具體實施例方式
以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明 實施例l.C型肝炎病毒(HCV)陽性血清選擇
篩選醫院門診急性C型肝炎患者血清，經HAV、 HBV、 HDV、 HIV檢測為 陰性，未進行過抗病毒治療，螢光定量PCR檢測HCV-RNA效價〉l(^拷貝/ml 的2-3人份血清混合，過濾除菌後分裝，-8(TC存放。 實施例2.宿主細胞j妄種 1.實驗材料
(1) 細胞林Vero細胞，HepG2細胞，MA104細胞，HEK293細胞。 接種物HCV感染患者陽性血清，來自中國人民解放軍302醫院病毒室，3 人份，指標及定量檢測如實施例1所述。正常血清對照，經HAV、 HBV、 HCV， HDV、 HIV指標檢測為陰性。
(2) 實驗所用培養基及試劑細胞培養液含10。/。FBS的DMEM培養基;維持液，含2-5。/。FBS的DMEM培養基；感染培養液為含有不同濃度亞鐵離 子(疏酸亞鐵、氯化亞鐵或好u酸亞鐵銨等)的細胞培養液或維持液。 2.實驗方法
(1)對數期細胞以0. 25%胰酶+ 0. 02%EDTA消化，調細胞濃度為1 x 106個 /ml， 2ml加入35mm培養皿或6孔細胞培養板內(內置的蓋玻片備免疫細 胞化學測定及核酸雜交測定用)，5%0)2培養箱內24-48h。
(2〉病毒接種細胞長滿80%後，去除培養基，並以DMEM培養基洗滌2次， 以DMEM培養基稀釋陽性混合血清，終濃度10-20%,接種細胞表面，每 孔或皿O. 5ml，室溫輕搖30min， 37。C孵育後，加入含2%FBS的培養基 (維持液)，離心培養。棄接種物，換用含1(WFBS的感染培養液。5%C02， 37。C孵育2-5d。設陰性血清對照，和不加鐵離子對照。
(3) 實驗條件分別從離心速度，吸附時間、培養基中鐵離子濃度三方面 考察HCV感染率。轉速分別設Og/min， 600g/min， 1000g/min， 1500g/min， 2000g/min; 37。0及附時間分別i殳0 min, 30 min， 60 min， 90 min， 120 min ;亞鐵離子的濃度分別選用0yM， 10juM, 50juM， 75juM， 100juM， 150jliM, 200jjM， 300 yM。
(4) 採用實施例5方法測定
結果顯示轉速在600-2000 g/min， 37。C孵育時間在30-120 min，均 能夠縮短HCV感染的時間及穿入宿主細胞的量而不明顯改變細胞本身的狀 態；亞鐵離子在10-300 p M能夠增加HCV的複製。優選條件為轉速600-2000 g/min,孵育時間在60-90 min，亞鐵離子濃度為50-150 uM。在此條件下， 在所選用的細胞株均得到較高的感染率。
實施例3.巢式RT-PCR(nRT-PCR)法測定C型肝炎病毒(HCV)體外感染模型中HCV正、負鏈的表達
細胞經胰酶消化、冰預冷的PBS洗滌兩次，以100 ia 1的PBS懸浮。TRIZ0L 法提取血清和感染細胞的總RNA。
以HCV的保守區5 'NCR的cDM為模板設計內、外側引物，以總RNA 為模板，以外側下遊引物Rl反轉錄獲cDNA第一鏈，再以內測上、下遊引 物F2和R2擴增，獲正鏈RNA的RT-PCR產物；以RNA為模板以外側上遊 引物Fl反轉錄獲cDNA第一鏈，再以內測上、下遊引物F2和R2擴增，獲 負鏈RNA的RT-PCR產物。
如果HCV不複製，提取的總RNA中不存在負鏈RNA,則無法用Fl反轉 錄cDNA第一鏈，即測不到負鏈RNA的RT-PCR產物，反之亦然。結果見附 圖l及其
。
實施例4.原位雜交法檢測C型肝炎病毒(HCV)體外感染模型HCV正、負 鏈的表達
以帶有HCV-cDNA的質粒為模板，以不對稱PCR法製備單鏈DM，以德 國寶靈曼公司的地高辛標記試劑盒進行標記，製備DIG標記正、負鏈探針。 細胞爬片經多聚甲醛固定後，進行原位雜交測定，顯微鏡下觀察照相，陽 性信號為細胞內藍紫色顆粒。結果見附圖2及其
。 實施例5.免疫細胞化學法測定C型肝炎病毒(HCV)體外感染模型中HCV 抗原的表達
細胞爬片固定後，以抗HCV-NS3單克隆抗體為一抗，羊抗鼠HGP-IgG 為二抗，SABC法進行免疫細胞化學測定，顯微鏡下觀察，陽性信號為細胞 內棕色顆粒。結果見附圖3與附圖4及其
。 實施例6.連續傳代法測定C型肝炎病毒(HCV)感染細胞模型HCV的傳代使用實施例2方法得到體外第一代複製病毒，經傳代擴增後，將感染 細胞裂解，離心後上清，以10FFU/細胞的M0I感染正常貼壁後細胞，用與 實施例2相同HCV感染培養基培養，此為第二代，依次類推。原位雜交及 免疫細胞化學測定感染率，方法同實施例4與實施例5。結果該方法獲 得的病毒可傳10代以上。見附圖5、附圖6與附圖7及其
。 實施例7.瓊脂培養法測定C型肝炎病毒(HCV)感染細胞模型裂解上清液 的HCV感染率
感染細胞反覆凍融3-4次裂解細胞，離心後取上清為HCV液，以維持 液10倍比稀釋病毒，接種長成單層的細胞，接種方法同實施例2，稀釋度 為101 108，培養24h。
配製軟固體DMEM培養基，凝固前倒入上述細胞，37。C醉育繼續48h。 衝洗掉瓊脂，以PBS洗滌，進行免疫細胞化學測定，方法同實施例5，陽 性結果作半定量記錄，鏡下計數200個細胞中陽性細胞的數量。結果感 染細胞裂解上清中的HCV病毒量(MOI)〉10"FFU/ml ( multiplicity of infection, MOI; focus forming units, FFU)，即每毫升病毒液可形成 灶性克隆數目大於IO12。
實施例8.C型肝炎病毒(HCV)細胞培養適應株獲得
病毒接種並傳代6-8次後，更換含2-5°/ FBS, 50-150jaM亞鐵離子的 DMEM培養基維持培養，連續傳代該抹感染細胞，獲HCV體外細胞培養適應 抹，該抹病毒對宿主細胞引起形態學改變，即細胞由短梭型變成細長梭型。 方法同實施例4與實施例5。結果見附圖8及其
。 實施例9.抗病毒藥物對C型肝炎病毒(HCV)體外複製的抑制作用
使用實施例2方法，得到HCV感染模型，選用第三代病毒感染的細胞接種96孔板，細胞貼壁後，選取病毒唑、y-INF、 a2|3-INF及5 '非編 碼區的硫代反義寡核苷酸作為供試品，以各藥物無毒濃度進行藥物實驗， 作用7天終止，其間換液一次。使用實施例4、實施例5方法進行藥效測 定，灰度掃描定量測定藥效；以原位細胞ELISA方法及流式儀測定HCV的 抗原表達；結果表明，病毒唑對HCV的抑制率可達28%,病毒唑和y-INF 聯合用藥可達40%,硫代反義寡核苷酸可達55%以上。
實施例10.C型肝炎病毒體外複製模型在疫苗研製中的應用
將該模型獲取的病毒液以蔗糖密度梯度離心法進行純化，以1/3000 甲醛37。C滅活10d， PEG2000濃縮後，測定蛋白含量，以PBS稀釋成lmg/ml， 與福氏完全佐劑以1: l混合，免疫C57/BL小鼠，選擇背部、皮內、多點 注射，每個點O. lml。初次免疫後7d，同量加強免疫一次。肌肉或靜脈， 每點0.1-0. 5ml， ELISA法測定血清效價。取免疫血清進行病毒中和實驗及 細胞殺傷、病毒抑制實驗，以估測免疫血清的體液免疫保護及細胞免疫保 護效應。結果表明HCV的體液免疫保護能力較弱，即血清的病毒中和能力 較差，但能夠誘導較強的細胞免疫反應。 實施例11，C型肝炎病毒動物感染模型的構建
利用純化的病毒液靜脈注射經射線輻射及過量鐵離子處理的恆河猴， 跟蹤測定猴體內病毒量；取陽性猴血清繼續感染同種經預處理的動物。血 清學鑑定接種動物的轉氨酶、載毒量，肝穿刺測定肝組織的病理改變及HCV 的複製，結果表明利用該體外複製模型製備的HCV可以感染動物。
權利要求
1.一種C型肝炎病毒體外複製模型，其特徵是感染了C型肝炎病毒的體外培養細胞。
2. 根據權利要求l所述的C型肝炎病毒體外複製模型，其特徵在於宿主 細胞為哺乳類細胞，包括肝源細胞、淋巴源細胞、腎源細胞、精子細胞。
3. —種如權利要求1或2所述的C型肝炎病毒體外複製模型的構建方法， 包括以下步驟(1) 篩選接種物；(2) 篩選敏感宿主細胞林；(3) 進行病毒^l妾種與培養；(4) 優化病毒培養條件；(5) 細胞培養適應毒抹的獲得；其中所述步驟(1)是將一個或一個以上C型肝炎病毒感染患者血清混合； 所述步驟(2)中的敏感宿主細胞抹為哺乳類細胞，包括肝源細胞、淋巴源 細胞、腎源細胞、精子細胞的一種；所述步驟(3)是以振搖法常溫進行接 種，吸附後，離心法進行培養；所述步驟(4)是常規細胞培養基成分中含 有10-300 ia M的鐵離子；所述步驟(5 )是HCV感染細胞裂解上清液反覆感 染正常宿主細胞，並經多次培養以獲得體外細胞培養適應毒林。
4. 一種如權利要求1所述的C型肝炎病毒體外複製模型的用途，該模型用 於篩選抗C型肝炎病毒藥物。
5. —種如權利要求l所述的C型肝炎病毒體外複製模型的用途，該模型用 於C型肝炎病毒複製機制研究。
6. —種如權利要求l所述的C型肝炎病毒體外複製模型的用途，該模型用 於製備接種物，構建C型肝炎病毒動物感染模型。
7. —種如權利要求l所述的C型肝炎病毒體外複製模型的用途，該模型用於製備C型肝炎病毒免疫疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種HCV體外複製模型及其構建方法與應用，其目的是提供一種具有較高HCV複製率、能夠傳代培養並接近自然感染狀態的HCV體外感染細胞模型。同時提供了一種構建該體外複製模型的方法，即將幾種HCV感染陽性血清混合用離心法接種體外培養的細胞系，然後改變HCV培養基中鐵離子的濃度，使HCV高水平複製，經過多次病毒傳代，得到HCV體外複製模型。可採用免疫學方法及核酸雜交方法檢測。該模型可用於構建C型肝炎病毒動物感染模型、C型肝炎病毒複製機制研究、藥物篩選和疫苗研製。
文檔編號C12N5/08GK101298605SQ20071009729
公開日2008年11月5日 申請日期2007年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者周亞偉, 王玉梅 申請人:周亞偉