選擇性糖苷酶抑制劑、該抑制劑的製備方法和用途的製作方法

2023-05-14 12:55:46

61)，3.58(1H，dd4JK5,Htf=3.2H'5)，2.74~2.67(1H,叫H-7)，2.14(3H,s，OAc)，2.11(3AOAc)，2.09(3s，OAc)，L29(3H，仁J腿，m=7,60取H-8)ppm.3，4，6-三-0-乙醯基-l，2-二脫氧-2'-丙基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d]-A2'-漆唑淋《c」-&NMR(500MHz^CDC!3)S:6,26(1H,4Jmfh2-7.2取H-l)，5.58(1H，私■-3.3取H-3),4.96(1d，J,=9.2Hz^H4)，《54-4.50(1H，邁，H-2)，4.16-4.08(2叫H"6/HW)，3.58(1H,dd^JH5,H6-3.3取H-5)，2.70-2.58(2Ii叫H-7),2.14(3H;s,OAc)，2.08(3s，OAc),2.07(3H，s，OAc)，1.76-1.69(2H，m，H-8),1.00(3H，t，J,-7,4Hz，闊ppm.3,4，6-三-0-乙醯基-l，2-二脫氧-2'-丁基-ct-D-吡喃葡糖基-[2，l-d-A2'曙漆峻啉0必-!HNMR(500MHz^CDC13)S:6,21(1H，d,JHljH2-7.2取H-l),5.57(1H，d(Jffi賴=3,3取K-3),4.94(1H,4Jh4h5-9.4Hz,H4)，4.站4.44(1H-2)，4-124.07(2H,取H-6/H-6'),3,53(1H，dd4=3.0取H-5)，2,60-2.57(2H，rn^H-7),2.12(3H，s，OAc)，2.07(6s，OAc),L67-1.63(2氏H-8),1.40(2H，ddd,Jh93-7.3取H，9),0.92(3t>Ihio雅-7.4取H-10)ppm.3，4，6-三-0-乙醯基-1，2-二脫氧-2'-戊基-01-0-吡喃葡糖基-[2，1-(1^2'-瘞峻啉(》一-HNMR(500MHz^CDC13)S:6.24(1HJm>m-7.2取EM),5,60(1H，s,H-3),4.96(1It4J報,h5-9,4取H-4)，4.52-4.49(IH邁，H-2)，4*14>4,10(2&m,J恥,附'=12.2HzH"6/H-6')，3,56(1ftdd4Jhs^-3.1取Jeb脈=Hz，H-5)，2.65-2,60(2叫H-7),2.14(3H,s，OAc)，2.09(3Hs，OAc),2.08(3&s，OAc)，1.71-1.68(2H,m，H-S),1.38-1,33(4H,m，H-9/H-10),0.91(3H，t>Jmi,Hm3，4，6-三-0-乙醯基-1，2-二脫氧-2'-異丙基-"-0-吡喃葡糖基-[2，1-€1-厶2'-噻哇啉f8/>-!HNMR(500MHz^CDCI3)S:6.27(1H，d，Jhi,h3=7.2HzH-l)，5*60(1H，m，H-3)，4,97(1H，d，Jh4^hs=9.3Hz,H4)，4.55-4.49(Im，H-2)，4,1^4.U(2H，m，H-6/HA、)，3.60(1H,dd4〗hs,附=3.1Hz，H-5)，2.55(2H，s，H-7)，2,15(3H,s，OAc),2.09(3H,s，OAc),2.0S(3H，s，OAc)，1,07(6J朋^=6.6Hz,H-8),.3,4，6-三-0-乙醯基-1，2-二脫氧-2'-異丁基《"0-吡喃葡糖基-[2，1-(1-厶2'-噻唑啉Wg」-NMR(500MH^CDCI3)S:6.26(1H，4Jffl,h2-7.2取H4)，5,60(1H，Jh3沖=3,3Hz，H-3)，4.97(1Hd，J說,h5=9,3取H4),4.56-4,50(1H,H-2)，《164,10(2Hm，H-6/H^)，3.62-3.5S(1氏邊,Jh^6==3,1取H-5),2.57-2.52(2H3ra，H-7)，2.15(3H，s，OAc),2.09(3H，s，OAc>,2,08(3H，s，OAc)，L28-1.23(2H,iti，H-8)，1.02(6IUJ,-6.6H2;H-9)ppia2.2.41，2-二脫氧-2'-烷基-ot-D-吡喃葡糖基-[2，l-d]-A2'-噻唑啉(NAG遙唑啉類似物)(9a-g)合成的一般步驟向溶於無水甲醇中的適量被保護的噻唑啉(8a-g)溶液中加入一刮勺尖的無水曱醇鈉。將此鹼性溶液攪拌直至通過TLC分析判斷反應完全(一般2小時)。將冰醋酸的曱醇溶液(1:20)逐滴加入反應混合物中直至溶液的pH為中性。然後在真空下除去溶劑，用快速矽膠柱色譜法分離想要的物質(9a-g)，使用的溶劑體系是乙酸乙酯與曱醇，二者的比例範圍在2:1至6:1之間是適當的。分離產物的產率範圍是86至99%。1，2-二脫氧-2'-曱基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d]-A2'-噻唑啉(9a)已使用前述的相似的反應條件製備,。全部光譜特徵與文獻值一致，檢測時使用的樣品的元素分析結果也與文獻一致。QHu04NS的分析計算值；C，43.82;H，5.98;N，6.39;實驗值C，43.45;H，6.23;N,6.18。I,2-二脫氧-2'-乙基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d-A2'-噻唑啉(9b)-1！！NMR(500MHz，MeOD)S:6*31(1H,d,JH1,m=7.0私H-l)，4.29~4.26(1H，m，Jh^H3=4.32取H-2)，4,09(1H,d4J祐,h^4.32H-3)，3.70(1H，dd^J描,戰'=12,07取H-6)，3.57(1Hd《,3.52(1H，d4J稱,H5-9,10取H4)，3.32-3,29(2H,m，J出說-6*29取J出'恥=2二1Hz，H-5)，2.52(2H，dd，Jm'戰-7.59Hz，H-7)，U8(3H,仁H-8)ppm."CNMR(125MHz;MeOD)5:175,1,89.4,80.2,75,7,74.5，71.4，62,5,28,9,1Uppm;C^^O^NS的分析計算值；C，46,34;H，6.48;N，6.00;實驗值C,45.95;H,6.33;N，5.93，1，2-二脫氧-2'-丙基-ot-D-吡喃葡糖基-[2，l-d]-A2'-噻唑啉(9c)-1！！NMR(500MHz，MeOD)5:6.32(1H，d，JHltm=7.0取H-l)，4.28(1H,m，J,=4.4取H-2)，4.09(1H，dd，Jh3,h4=4.4HzH-3)，3.72(1dd，J戰,m'=12.0Hz，H-6)，3.59(1H,H-6')，3.53(1H，JH4,H5-9.1HzH'4)，3,33(1H,叫Jhs^-6,3Hz，Jhs,恥=2.5H2;H-5)，2.51-2.48(1&m，Jh7,hs=7.3Hz，Jh7,ht!4.9取H-7),2.49-2.47(1H，m，H-7，)，1.68-1.65(2Ii邁'1戰^=7.4Hz^H-8)O.訴(3H,dd，H-9);CI0H17O4NS的分析計算值；C，48.57;H,6.93;N，5.66;實驗值C,48.32;H,6.77;N，5,45.1，2-二脫氧-2'-丁基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d卜A2'-噻唑啉(9d)」HNMR(500MHz,MeOD)3:6'3i(H,4Jffl>i=7,0私H-l)，4,304.28(1H,m，Jm^=4.4H、2)，4.09(1械Jioh4=4.4Hz^H-3),3.71(1H，dd，J戰,戰'=12.0取H-6)，3.59(1Iid4H，6'〉,3.53(1賊JH4sH5=9'1Hz,H-4),3,35-3、3Q(1K，m，Jw,h6=6.3Hz，J把扭'=2,5Hz，H-5)，2,58-2.53(1Iim，JH7,冊=7.SHzJhtw-14.8Hz，H-7〉2.53-150(1H，m，Jh，-7.6Hz^H陽7》1.60(2Kddd,J股班-14.9Hz，闊1.37(2H,ddd,%柳-7,4，H-9)0,92(3H，H-!O)ppm.13CNMR(125MH2;MeOD)S:175.5，89.4，79,1,75.2，74.2,71.5，62.7,36.9，20.4，152ppm;CuH^04NS的分析計算值；C，50.55;H，7.33;N,5.36;實驗值C,50.68;H7,12;N，5.13.1,2-二脫氧-2'-戊基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d-A2'-噻唑啉(9e)」HNMR(500MH^MeOD)S:6.20(I&4Jhi,h2=6,9H-l)，4.29-4,27(1H，m，Jh2^=6,0Hz，H-2),4.09(1H,cHJ說h4-4.4Hz，H-3)，3,72(1Kd4Jh6,形'=12.0Hz，H-6)，3,59(1H，H^')，3.53(1H，dd，J別,h5=9.1HzH>4)，3,35-3.31(1H，m，J出,戰-6.3，JH5,H6.=2,4取H-5),2,52(2H，dd《Jm,朋-6.2Hz^H-7),1.37-1.32(2H，m,H-8),1.35-淺(2H,m，H國9)，1扁.63(2H，m，=7.1HzH40),0.90(3H,tH-l"ppm.13CNMR(125MeOD)3:i74.8,狄3,79.2，75.5，73.4,71.5,62,2，35.4,30.3,28.8,22.1，13,1ppm;Cl2H2104NS:的分析計算值；C，52.34;7.69;N，5.09;實驗值C，52.48;H'7.67;N，4.40.1，2-二脫氧-2'-異丙基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d卜A2'-噻唑啉(9f)-1！！NMR(500MHz，MeOD)S:6.31(i4JH1>m=7.0取H-l),4.29(H，m，Jm'h3=4.4取H-2)，"1(1H，dd^《4取H-3)，3,60(1H,私J華'-12.0Hz,H-6),3.72(1H,dd,H^6，)，3,55(1H，〗h4,ks=9.1Hz^H4)，3.35-3,32(1H，邊，Jhs雄^6.4Hz，％聊=2.4Hz>H-5),2.87-2,83(2H，JH7tHs-6.9Hz，H-7)，1'24(3H,d，H-8),1.21(3H，d，H-8')ppm.13CNMR(125MHz，MeOD)5:175,2,89.5,79,7，75.6，72.3,70.S，62.3，35.1,30.3，22.5，13.8ppm;C10H17O4NS的分析計算值;C48.57;H6.93;N5,66;實驗值C48.40;H6.70;N5.33.1，2-二脫氧-2'-異丁基-a-D-吡喃葡糖基-[2，l-d]-A2'-噻唑啉D(9g)」HNMR(500MHz^MeOD)S:6,38(1H,JH1>m=7,1Hz,H-l)，4.28~4.24(1H，ni，Jic4i3=6.0Hz，H-2),4.06(1d4Jro雄-6.0取H-3)，3.71(1lidd，J浙抓=12.0Hz^H-6)，3,58(！H，銀H-。，3.58(！H，JT^yc-92取H>4)，3.35-3.30(i&m,J出,別-6.3Hz,Jn5lW=2.4取H-5)，2.46"2.40(1Iim,Jh7>h8-7.3H2;Jh^t1-14.1取H-7)2,37-2,33(1H,叫JH7Mi8=7.3Hz,H-7')2.00(2H，ddd,=6.7Hz,H-8)0,97(3H，4H-9)ppm;CuHwO4NS的分析計算值；C，50.55;H,7.33;N，5.36;實驗值C，H7.12;N，5.13.2.3使用抑制劑9a-g的動力學分析2.3.1動力學分析的實驗步驟所有測試在37。C下進行30分鐘，並重複三次，該測試使用終止法，通過加入6倍過量的(150nL)驟停緩衝劑(200mM氨基乙酸，pH10.75)使酶促反應(25nL)驟停。測試是由注射器加入的酶(3pL)引發的，並且在所有情況下，所得的驟停溶液的pH值大於lO。j3-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的時間依賴性測試揭示了此時間段內兩種酶在各自的緩衝劑下都是穩定的；各自的緩衝劑為50mM檸檬酸，lOOmMNaCl,0.1%BSA，pH4.25以及50mMNaH2P04，100mMNaCl，0.1%BSA,pH6.5。上述反應的進度在30分鐘結束時用螢光法通過測量釋放4-甲基傘形酮的程度來確定，所述螢光法使用VarianCARYEclipse螢光光譜儀96孔板系統進行測定，並與相同緩沖條件下4-曱基傘形酮的標準曲線進行比較。使用368nm的激發波長和450nm的發射波長，狹縫開口為5mm。O-GlcNAc酶的可能的時間依賴性失活可通過以下方法測試將10mMSTZ與0.016mg/mL的O-GlcNAc酶在50mMNaH2P04，100mMNaCl，l%BSA,5mM卩-巰基乙醇的存在下，pH6.5時共同培養，或者將10mMSTZ與0.036mg/mLp-氨基己糖酶在50mM檸檬酸鹽，100mMNaCl，0.1。/。BSA的存在下，pH4.25時共同培養。經過一些時間間隔後測量裙二包含在失活混合物中的殘餘酶的活性。每種酶的測定以上述方法進行，除了反應是通過向測定混合物中加入一份反應混合物引發的，所迷的測定混合物中含有5.7mM的MU-GlcNAc和對應於每種酶適當的緩衝液。首先STZ的穩定性是用NMR跟蹤其在氘水中的分解測定的。室溫下5STZ在水溶液中的半衰期遠大於6小時，該時間是在室溫下用NMR3艮蹤其分解測定的。人胎盤P-氨基己糖酶購自Sigma-Aldrich(Lot043K3783)。O-GlcNAc酶的克隆及表達如文獻中描述185。兩種酶均使用PBS緩沖液透析，且用Bradford法測定其濃度。使用螢光底物的測試中|3-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的濃度(pg/nL)如下對於4-甲基傘形基2-乙醯氨基-2-脫氧-P-D-吡喃葡糖苷(MuGlcNAc)(5):0.00077，0.0126;MuGlcNAc-F(5a):0.0031,0.0189;MuGlcNAc-F2(5b):0.0154，0.0756，且對於MuGlcNAc-F3(5c):0.0154,0.01523。此夕卜，在使用濃度為0.64mM的底物5對抑制劑進行測定時，P-氨基己糖酶和O-GlcNAc酶的濃度(Hg/|iL)分別為0.0154和0.0378。所有抑制劑均是在從5倍至1/5倍K!範圍中的八個濃度下測試的，除了P-氨基己糖酶在抑制劑8e下的測試，由於8e的IQ值高，如此高的抑制劑濃度是無法達到的。IQ值通過迪克遜圖數據的線性回歸得到。有必要時，將測試重複三次並將誤差條包括在數據作圖中。2.3.2使用抑制劑9a-g的動力學分析結果對人P-氨基己糖酶抑制的分析揭示了增加的鏈長導致這些抑制劑有效性的顯著下降(附圖4和表2)。甚至包含一個亞甲基單元(化合物9b)也會導致與母體化合物NAG-噻唑啉(9a)相比，P-氨基己糖酶的Kj值增加460倍。鏈長的進一步增加還會導致IQ值的更大增加。但是，對於O-GkNAc酶情況卻顯著不同(附圖4和表2)。其對鏈長的增加的耐受性更強，且包含兩個亞曱基單元的化合物(9c)的IQ值(Kj==230nM)僅比測得的母體化合物NAG-噻唑啉(9a)(=70nM)的值高出3倍。由於化合物9f和9g是O-GlcNAc酶的良好抑制劑，脂肪鏈的支化也不消除結合。由數據的分析中可以看出，化合物9b、9c和9f都是O-GlcNAc酶的有效抑制劑，並且顯現出對O-GlcNAc酶優於對溶酶體氨基己糖酶的顯著選擇性。事實上，化合物9d對0-GlcNAc酶優於對卩-氨基己糖酶的選擇性的比例是3100倍，化合物9c的值是1500倍，化合物9f的值是700倍(圖2和表2)。2.3.3使用現有抑制劑的動力學分^f結果同樣測試了O-GlcNAc酶的現有抑制劑的抑制性質和選擇性。確定針對O-GlcNAc酶(IQ=1.5mM)和卩-氨基己糖酶(Kj=47mM)的STZ的K^值(表2)，並且針對O-GlcNAc酶的測量值與前面所得的範圍在1至2.5mM之間的ICso值是一致的42，461。由於STZ的N-醯基基團的體積，其對O-GlcNAc酶的抑制優於對P-氨基己糖酶的抑制作用的選擇性出人意料地有限(31倍)。可能由於噻唑啉化合物形成一個過渡態或緊密結合的中間體，其表現出比STZ具有更大的選擇性。我們也研究了可能的由STZ誘導的O-GlcNAc酶和P-氨基己糖酶的不可逆失活。不可逆抑制劑導致了由於失活劑修飾蛋白而使得酶活性的時間依賴性損失。為了首先檢查STZ在水溶液中的穩定性和市售物質的純度，用NMR監測新溶解在氘代水中的STZ的時間依賴性的分解。STZ隨時間分解的半衰期明顯大於6小時(見附圖7)。據發明人所知，新溶解的STZ在6小時內既沒有作為O-GlcNAc酶的時間依賴性的失活劑，也沒有作為P-氨基己糖酶的時間依賴性的失活劑(見附圖8)。我們還研究了PUGNAc的選擇性。使用O-GlcNAc酶測量了PUGNAc的IQ值(=46nM),並發現與前面確定的值(K屍50nM)較一致131。但是，該化合物沒有顯示出對O-GlcNAc酶與J3-氨基己糖酶(=36nM)相比的選擇性。這些數據也支持了上述的觀點，即氟取代的底物上N-醯基基團的體積並沒有極大地影響使用O-GlcNAc酶測量的類Taft分析的斜率(p=-0.42)。而根據式l,用溶酶體P-氨基己糖酶測得的斜率(p--l.O)貝'J看起來很可能是電子和空間效應兩者的結合。因此，所述反應對氟取代基的電子效應的靈敏度(P*)可能對兩種酶是相同的，但是溶酶體P-氨基己糖酶催化的反應對底物空間效應的高靈敏度(s)導致了p-氨基己糖酶的斜率比測得的O-GlcNAc酶的斜率明顯更陡。總之，類Taft線性自由能分析和選擇性抑制數據表明，O-GlcNAc酶的活性位點比溶酶體P-氨基己糖酶在底物上圍繞2-乙醯氨基基團的區域具有更大的空間。實施例3:選擇性O-GlcNAc酶抑制劑的第二個實施方案的設計與合成3.1第二類選擇性O-GlcNAc酶抑制劑的設計基於上述觀察，在PUGNAc的N-醯基側鏈上做出修飾以產生有效且有選擇性的基於另一種抑制劑骨架的O-GlcNAc酶抑制劑的第二個實施方案。這種抑制劑可具有不同的藥代動力學特性，且是在細胞和有機體水平上分析O-GlcNAc翻譯後修飾的作用的重要工具。3.2選擇性O-GIcNAc酶抑制劑的第二種實施方案的合成一系列六種使用PUGNAc作為骨架的抑制劑的合成被概括於路線3中。從易得的鹽酸鹽IO開始[931，將Boc基團引入用於保護胺部分，以生成四乙酸鹽ll1941(路線3)。用所得的四乙酸鹽ll，使用(NH4)2C03進行選擇性脫-0-乙醯化以高產率得到半縮醛12。用NH20H.HC1處理該半縮醛12以良好產率產生粗製E和Z肟13。下一步反應是氧化性閉環反應，Mohan和Vasella曾才艮道該反應非常不穩定(路線4)。formulaseeoriginaldocumentpage44complexformulaseeoriginaldocumentpage45路線4:當使用1，8-二氮雜雙環[5.4.0十一-7-烯(DBU)和N-氯代琥珀醯亞胺(NCS)使肟14氧化時，在加入NCS時仔細地控制反應混合物的溫度對避免形成不想要的1，4-內酯肟15是關鍵的[951。與這些考慮一致，多個使用14的試驗反應顯示，溫度確實是成功製備l，5-內酯將16、而不是不想要的1，4-內酯肟15的關鍵。事實上，在稍高的溫度(-20。C)下，只獲得1，4-內酯ltl5。根據上述路線3，在文獻報導的條件下使用DBU/NCS處理肝195，產生了一種想要的1，5-內酯17和不想要的1，4-內酯肝18的混合物，二者比例為4:1。但是，發現先將NCS加入含有13的溶液中，再向該混合物中加入DBU則只生成17，雖然產量稍低些。在此遇到的一個問題是從17中分離這些反應的一種副產物琥珀醯亞胺較困難。此外，由於從1Hn.m.r.光譜中獲得的信號變寬，17的光諝分析被複雜化。儘管如此，在快速色譜法純化後使用異氰酸苯酯處理不純的氬化肝內酯(hydroximolactone)17產生了高產量的純的氨基曱酸酯19。事實上，Boc保護基團被溶於二氯甲烷的無水三氟乙酸溶液溫和地除去。使用適當的醯氯處理上述所得的粗製胺鹽20生成醯胺21a-g的總產率良好。對21a和21b的詳細分析支持了該全部N-乙醯化的系列化合物的同一性。後續的使用飽和的氨在甲醇中對21a的脫-O-乙醯化生成了高產率的PUGNAc。22a也是由相似的方法從21b獲得的。為了突出這些轉化的簡易性，常規的中間體20可使用一系列醯氯處理，以生成粗製產物2lc-g。將這些粗製的中間體立即脫-O-乙醯化很容易生成產率良好的三元醇22b-f。3.2.1化合物合成的一般步驟所有溶劑在^f吏用前除水。合成反應由TLC監測，使用MerckKieselgel60F254鋁底薄板。通過使用溶於乙醇的10%的濃硫酸溶液在加熱下使化合物碳化而檢測化合物。正壓下的快速色譜是使用MerckKieselge160(230-400目)和特定的洗脫液實施的。！H和13C的NMR光鐠由BrukerAMX400在400MHz下記錄(對於13C是100MHz)，或者由VarianAS500UnityInnova光譜儀在500MHz下記錄(對於13C是125MHz)(適當時，記錄的化學位移是相對於CDCl3或CD3OD的)。所有在酶活測定中使用的合成化合物的元素分析是在SimonFraser大學或BritishCohumbia大學的分析實驗室進4亍的。3.2.2(E)-和(Z)-3，4，6-三-0-乙醯基-2-叔-丁氧基甲醯胺-2-脫氧-D-葡萄糖肟(13)的合成將鹽酸羥胺(3.2g，46mmol)加入半縮醛12,(12g，31mmol)和吡啶(6.3mL，77mmol)的甲醇溶液(200mL)中，將所得的溶液攪拌並回流(2h)。將該溶液濃縮並與曱苯(2x20mL)共蒸發。用EtOAc溶解剩餘物，並用水(2x50mL)、鹽水(50mL)洗滌，乾燥(MgS04)洗，再過濾並濃縮生成所設想的坊13(9.5g)。-使用剩佘物而不進一步純化。3.2.33,4，6-三-0-乙醯基-2-叔-丁氧基甲醯胺-2-脫氧-D-葡糖酸氫化肝(ghiconohydroximo)國l，5國內酉旨(17)的合成(a)-45。C下，將1，8-二氮雜雙環[5.4.01十一-7-烯(0.98mL，6.6mmol)加入粗製的肟13(2.5g，5.9mmol)的CH2C12(60mL)溶液中，並攪拌混合物(5min)。然後將N-氯代琥珀醯亞胺(0.87g，6.5mmol)以如下的方式加入溶液中溶液的溫度不超過-40。C，且所得的混合物在此溫度下攪拌30分鐘，然後在2小時的時間內升溫至室溫。將混合物用水使反應驟停並用EtOAc(100mL)稀釋。有機層#1分離並用水(2x50mL)、鹽水(lx50mL)衝洗，乾燥(MgS04)，過濾並濃縮。將所得的剩餘物進行快速色譜(EtOAc/己烷2:3),得到無色油狀的標題化合物17(1.7g，68%)。tH和"CNMR色諝顯示出該目的化合物，但已被1,4-內酯肟18和琥珀醯亞胺汙染。(b)-45°C下，將1，8-二氳雜雙環[5.4.0十一-7-烯(3.0mL，20mmol)以如下的方式加入肝13(7.7g，18mmol)和N-氯代琥珀醯亞胺(2.7g,20mmol)的CH2Cl2(110mL)溶液中溫度不超過-40。C，且所得的混合物在此溫度下攪拌30分鐘，然後在2小時的時間內升溫至室溫。然後，用(a)中的方式處理所述混合物得到標題化合物17(4g，52。/。t)。Rf0.16(EtOAc/己烷1:1);&(500MH^CI^OD):9.2(Zr&1&NOH)，5.33-5.18(m，3H，H3,H4,NH),4,604.52(m,1H，H2)，4.33(dd，3.5，2,5，1H,H6)，4.33(d4/=2.0，1H，H6)，4.19(ddd,/=9.5，1H，H5)，2,08(s，3H，CH3),2.03(s，3H，CH3)，2.02(s,3H，CH3)，1,40(s,9H，C(CH3>3).&c(125MH^CD3OD):171.5，170,5,170,3，169,0(4C,C=0),150.7(Cl)，76,5,72.4，67.3(3C，C3，C4，C5)，61.5(C6)，50.8(C2)，29,6(C(CH3)3)，28,2(C(CH3)3)，20.7,20,6,20.5(3C、CI^).3.2.4O-(3，4，6-三-0-乙醯基-2-叔-丁氧基甲醯胺-2-脫氧-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(19)的合成將異氰酸苯酯(0.5mL，3.7mmol)加入內酯17(1.3g，3.1mmol)和Et3N(1.3mL，9.3mmol)的THF(50mL)溶液中，並撹拌該溶液(室溫，3h)。將所得的剩餘物濃縮後進行快速色i普(EtOAc/己烷1:4),生成無色油狀的氨基曱酸酯19(1.2g，71%)。Rf0.65(EtOAc/己烷1:1);SH(500MHz^CDC13):7.83s,JEH^PhKfO，7.42(m,2H，Ar),7,32(叫2H，Ar),7.11(m，1H,Ar),5.3S-5.30(叫2H，H3,H化5.18(6rs，恥NH)，4,62(m，1H，H2),4,454.40(叫2H，H5，H6),4.31(dd，3.5,13.5,1H，H6)，2.12(s，3H,CH3)，2.09(s，3H,CH3),2.07(s，3H，CH3),1.44(s,9H，C(CH3)3).Sc(125MHz，CDC13):171.1,170.3,170.0，169.1(4C,CO)，155.0(CONHPh),15L4(Cl)，136.8,129.1，]24.2,U9.4(4C，Ar),77.2，71.0,67.2(3C，C3,C4,C5),61.2(C6)'5U(C2)，30.6(C(CH3)3),28.2(C(CH3>3)，(20.7，20,6，20.5(3C，CH3);C^Hwl^On分析計算孑直C，53.63;H，5.81;N，7.82.實測4直C，53.72;H，5.78;N，7.78%,3.2.5O-(3，4，6-三-0-乙醯基-2-醯氨基-2-脫氧-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基曱酸酯(21a-g)合成的一般步驟(TC下，將三氟乙酸(13mmo1)加入溶於CH2Cl2(10mL)的氨基曱酸酯19(1mmol)中，並攪拌溶液(2h)。然後將吡咬(200mmol)緩慢加入上述溶液中，並將所得混合物靜置(0°C，10min)。然後在0°C下將適當的醯氯(3mmol)加入並使該溶液在4。C靜置過夜。濃縮混合物產生孩iL黃色的剩餘物，將該剩餘物溶解在EtOAc(30mL)溶液中，並用(2x20mL)、鹽水(lx20mL)衝洗，千燥(MgS04)過濾並濃縮。對於想要的三-0-乙酸酯21c-g，進行這些步驟無需進一步純化。對假定為21a和21b的剩餘物進行的快速色i普(EtOAc/己烷1:1)產生了需要的醯基衍生物21a和21b，產率分別為48%和42%。O-(2-乙醯氨基-3，4，6-三-0-乙醯基-2-脫氧-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(21a)-產生的111和13€~]\1議光諳與文獻中的一致961。(48%)Rf0.2(EtOAc/己烷7:3)。O-(3,4,6-三-0-乙醯基-2-脫氧2-丙醯氨基—D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(21b)-(42%)Rf0.ll(EtOAc/己烷1:1)5h(500MH^CDCi3):7.71s,PhN迅7,41(m，2H，Ar)，7.32(m，2H，Ar)，7.111H，Ar),6,59(d,7.5，1H，卿，5.40(dd^9.0，iH，H3)，5.35(d4■/=9.0，1H，H4),4.89(7.5，CH2),1.16(t^3H,CH3);5C(125MH^CD3OD):177.5(OO)，159.5(CONHPli)，154.7(CI),139.3，129.9，124.8，120.3(4C，Ar)，84.1，74.4，69.9(3C，C3，C4，C5),61.S(C6)'52,9(C2)，30.2(CH2)，10.2(CH3);CI6H21:M307.H20的分析計算值C，50.00;H，5.77;N，10，93.實際值C，50.02;5.78;N，10.76%.O-(2-脫氧-2-丁醯氨基-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22b)-(26%)Rf0.26(MeOH/EtOAc1:19);SH(500MHz，CD3OD):7.41(m,2H,Ar、7.272!iAr)，7.03(rn,1H，Ar)，4.54(m,IH，H2)，3.94-3.92(m，2J^取H6)，3.83(dd,13,0,1H,H6),3.74-3,70(m，2H,H3,H4)，2.26(X6.0，COCH2),1.66(nu2H,CT^CHs),(t,7.0，3H，CH3);Sc(100MH^CD3OD):176.7(CO),159.5(CONHPh),154.7(CI),139.3，130.0，124,8,120,3(4C，Ar)，84.1,74.5，69.9(3C,C3，C4,C5)，61.8(C6),52,9(C2)，39.1(CH2)，20.3(CH2)，14.1(CH3);CnH23N30的分析計算值C,53.54;H,6.08;N，i1.02實際值C，53,52;H，6.09;N,10.90%.O-(2-脫氧-2-戊醯氨基-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22c)-(23%)Rf0.43(MeOH/EtOAc1:19);Sh(400MHz^CD3OD):7.45(m,2IiAr),7.30(叫2&Ar),7,03(叫1H,Ar)，4.58(m,H2),3.99-3.94(m，2H,H5,H6)，3.87(d《4.0，12.4，1H，H6),3.79-3,75(m，2H，H3，H4)，2.33(X7=7.2，COCH2),L64(m，2H>C私CH》，1.40(m，2H,CH202),0.92&7麼3H，CH3);Sc(100MHz,CD3OD):176.8(C=0)，159.5(CONHPh),154.7(CI)，139.3，130,0，124.8,120.4(4C,Ar)，84.1,74.3，69》(3C，C3，C4,C5)，61.8(C6)552.9(C2),37.0(CH2),29,0(CH2)，23,5(CH2)，14,2(CH3);C〗SH25N307.2H20的分析計算值C，50.11;6.34;N，9.79.實際值C，50^25;H，6.04;N,9.94%.O-(2-脫氧-2-己醯氨基-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酯(22d)-(26%)Rf0.48(MeO艦tOAcl:19);sh(500MH^CD3OD):7.43(m,2H，Ar),7.28(m，2H，Ar)，7,05(叫1H,Ar)，4.55(叫1HH2)，3,97-3,92(m,2H,H5,H6),3.85諷4.0，12.5,1H，H6)，3.77-3.72(m，2HH3,H4)，2.30(t,J-7,5，COCH2)，！.66(叫2氏COCH2Ci72)，1.36-1.27(m，4H,CH2CH2),0.87(t^6.5，3H,CH3);Sc(125MHz,CD3OD):176.8(CO)，159.5(CONHPh)，154.7(Cl)，139.3，130.0,124,8，120.4(4CAr),84.1,74.3,69.9(3C,C3,C4，C5)，61.8(C6),52.9(C2)，37,2(C恥32.6(CH2),26.6(CH2),23,5(CH2)，(CH3);C19H27N307的分析計算值C,55.74;氏6.65;N,10.26.實際值C,55.55;H,6.86;N,9.99%-O-(2-脫氧-2-異丁醯氨基-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酉旨(22e)—(290/o)Rf0.22(MeOH/EtOAc1:19);5K(500MHz,CD3OD):7.42(m,2H，Ar)，7.27(m，2H，Ar)，7.03(m,1H,Ar)，4*52(m，IH,H2)，3.96"3.92(m,2H,H5，H6〉，3.S3(加,4,5，12.5，IH,H6)，3J7-3.7J！(叫2H，H3，H4)，2.54(m，J=7,0,CH)，1,16(d，3H，CH3)，(d，3&CH3);5C(125MHz^CD3OD):1,(C=0)，159.4(CONHPh)，154.7(Cl)，139.3，130.1，124.8，120.4(4C，Ar)，84,〗，74.3，69.9(3C,C3，C4，C5),6〗.8(C6),52.8(C2)，36.4(CH),19.9，19.8(2C,CH3);CnH23N307的分析計算值C,53.54;H,6力S;N，11.02.實際值C，53,17;H,6.18;N,腦7%.O-(2-脫氧-2-異戊醯氨基-D-吡喃葡糖亞基)氨基N-苯基氨基甲酸酉旨(22f)-(23%),Rf0.47(MeOH/EtOAc1:19);5H(400MHz，CD3OD):7.44(m'2H^Ar),7.30(叫2H,Ar),7,06(叫1H,Ai),4.59(ra，1H,H2),3,98-3.95(叫2H,H5，H6)，3,86(dd，J-4.4，1Z8，lftH6)，3.77-3.74(m，2H，H3,H4)，2.17(d，J-7.5,COCH》，2.12，(邁，1H,CJ(C恥)，0-98(m，6H，CH3》Sc(100MHz,CD3OD):176.0(CO),159,5(CONHPh),154.7(Cl)，139.3，130.0，120,4(4C,At),84,1，74.5，69.9(3C，C3，C4,C5),6L8(C6),52.9(C2),46,5(CH2)，27.5(CH(CH;j)2)，23.0,22.9(2C，CH3);C1SH2SN307的分析計算值C，H$.37;N，10.63.實際值C，54.33;H，6.48;N,10.56%,3.3使用抑制劑22a-f的動力學分析3.3.1動力學分析的實驗步驟所有測試使用終止法在37。C下進行30分鐘，並重複三次，通過加入4倍過量的(200|iL)驟停緩衝劑(200mM氨基乙酸，pH10.75)使酶促反應(50nL)驟停。測試是通過用吸量管小心加入酶(5jiL)引發的，並且在所有情況下，所得的驟停溶液的最終pH值大於10。O-GlcNAc酶和(3-氨基己糖酶的時間依賴性測試揭示了測試時間內兩種酶在各自的緩衝劑下都是穩定的50mMNaH2PO4，lOOmMNaCl,0.1%BSA，pH6.5以及50mM檸檬酸鹽，lOOmMNaCI，0,1%BSA，pH4.25。上述反應的進度在30分鐘結束時通過用UV測量法在400nM下檢測釋放4-硝基酚的程度來確定，本測試中使用96孔板(Sarstedt)和96孔板酶標儀(分子生物學裝置)。人胎盤J3-氨基己糖酶購自Sigma(Lot043K3783)，在即將使用前過量表達並純化O-GlcNAc酶。851在使用濃度為0.5mM的底物pNG-GlcNAc測定抑制劑時，O-GlcNAc酶和|3-氨基己糖酶的濃度(jig/jiL)分別為0.0406和0.012。所有抑制劑均是在從3倍至1/3倍IQ範圍中的七個濃度下測試的，除了P-氨基己糖酶在抑制劑22d下的測試，由於Id值高，如此高的抑制劑濃度是無法達到的。IQ值通過迪克遜作圖數據的線性回歸得到。3.3.2使用抑制劑22a-f的動力學分析結果如上所述，PUGNAc是O-GlcNAc酶113，501和卩-氨基己糖酶28'511的有效的竟爭性抑制劑。對於來源於人的酶的K;t值分別為46nM和36nM。113，491將抑制劑22a-f的選擇性進行評價並與PUGNAc的選擇性進行比較。使用pNG-GlcNAc作為底物，發現這些化合物22a-f是人O-GlcNAc酶和人P-氨基己糖酶兩者的抑制劑(表3)。complextableseeoriginaldocumentpage51表3:O-GlcNAc酶和(3-氨基己糖酶的抑制劑的抑制常數和選擇性。對人P-氨基己糖酶的抑制的分析揭示了增加N-醯基基團的鏈長導致這些抑制劑有效性的顯著下降(表3)。僅僅包含一個亞甲基(化合物22a)也會導致其與母體化合物PUGNAc相比，針對P-氨基己糖酶的Kj值增加33倍。鏈長再增加還會導致IQ值的更大增加。此外，O-GlcNAc酶比P-氨基己糖酶對鏈長增加的耐受性更好(表3)。針對這兩種來源於人的酶，即O-GlcNAc酶和P-氨基己糖酶，前述製備的NAG-噻唑啉衍生物9b-g州的IQ值的直接比較揭示了修飾後的瘞唑啉比相應的基於PUGNAc的化合物22a-f更具選擇性，且是更有效的抑制劑。這些觀察結果指出了抑制劑上醯基基團位置的重要性，以及潛在的異頭碳的重要性。與具有spa雜化異頭碳的相應的PUGNAc衍生物PUGNAc和22a-f上的醯基鏈相比，具有sp3雜化的異頭碳的塞唑啉——NAG-噻唑啉和9b-g——包括限制醯基鏈的運動的一個雙環骨架。同樣，這兩組化合物活性位點上側鏈的精確定位一定是不同的。總之，這兩個因素導致了由PUGNAc衍生的化合物與瘞唑啉衍生物相比，總體上抑制作用較差，選擇性也更低。與這些結果相一致的是O-GlcNAc酶的一種不好的抑制劑(Kl=1.5mM)[46，47，49鏈脲佐菌素(STZ)也具有一個體積大、自由旋轉的醯基鏈，並顯示出優於對J3-氨基己糖酶的對0-GlcNAc酶的中等選擇性。|46,47,491基於蓬唑啉的化合物NAG-蓉唑啉和9b-g與PUGNAc衍生物PUGNAc和22a-f間的不同點源於前者模擬O-GlcNAc酶,和P-氨基己糖酶'3°，48，83，97)的催化機理中涉及的假定的類雙環過渡態。與此不同的是，PUGNAc類似物和STZ上的N-醯基基團的位置與天然底物N-乙醯基-D-吡喃葡糖苷的N-醯基基團位置類似。PUGNAc和參唑啉的書l"生物上的異頭碳的不同雜化也可能是這些N-醯基基團精確定位的原因。上述製備的全部化合物都是人O-GlcNAc酶和人P-氨基己糖酶兩者的抑制劑。然而，這些化合物利用這兩種酶活性位點結構的不同，從而使其對O-GlcNAc酶具有選擇性。儘管PUGNAc類似物與瘞哇啉衍生物相比具有較低的選擇性，這些化合物可能因為其不同的骨架而具有不同的藥代動力學特性。因此，噻唑啉和PUGNAc衍生物都可被證明是解析細胞水平和有機體水平上O-GlcNAc翻譯後修飾作用的有用工具。事實上，其他糖苷酶抑制劑的修飾已經產生了針對完全不同的酶的臨床上有用的化合物。(98|同樣，使用此處的概括的方案，對其他P-N-乙醯基-氨基葡糖香酶抑制劑骨架^，自!的系統修飾也會生成人O-GlcNAc酶的選擇性抑制劑。實施例4:細胞培養中選擇性抑制劑的評估證明了這些化合物在體外的選擇性後，評估了所述化合物在活細胞中的用途。4.1實驗步驟4.1.1細胞培養與抑制在補充了5-10%FBS(Invitrogen)的DMEM培養基(Invitrogen)中培養COS-7細胞。將等份的抑制劑(每份50ixL抑制劑溶於95%乙醇中)分配至組織培養板中，蒸發乙醇。將細胞在37。C下培養40小時，達到約80%的融合率。依如下方法研究了對使用50jiM的化合物9a、9c或9g處理細胞響應O-GlcNAc修飾蛋白的時間依賴性累積。於5%FBS中培養COS-7細胞至25%融合，並向每個培養板加入一份(100nL)溶於培養基中、過濾並除菌的抑制劑，以使抑制劑的終濃度為50pM。在適當時間刮落收集COS-7細胞，並通過離心(200xg,10min)集中。用pH7.0(10mL)的PBS衝洗細胞一次並沉澱(200xg,10min)。此時將細胞於-80。C冷凍。無抑制劑的對照組培養物用相同的方法處理。4.1.2蛋白質印跡分析在抑制劑9a，9c，或9g的存在下，依上述方法培養COS-7細胞至約90%融合。對照細胞的培養物用與如下相同的方法處理，但培養物中沒有抑制劑。將細胞以上述方法收集。冷凍的細胞在4。C解凍，並加入j氐溫的裂解緩沖液(含有150mMNaCl，1mMEDTA,lmMPMSF，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉和lmM抑制劑9f的lmL50mMTris溶液，pH8.0)。4。C下10分鐘後，將溶液於Eppendorf5154C微量離心機中，14000rpm下離心，收集上清。向每個樣品的一份(15pL)中加入SDS/PAGE加樣緩沖液，96。C加熱後上樣至10%或12%的Tris'HCl聚丙烯醯胺凝膠。電泳後，將樣品電印跡至硝酸纖維素膜上(0.45pm,Bio-Rad)。通過目測觀察預染的標記物(雙色PrecisionPlus蛋白質標準-Biorad)的轉移來確認轉移。使用5。/oBSA(第五組分，Sigma)的PBS溶液(用於被小鼠抗-O-GlcNAc單克隆IgM抗體(MAbCTD110.6-Covance)探測的樣品的封閉緩衝液A)，或者使用pH7.4、含有0.1%吐溫20的5%低脂奶粉(用於被抗_P-肌動蛋白探測的樣品的封閉緩衝液B)，室溫下lh或4'C過夜封閉上述的膜。傾去封閉溶液，並按需要加入含有MAbCTD110.6(原料液的1:2500)的封閉緩衝液A或含有小鼠單克隆抗-p-肌動蛋白IgG(CloneAC-40-Sigma)的封閉緩衝液B(1:1000稀釋)。膜在室溫下溫育lh或4。C過夜，然後傾去封閉緩沖液，用含有0.1%吐溫20的pH7.4的PBS(清洗緩衝液)清洗膜。然後將膜用清洗緩衝液衝洗2x5min和3x15min。對於O-GlcNAc的免疫檢測，將膜在封閉緩衝液A中室溫下溫育1小時，並在衝洗後，將膜在含有第二山羊抗小鼠-IgM-HRP結合物(1:2500，SantaCruzBiotech)的封閉溶液中室溫下溫育1小時或4。C過夜。對於p-肌動蛋白水平的檢測，將膜在含有第二山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(1:100000，Sigma)的封閉溶液B中室溫下溫育1小時或4。C過夜。衝洗膜，並用化學發光檢測法完成與膜結合的山羊抗小鼠IgG-HRP結合物的檢測，化學發光檢測中使用S叩erSignalWestPico化學發光檢測試劑盒(Pierce)和膠片(KodakBiomaxMR)。4.2細胞研究的結果與對照細胞(數據未顯示)相比，在含有5(HiM的抑制劑9a，9c或9g的平板中培養的COS-7細胞沒有顯示出繁殖率或形態上的異常。在有或無抑制劑9a，9c或9g存在下在培養40小時的細胞內的細胞水平的O-GLcNAc修飾蛋白使用O-GlcNAc引導的單克隆抗體(64)mAbCTD110.6。與對照組相比，細胞內O-GlcNAc修飾的蛋白質的細胞水平的顯著增加(附圖5A)表明了這些化合物較易進入細胞內部，在此它們阻止了O-GlcNAc酶起作用。還探測了在COS-7細胞內瘞哇啉抑制劑(9c)阻止O-GlcNAc酶作用的速度。通過用蛋白質印跡分析監測COS-7O-GlcNAc修飾蛋白的水平，我們發現了O-GlcNAc修飾蛋白水平的清晰的時間依賴性增加。甚至在暴露於抑制劑(9c)l小時後，也觀察到O-GlcNAc修飾蛋白的水平的增加。看起來抑制劑快速地進入細胞，在其中立即阻止O-GlcNAc酶的活性導致了O-GlcNAc修飾蛋白的時間依賴性增加(附圖6)。在最初的快速升高之後，被抑制劑(9c)處理後的細胞中的O-GkNAc修飾蛋白的水平在細胞內似乎漸漸接近一個穩定的狀態(附圖6)。這種行為與之前觀察到的與PUGNAc闊共同培養的HT29細胞中的相似的時間依賴性一致。對於使用ot-p-肌動蛋白探測的蛋白質印跡分析(附圖5B)，以及隨後的適當的第二HRP-結合揭示了在所有情況下，加樣的樣品是等量的。還值得注意的是，母體化合物NAG-瘞唑啉(9a)之前曾被證明能夠進入細胞，並在其中對溶酶體P-氨基己糖酶施加作用|111。實施例5:選擇性O-GlcNAc酶抑制劑在開發用於研究II型糖尿病的動物模型中的用途5.1顯示But-NAG-噻唑啉(9c)在不同組織類型和葡萄糖清除中的作用的動物研究5.1.1實驗步驟將八隻五周齡的健康斯普拉-道來氏大鼠(CharlesRiver)成對關入籠內。使該動物在SimonFraser大學的動物飼養實驗室(SFUACF)中適應環境一周。3:00pm，對四隻大鼠通過尾靜脈注射40(HiL溶於PBS緩沖劑(pH7.4)的抑制劑9c,劑量為50mgkg-1。剩餘的四隻大鼠通過尾靜脈注射400pL的PBS作為對照。所有溶液通過0.2pm過濾器(Millipore)預除菌，並通過包括28號x0.5的針頭(Terumo)的0.5mL注射器在IO秒內推注。約ll:OOpm時取消食物。第二天早晨8:30am時，對大鼠進行第二次注射。三小時後用異氟烷麻醉大鼠，並從頸靜脈抽取100pL血樣用於測量禁食時的血糖水平。然後實施靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)。通過尾靜脈在30秒內注射0.5mL溶於PBS(預除菌)中的50。/。w/v葡萄糖溶液。葡萄糖注射後的IO、20、30、40、60和卯分鐘時，從頸動脈抽取100nL血樣。獲得血樣後，立即使用一小份血液通過血糖測量4義(Accu-CheckAdvantage,Roche)測量血糖濃度，並將剩餘血液在水上保存20分鐘，再離心分離血清。IVGTT完成後，用l:l的(:02/02混合物殺死大鼠。立即收集其組織樣品(腦、肌肉、肝臟、脾、胰腺、脂肪)，用液氮速凍並儲存於-8(TC。為使組織勻漿從而獲得細胞提取物，用研缽和扦將組織研磨成粉末狀時保持組織的冷凍狀態。然後將100mg粉末於lmL低溫裂解緩衝液(50mMTris，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS,l%NP-40，lmMEDTA,ImMPMSF和ImM丁基-NAG-瘞唑啉)中勻漿，使用JenkeandKimkelUltra-Turrax組織勻漿儀使用兩個10秒脈衝進行上述勻漿。然後將組織於13000rpm下，在微量離心機(eppendrof)中離心以除去細胞碎片。將可溶的細胞提取物使用上述用於細胞研究的蛋白質印跡分析法分析其O-GLcNAc修飾蛋白的水平。5.1.2不同組織類型中丁基-NAG-瘞唑啉(9c)的作用被由尾動脈注射了不同劑量的抑制劑9c的大鼠顯示了靜脈給藥抑制劑9c影響了不同組織類型中O-GLcNAc修飾蛋白的細胞水平(附圖9)。腦組織的樣品(附圖9A)顯示了當大鼠被注射50、120和300mg/kg的抑制劑9c時，與對照實驗相比，O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平顯著增加。這表明抑制劑9c很容易進入腦細胞內，在其中起作用阻止O-GlcNAc酶的功能。在肌肉和肝臟組織的樣品中也發現了相似的結果(附圖9B和9C)。從結果中看出，似乎抑制劑僅以半劑量依賴的方式抑制O-GlcNAc酶。這說明50mg/kg抑制劑9c足夠引起O-GlcNAc修飾蛋白的最大程度的增加。同樣，這些結果說明了抑制劑能夠在低於24小時的時間內進入多種組織並至少維持6小時的作用。同樣應注意的是，與對照的大鼠相比，這些研究中使用的經抑制劑處理的大鼠並未顯出任何不適。5丄3葡萄糖清除中丁基-NAG_噻唑啉的作用已經闡明抑制劑9c能夠抑制大鼠的O-GkNAc酶，注意力,皮轉移到研究增加的O-GlcNAc修飾蛋白水平是否會改變大鼠維持葡萄糖體內穩態的能力。使用葡萄糖靜脈耐量試驗(IVGTT)作為測量動物對lgkg—1葡萄糖攻擊的反應能力的方法。結果清晰地表明短時間地暴露於抑制劑(<24小時)不會影響大鼠的葡萄糖清除速率(附圖10A)。應注意這些結果是具有統計顯著性的，因為它們是由被抑制劑處理的四隻大鼠和用對照的PBS緩衝液注射處理的四隻大鼠得出的。蛋白質印跡分析表明IVGTT中用抑制劑處理的四隻大鼠確實具有增加的O-GlcNAc修飾蛋白水平(附圖10B)。該結果是令人驚奇的，因為之前顯示在培養的脂肪細胞中O-GlcNAc修飾蛋白的水平的升高導致胰島素抵抗。發明人假設這些結果之間的差異源於一到兩種可能性。首先，由於從整個有機體獲得的結果比使用培養的細胞的實驗更與生理上相關，因此，胰島素抵抗不會在周緣組織中產生。第二種可能性是抑制劑9c實際上通過引起胰腺J3細胞分泌更多胰島素的方式作用於胰腺P細胞。此作用會克服周緣組織中的胰島素不敏感性，可能如觀察結果一樣導致正常葡萄糖清除。對此第二種假設的支持來自一個事實，即p細胞內產生和傳遞胰島素所涉及的大量蛋白質本身被O-GlcNAc修飾，例如刺激胰島素產生的兩種轉錄因子(pdx-l和spl)。5.2顯示丁基-NAG-噻唑啉(9c)清除率的動物研究5.2.1實驗步驟為獲得抑制劑從組織中被清除的速度的信息，向五隻IO周大的斯普拉-道來氏大鼠尾靜脈注射所述抑制劑(50mgkg")。依次在注射後3、7、24、27和32小時殺死大鼠。用另外兩隻大鼠作為對照。一隻大鼠在其他大鼠即將接受注射之前被殺死，以獲得O-GlcNAc修飾蛋白的正常水平的信息。此外，一隻大鼠在其他大鼠注射的同時被注射滅菌的PBS(pH7.4)，並在實驗結束時殺死(32小時)。組織收集、勻漿和蛋白質印跡分析的方法以與上文描述相同的方式進行。5.2.2清除速率結果被注射抑制劑9c的大鼠顯示了抑制劑9c的靜脈給藥在早至注射後三小時時即影響了多種組織類型中O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平(附圖11)。腦組織的樣品(附圖11A)顯示了與對照實驗相比，注射後三小時O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平有顯著增加。這表明抑制劑9c很容易地進入腦細胞的內部並在其中起到阻止O-GlcNAc酶功能的作用。七小時後，O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平仍然很高。24小時後，該水平下降並似乎在32小時後回到正常水平。在肌肉組織樣品中也觀察到了相似結果(圖11B)。5.3顯示丁基-NAG-塞唑啉(9c)的口服有效性的動物研究5.3.1實驗步驟為確定抑制劑9c是否口服有效，將其加入食物中(實驗室食譜5001齧齒目食^普，PMINutritionInternational,LLC)。為製備大鼠食物，將600g碾碎的食物與355mL水和溶解於乙醇中的5mL抑制劑混合。使用麵條機(PastaExpress,Creative)製作小塊，並於37。C下脫水過夜(SnackmasterDehydrator，AmericanHarvest)。製作了含有以下量的抑制劑的五份食物Omgkg"天"，100或lOOOmgkg"天"的脫保護(極性)抑制劑，和100或1000mgkg-1天"的保護(非極性)抑制劑。這些數據基於從之前的研究中獲得的數據，即六周大的大鼠每天食用約25g食物。然後向十隻五周大的健康斯普拉-道來氏大鼠(每組食物兩隻)餵食三天上述的鼠糧。然後將這些動物殺死並收集其組織，勻漿並使用上述方法分析。5.3.2口服有效性結果向大鼠餵食三天兩種不同劑量的保護(非極性)的和脫保護(極性)形式的抑制劑9c。蛋白質印跡分析顯示，口服兩種形式的抑制劑9c影響了多種組織中O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平(附圖12)。腦組織樣品(附圖12A)顯示，當大鼠被餵食100mg/kg/天劑量的保護或脫保護形式的抑制劑9c時，O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平顯著增加。當大鼠被餵食1000mg/kg/天的更大劑量的保護或脫保護形式的抑制劑9c時，腦組織中的O-GlcNAc修飾蛋白的細胞水平更高。這表明了即使抑制劑9c是以劑量依賴的方式被口服的，抑制劑9c也容易進入腦細胞的內部，並在其中阻斷O-GlcNAc酶的功能，。在其他類型的組織樣品中也觀察到相似的結果，包括肌肉、胰腺、脂肪和脾(附圖12B-12E)。本領域技術人員應清楚，根據前述公開，在不偏離本發明的主旨和範圍的情況下，可在本發明的實施中作出許多改變和修改。參考文獻S.P,Jackso;T^an，CeHi娜，55,3〗W.G.Kelly,M,E.Dahmus,G.W,Hart,J"歷'o/CT柳1993,2幼,腿6-10424.〖4〗M.D,Roos，J.ItBaker,J皿E.Kudlow，MZCe"及oZ1997,J7，6472-6480.N.Lamarre^Vin鄉t，L.C*Hsieh掘son，"加CT柳Soc2003,/"，6612-6613.R.N.Cole,G.W.Hart，/油wraw1999，",418428,f11jLBraidman,M.CarrollN.Dance，D,Robinsot^說oc/i飾J1974,295-301.R.Ueno,C.S.Yuan,所ocWm及o;&jl外l，W7《79-84.[13〕D.L.Dong,G.W.Hait/說o/1994,2矽，19321-19330,fl4JC.Tolem叫A.J.Paterson,T.R.WMsenhunt,丄E.Kudlow，/及WC/ze加2004.qbai，I.Grundke-IqbatG.W.Hart，C.又Gong,/VocAto/^carfSciC/S^2004，10804-10a09.[18〗T.Y,ChoAG,W.Hart^及pMed說o/2柳1，移/，413418.f19〗B,Hemissa^A.Bairoch^及w々e;wJl外6，W《廣/V》，695-6%,[20〗B.He加issat,A.Bairoch說ocAe/m/1993，"3f"iV從781-7幼.[21jD.A.McClain，W*A.Lubas,R.C.Cooksey，M,Hazel,G.J.Parker,D.C.Love,〗，A.Hanover,JVocMrfZ乂cadS^t/Svl加02，卯，10695-10699.[22]L.Wdls，K.Vosseller,G.W.Hart^5w'ewce2001，2PA2376-2378.[23]J.A,Hanover,屍^S五5"，1865-1876.^4P,J,Yao,P.D.Colem叫/jVeamjc/1998，2399-2411.[25〗B.Triggs-Raine，D,J.纖ura^RA,Gravei，JAC咖f細i,《199-224.〖26JD.Zhou^J.Mattner,C.CantuEi,N.Schrantz^N.Yin^Y.Gao，Y,Sagiv，KLHudspeth,Y.T,Yamashit^S，Teneberg，D.Wang，RProiS.B.Levery，P,B,Savage,L.TeytoAA.Bendelac,Science加04.[27〗G.Legkr，E,Lull叫B.Kappe^F.Kastenholz,所oc&'ot爿"cri外l，/卿，駒5.J.Liu，A,R.Shikhm叫M,KLotz,C.H.Wong,Own5/o/2001,&701-711.[30〗S,Knapp,D.J.Vocadlo,Z,N.Gao，B.Kiik，J.P.Lou,S.G.W池ers,/J瓜C7wntSoc.1996,〃&6804-6805.[31]V.RLiUdund^H,H.Jensen,X.3U旭g，M.Bols，Cftemiev2002，515-553,K.LiuAJ.PatersoAF.Zhang,J.McAndrew，KFukuchi,丄M,Wyss,L.Peng，Y.Hi^J.E.Kudbw,/Weuroc/jew2004，<SP,1044-1055.[34]G.Parker，R.Taylor,D.Jones,D,McClai《/編CA柳2004，275,20636-20642.〔35〗E,B.Arias,J.Kim,G,D.Cartee，D!'a&efes2加4，53，921-930.〖36〗A.JunodA.E.Lambert,L,Orci,R.Pictet,A.E.Gonet，A.E.RenoW，iVoc5bc腳胸Med1967，風201-205.[37〕R.A,BennettA.E.Pegg,Cancer及m1981,W，2786-2790.〖38〗K.D.Kroneke，K.Fehsd，A,Sommer，M.L*Rodriguez,V.Kolb-Bacbofen,及o/CTem/foppeSgy/er1995,376，179-185,〖39]H.Yamamoto,Y.Uchigata,ROkamoto,iV加wrel卵l，284-286.f40JK.Yamada,K.Nonaka^T.Hanafiisa^A.Miyazaki，H.Toyoshima^S.Tarui，Diai咖1紹2,3入749-753.[41〗V.Burkart，Z.Q.W幼^J.Radons,B.HeUer，Z,Herceg，L.Stingl,RF.Wagner,H,Kolb,Med1999,5,314~319.[42]M.D.Roos，W.Xie，K.Su^J.A.ClarisX,Yang,E.Chin^A.J.PatersomJ.E.Kudlow，iVoc爿jroc爿wiV^s7'c^37ty19訴，〃0，422"432.[43]Y.Gao，G.J.Parker，G,W.Hart^爆/e加鄉—2000，卿296-302.44JILOkuyamajM.Yachi，S/oc/em及o/yja彷m諷2001，2《7，366-371.〖45.〗N.E.Zach叫N.ODonnell,W.Chemg^J.J、Mercer,LD.Marth,G.W.Hart^及'o/Oze怖2004,30133-30142.[46〗J,A.Hanover,Z,Lai，G.Lee，W.A.Lubas,S.M.Sato,^rc/i^"cAe附及'—"1999，取38"45.[47〗K.Liu,A.J.PatersoAR.J,Konrad^A.F.Parlow，S,Jhni，M.Roh,E.Chin^Jr.，J.E.Kudlow，Afo/Ce//五/ttfocri加/2002,"4，135-146.[48]B.L.Mar、D.J,Vocadlo，S.Knapp,B.LTriggs-Raine，S.G,W池ers，M.N,James,J及》/2001，27《10330-10337.[49]M.S.Macauley，G.E,Whitworth^A.W.Defcowski，D,Chi^D.3.Vocadio,J及o/C"Aew2005，25313-25322.[50]R.S.Haltiwanger,ICGrove,G.A.Philipsber&J及WC/e加1998,273，3611-3617.51〗D.J,Miller，X.Gong，B.D.Shur,"eve/印附e"f1外3,〃S，1279-1289.[52S.Marshall,W.T.Garvey,ItR>Traxinger，F咖6/1991,5,303"3036.〖53〗S.Haltiwanger,G.D.Hol^G.Hart7所of1990，265，2563-256S.[54]LK,Kreppel,M.A.Blomberg，G.W.Hart^C&e加1997,272，9308-9315.〖55]W.A.Lubas,D.W,Fr喊M,Krause，J.A,Hanover,J及o/C7^;w1997，272,9316"9324.S.P.Iyer,Y.Akimoto,G,W.Hart^J"胸/C為柳2003,5399-5409.[58JK.Brickley，M.J.SmithyM.Becl^F.A.Stephenson^/及'o/Ow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選自支鏈烷基鏈、非支鏈烷基鏈、環烷基、芳香基，及其雜原子衍生物，及其可藥用的鹽。35.—種選擇性抑制O-GlcNAc酶的抑制劑，其中所述的抑制劑選自權利要求1和權利要求34定義的化合物。全文摘要本發明包括用於選擇性抑制糖苷酶的化合物、所述化合物的藥物前體以及含有所述化合物或其藥物前體的藥物組合物。本發明還包括動物模型和製作動物模型的方法，該動物模型用於研究與O-GIcNAc酶的缺乏或過表達、O-GIcNAc的累積或缺乏相關的疾病及異常，以及這種疾病和異常的療法。本發明還包括治療所述疾病和異常的方法。本發明還包括製備所述化合物的方法，以及製備選擇性糖苷酶抑制劑的方法。文檔編號C07H17/00GK101208352SQ200680014995公開日2008年6月25日申請日期2006年3月1日優先權日2005年3月1日發明者D·沃卡多,G·惠特沃斯,M·莫考雷申請人:西蒙·弗雷瑟大學