含有基於癌抑制基因wt1的產物的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗的製作方法
2023-05-14 12:59:31 1
專利名稱：含有基於癌抑制基因wt1的產物的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及到含有源於Wilms腫瘤的癌抑制基因WT1的產物的癌抗原和脂質轉染試劑Lipofectin的癌疫苗。該癌疫苗作為針對以下癌症以及表達WT1的所有癌的抗癌疫苗是有用的，這些癌症包括白血病、骨髓異形成症候群、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血液癌、或實體癌、例如胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等。
背景技術：
在用於排除異物的免疫系統中，一般存在著體液免疫和細胞免疫，體液免疫涉及到作為抗原呈遞細胞起著識別抗原作用的巨噬細胞、識別該巨噬細胞的抗原呈遞產生各種淋巴因子，對其他T-細胞等進行活化的輔助性T細胞、由於該淋巴因子的作用向產生抗體細胞分化的B-淋巴細胞等；而細胞免疫涉及到接受抗原的呈遞之後進行分化的殺傷性T-細胞攻擊靶細胞並進行破壞。
目前，人們認為癌的免疫主要是由有殺傷性T-細胞參與的細胞免疫引起的。在通過殺傷性T-細胞引起的癌免疫中，對以主要組織相容性抗原(Major Histocompatibility Complex；MHC)I類和癌抗原的複合物的形式呈遞的癌抗原進行識別後的前體T-細胞分化增殖，生成的殺傷性T-細胞攻擊癌細胞，並進行破壞。此時，癌細胞在該細胞表面呈遞MHC I類抗原和癌抗原的複合物，該複合物成為殺傷性T-細胞的靶子(Cur.Opin，Immunol.，5,709,1993；Cur.Opin，Immunol.，5,719,1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev，146，167，1995)。
有人認為作為靶細胞的癌細胞上通過MHC 1類抗原呈遞的上述癌抗原是由癌細胞內合成的抗原蛋白質經細胞內蛋白酶加工生成的約8～12個胺基酸構成的肽(Cur.Opin，Immunol.，5,709,1993；Cur.Opin，Immunol.，5,719,1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev，146，167，1995)。
Wilms腫瘤的癌抑制基因WT1(WT1基因)是根據對合併有Wilms腫瘤、無虹膜、泌尿生殖器異常、精神發育遲滯等WAGR症候群的分析作為Wilms腫瘤的原因基因之一從染色體11p13分離出來的基因(Gessler，M.等人、Nature，Vol.343，p.774-778，1990)，基因組DNA約50kb，由10個外顯子構成，其cDNA約3kb。由cDNA推定的胺基酸序列如序列1所示(Mol.Cell.Biol.，11，1707，1991)。
WT1基因在人白血病中高表達，如果用WT1反義寡聚物對白血病細胞進行處理，由該細胞的增殖被抑制(特開平9-104627號公報)等現象暗示WT1基因起著促進白血病細胞增殖的作用。另外WT1基因在胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體癌中也高表達(特原平9-191635)，判明WT1基因是白血病以及實體癌中的新的腫瘤標記。
由於這一標記，期望給藥含有由WT1基因的表達產物的部分構成的約8～12個胺基酸的肽，對上述很大範圍的癌能夠作為癌疫苗發揮作用。然而，將那樣的肽原封不動地直接給藥很難起到癌疫苗的作用。預料其原因是由於給藥的肽不能有效地送到抗原呈遞細胞上的主要組織抗原類I。
作為陽離子脂質體的脂質轉染試劑Lipofectin是人工脂N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨和作為磷脂的二油醯磷脂醯乙醇胺的1∶1混合物，以前作為非病毒性的基因導入用載體引人注目，後來由於起到將肽抗原送到抗原呈遞細胞表面的主要組織抗原I類的作用而正被人關注(臨床免疫Vol.34，No.6，p842-847，2000)。然而，陽離子脂質體作為抗原載體具有的普遍性程度如何還不清楚，是否能夠起到作為由癌抑制基因WT1的表達產物片段構成的癌抗原的載體的功能也不清楚。
發明的公開因此，本發明的目的是提供含有來自WT1基因表達產物的癌抗原肽和作為該肽載體的有效物質構成的新的癌疫苗。
本發明人為了解決上述課題進行了各種研究，結果確認，由其中至少含有一個在WT1基因表達產物的胺基酸序列中預測在與小鼠和人的MHCI類以及MHC II類的結合中起著錨定胺基酸功能的胺基酸的連續的7～30個胺基酸構成的多肽具有癌抗原的功能，脂質轉染試劑Lipofectin等陽離子脂質體可以作為該癌抗原的載體，完成了本發明。
因此，本發明提供含有鼠WT1表達產物或其部分的癌抗原以及陽離子脂質體的癌疫苗。在優選的方案中，本發明提供由其中含有從在對應於WT1的cDNA的序列1所示的胺基酸序列中推定起著用於與MHC抗原結合的錨定胺基酸作用的Phe，Tyr，Leu，Met，Asn以及Ile中選擇出的至少一個胺基酸的6～30個胺基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗。
另外本發明提供由其中含有從在對應於WT1的cDNA的序列2所示的胺基酸序列中推定起著用於與MHC抗原結合的錨定胺基酸作用的Met，Ler以及Val中選擇出的至少一個胺基酸的7～30個胺基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗。
附圖的簡單說明
圖1A是表示在實施例1中，使用(3)RNAS細胞以及用(4)癌抗原肽Db126進行刺激的RNAS細胞，對癌抗原肽Db126和脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)的混合物(黑圓點)、用Db126進行脈衝後的脂多糖-胚細胞(脂多糖-blast)(白正方形)、單獨脂質轉染試劑Lipofectin(白三角)以及單獨癌抗原肽Db126(白圈)的細胞毒性T細胞誘導能力進行比較的圖，圖B是表示使用(1)C1498細胞以及(2)導入了WT1基因的C1498細胞進行與上述A同樣的實驗後的結果圖。圖A表明癌抗原肽Db126和脂質轉染試劑Lipofectin的組合具有誘導細胞毒性T細胞能力，B表示其活性是WT1特異的。
圖2A是表示在實施例2中作為佐劑(載體)的脂質轉染試劑Lipofectin對使用導入了WT1基因的C1498細胞的肽Db126的抗癌效果的效果圖，圖2B是表示使用C1498細胞進行同樣實驗的結果的圖。表示被檢測物質的記號與圖1相同。A表示脂質轉染試劑Lipofectin作為癌抗原肽Db126的佐劑(載體)是有效的，比較A和B表明抗癌效果是WT1特異的。
發明的實施形態在本發明中，作為設計癌抗原肽時的基礎，對小鼠MHC I類的Kb和Db以及人HLA的A0201進行選擇，選擇了預測與他們有高親和性的肽。
根據Immunogenetics Vol.41，p.178-228(1995)的報導，作為與Kb結合的錨定胺基酸推測是第5位的Phe以及Try以及第8位的Leu以及Met等，而作為與Db結合的錨定胺基酸推測是第5位的Asn以及第9位的Met和Ile等。
另外，已知在癌細胞的表面通過MHC I類呈遞的癌抗原肽的大小大約為8～12個胺基酸。因此，本發明的癌抗原肽是由至少含有序列1所示WT1基因產物的胺基酸序列中的Phe，Tyr，Leu，Met，Asn以及Ile中的一個胺基酸的7～30個胺基酸構成的肽。胺基酸的數目優選是8～12個，例如8或9個。
在本發明中，作為該肽的具體例子，如與MHC I類的Kb結合的肽，可以是由8個胺基酸構成的下列肽Kb45 Gly Ala Ser AlaTyrGly SerLeu(序列3)Kb330 Cys Asn Lys ArgTyrPhe LysLeu(序列4)作為與MHC I類的Db結合的肽，例如可以是由9個胺基酸構成的下列肽Db126 Arg Met Phe ProAsnAla Pro TyrLeu(序列5)Db221 Tyr Ser Ser AspAsnLeu Tyr GlnMet(序列6)Db235 Cys Met Thr TrpAsnGln Met AsnLeu(序列7)在上述序列中加了下劃線的胺基酸是推測起著錨定胺基酸作用的胺基酸。
無論哪一個肽與Kb或Db都有強～中等程度的結合親和性(kd值)，但將表現出最高親和活性的Db126肽用於以後的實驗中。
另外關於人，根據Immunogenetics Vol.41，p.178-228(1995)的報導，作為與人的HLA-A0201結合的錨定胺基酸，推測是從N-末端開始的第2位的Leu和Met，以及從N-末端開始的第9位Val和Leu。因此，這裡列舉了由在人WT1蛋白質的胺基酸序列(Mol.Coll..Biol.Vol.11，p.1707-1712，1991)(序列2)中，符合上述條件的9個胺基酸構成的下列2種肽。
Db126ArgMetPhe Pro Asn Ala Pro TyrLeu(序列5)(與小鼠中的Db126序列相同)WH 187SerLeuGly Glu Gln Gln Tyr SerVal(序列8)(下劃線表示錨定胺基酸)另外本發明的癌抗原肽也可以是在作為WT1基因表達產物的部分的肽中導入了胺基酸置換等修飾的肽。作為這樣的被修飾的肽的例子如含有以下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)，由9～30個胺基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原肽。具體的例子如含有上述的肽Db235(序列7)的2位Met變換為Tyr的胺基酸序列Cys Tyr ThrTrp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)的肽。
作為陽離子脂質體，可列舉例如，含有N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨(DOTMA)、N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸甲酯(DOTAP)、或雙十八烷基醯胺甘氨醯精胺(DOGS)或他們與中性脂的混合物的脂質體。
作為中性脂，可列舉例如，卵磷脂、溶血卵磷脂、[神經]鞘髓磷脂、磷脂酸、磷脂酸乙醇胺、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)等。作為混合物的例子，可列舉例如，作為人工脂的N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨(DOTMA)和作為磷脂的二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)的1∶1混合物的脂質轉染試劑Lipofectin。
本發明的癌疫苗可以用於伴隨著WT1基因表達水平上升的癌，例如白血病、骨髓異形成症候群、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血液癌、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體癌的預防和治療。該疫苗可以通過口服給藥、非口服給藥、例如腹腔內給藥、皮下給藥、皮內給藥、肌肉內給藥、靜脈內給藥、鼻腔內給藥等進行給藥。
本發明的癌疫苗的給藥量一般是每天0.1μ～1mg/kg。
實施例以下通過實施例闡明本發明的癌疫苗的有用性。
實施例1脂多糖-胚細胞(LPS-blast)的製備從C57BL/6鼠中回收脾細胞，將該脾細胞於含有脂多糖(LPS)(10μg/mL)的完全RPMl培養基中培養3天。將該細胞洗淨後，於含有癌抗原肽Db126(1μM)以及卵清清蛋白(OVA)(100μg/mL)的完全RPMl培養基中培養2小時。將細胞洗淨後，懸浮於2mL的HBSS(Hanks』balanced salt solution)中，該懸浮液作為脂多糖-胚細胞(LPS-blast)。
細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力的評價每隔一周向C57BL/6鼠的背部皮下注射共3次癌抗原肽Db126和脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)的混合物(Db126和LPF以1∶2的重量比混合後的混合物)(每隻鼠10nmol的Db126)，或作為陽性對照每隔一周向腹腔注射共3次的脂多糖-胚細胞(LPS-blast)(每隻鼠1mL)，進行免疫。在最終免疫10天後，回收脾細胞，作為效應細胞(effector)。用HBSS將經癌抗原肽Db126刺激(1μM、2小時、37℃、5％CO2條件下)的脾細胞洗淨，得到刺激(stimulator)細胞。
將上述的效應細胞(5×106細胞/孔)和上述刺激細胞(2.5×106細胞/孔)混合，通過進行淋巴細胞·淋巴細胞混合培養，進行細胞毒性T細胞的體外2次抗原刺激。5天後，回收細胞毒性T細胞。將都用Na251CrO4標記的(0.56MBq/106cells、37℃、5％CO2條件下處理1小時)(1)C1498細胞、(2)導入WT1基因後使其表達的C1498細胞(C1498muWT1)、(3)RMA-S細胞以及(4)經癌抗原肽Db126刺激(1μM、5％CO2條件下處理1小時)的RMA-S細胞(Db126-pulsed RMA-S細胞)作為靶細胞，鋪在96孔微量反應板中(104細胞/孔)，然後向培養板中接種上述那樣製備的細胞毒性T細胞。加入效應細胞，培養4小時，測定上清中游離的51Cr的放射活性。細胞損傷活性根據下式算出。
結果首先，為了研究誘導的細胞毒性T細胞是否對癌抗原肽Db126特異，使用作為靶細胞的上述(3)RMA-S細胞和(4)Db126-pulsed RMA-S細胞，確認了癌抗原肽Db126特異性地誘導細胞毒性T細胞(圖1.A)。另外為了研究被誘導的細胞毒性T細胞是否特異損傷WT1表達細胞，作為靶細胞使用上述(1)C1498細胞、(2)導入WT1基因的細胞C1498muWT1，確認了WT1特異的CTL的誘導(圖1.B)。
實施例2.作為癌疫苗載體使用脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)時的癌抗原特異的抗腫瘤效果在實施例1中，由於通過使用作為癌抗原肽Db126的佐劑脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)表現出有效地誘導細胞毒性T細胞，為了進一步確認作為癌疫苗用佐劑的脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)的有用性，就作為佐劑(載體)使用脂質轉染試劑Lipofectin進行免疫時的癌抗原特異的抗腫瘤效果進行了研究。
作為腫瘤模型使用導入了WT1基因的C1498細胞(C1498muWT1)，作為免疫動物使用C57BL/6小鼠，而作為模型癌抗原使用肽Db126。即，象實施例1那樣，每隔一周向C57BL/6小鼠的背部皮下注射共3次肽Db126和脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)的混合物(每隻鼠10nmol)，或每隔一周向C57BL/6小鼠的腹腔注射共3次脂多糖-胚細胞(LPS-blast)(每隻鼠1mL)，進行免疫。最終免疫一周後，將C1498muWT1細胞、或C1498細胞以2×106細胞/100mL的量移植到腹腔內。腫瘤疫苗效果通過測定隨著時間推移的腫瘤直徑，用以下式子算出腫瘤的大小進行評價。
＝[(長徑)×(短徑)2]1/3各組中腫瘤的大小達到20mm時，終止實驗。
結果作為癌疫苗用佐劑(載體)的脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)的評價，是以作為模型腫瘤抗原使用WT1，作為模型腫瘤使用導入了WT1基因的細胞(C1498muWT1細胞)，進行Db126/脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)混合物免疫時對C1498muWT1細胞的抵抗性為指標進行的。結果，如果免疫肽Db126/脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)混合物，可以看到8例中有3例完全拒絕(圖2.A)。
另外為了確認該抗腫瘤效果是WT1特異的，使用不表達WT1的C1498細胞，進行同樣的研究，在免疫(a)肽Db126/脂質轉染試劑Lipofectin(LPF)混合物、(b)游離的肽Db126以及(c)脂多糖-blast(LPS-blast)的任一種時，看不到與沒有進行免疫的組的差別(圖2.B)。因此，確認上述的抗腫瘤效果是WT1特異的。
序列表110中外製藥株式會社真弓，忠範杉山，治夫120含有基於癌抑制基因WT1的產物的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗130K8071609170PatentIn version 3.12101211449212PRT213小鼠4001Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala20 25 30Arg Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala35 40 45Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu260 265 270
Ser Glu Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala435 440 445
Leu2102211449212PRT213人4002Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu21032118212PRT213人工序列
220
223合成肽4003Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu1 521042118212PRT213人工序列220
223合成肽4004Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu1 521052119212PRT213人工序列220
223合成肽4005Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu1 521062119212PRT213人工序列220
223合成肽4006Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met1 521072119212PRT213人工序列220
223合成肽4007Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 521082119212PRT213人工序列220
223合成肽4008Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val1 521092119212PRT213人工序列220
223合成肽
4009Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 權利要求
1.含有以癌抑制基因WT1的產物，或其部分肽或修飾產物為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體的癌疫苗。
2.權利要求1記載的癌疫苗，其中上述癌抗原是含有從序列1的胺基酸序列的Phe，Tyr，Leu，Met，Asn以及Ile中選擇出的至少一個錨定胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽，或含有從序列2的胺基酸序列的Met，Leu以及Val中選擇出的至少一個錨定胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽。
3.權利要求1或2記載的癌疫苗，其中上述抗原是具有癌抑制基因WT1高表達的癌的抗原。
4.權利要求1或2記載的癌疫苗，其中癌是白血病、骨髓異形成症候群、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、或卵巢癌。
5.權利要求1～4中任一項記載的癌疫苗，其中上述癌抗原肽是下列的任一種Kb45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu(序列3)Kb330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu(序列4)Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5)Db221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met(序列6)Db235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列7)WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
6.權利要求5記載的癌疫苗，其中上述癌抗原肽是Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5) 或WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
7.權利要求1記載的癌疫苗，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)，由9～30個胺基酸構成的肽。
8.權利要求7記載的癌疫苗，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)的肽。
9.權利要求1～8中任一項記載的癌疫苗，其中上述陽離子脂質體是含有N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨)、N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸甲酯、或雙十八烷基醯胺甘氨醯精胺或他們與中性脂的混合物的脂質體。
10.權利要求9記載的癌疫苗，其中上述陽離子脂質體是脂質轉染試劑Lipofectin。
11.為了製造癌疫苗，以癌抑制基因WT1的產物或其部分肽或修飾物作為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體的應用。
12.權利要求11記載的應用，其中上述癌抗原是含有從序列1的胺基酸序列的Phe，Tyr，Leu，Met，Asn以及Ile中選擇出的至少一個錨定胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽，或含有從序列2胺基酸序列的Met，Leu以及Val中選擇出的至少一個錨定胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽。
13.權利要求11或12記載的應用，其中上述抗原是具有癌抑制基因WT1高表達的癌的抗原。
14.權利要求11或12記載的應用，其中癌是白血病、骨髓異形成症候群、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌。
15.權利要求11～14中任一項記載的應用，其中上述癌抗原肽是下列的任一種Kb45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu(序列3)Kb330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu(序列4)Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5)Db221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met(序列6)Db235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列7)WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
16.權利要求15中記載的應用，其中上述癌抗原肽是Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5)或WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
17.權利要求11記載的應用，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (序列9)，由9～30個胺基酸構成的肽。
18.權利要求17記載的應用，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)的肽。
19.權利要求11～18任一項中記載的應用，其中上述陽離子脂質體是含有N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨)、N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸甲酯、或雙十八烷基醯胺甘氨醯精胺或他們與中性脂的混合物的脂質體。
20.權利要求19記載的應用，其中上述陽離子脂質體是脂質轉染試劑Lipofectin。
21.癌症患者的治療方法，在該方法中包括給予以癌抑制基因WT1的產物或其部分肽或修飾物作為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體。
22.權利要求21記載的方法，其中上述癌抗原是含有從序列1的胺基酸序列的Phe，Tyr，Leu，Met，Asn以及Ile中選擇出的至少一個錨定胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽，或含有從序列2的胺基酸序列的Met，Leu以及Val中選擇出的至少一個胺基酸的，由連續的7～30個胺基酸構成的肽。
23.權利要求21或22記載的方法，其中上述抗原是具有癌抑制基因WT1的高表達的癌的抗原。
24.權利要求21或22記載的方法，其中癌是白血病、骨髓異形成症候群、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌。
25.權利要求21～24中任一項記載的方法，其中上述癌抗原肽是下列的任一種Kb45 Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu(序列3)Kb330 Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu(序列4)Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5)Db221 Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met(序列6)Db235 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列7)WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
26.權利要求25中記載的方法，其中上述癌抗原肽是Db126 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(序列5)或WH 187 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(序列8)。
27.權利要求21記載的方法，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)，由9～30個胺基酸構成的肽。
28.權利要求27記載的方法，其中上述癌抗原肽是含有如下胺基酸序列Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(序列9)的肽。
29.權利要求21～28任一項中記載的方法，其中上述陽離子脂質體是含有N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨)、N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲銨硫酸甲酯、或雙十八烷基醯胺甘氨醯精胺或他們與中性脂的混合物的脂質體。
30.權利要求29記載的方法，其中上述陽離子脂質體是脂質轉染試劑Lipofectin。
全文摘要
含有以癌抑制基因WT1的產物或其部分肽或修飾產物為活性成分的癌抗原和陽離子脂質體構成的癌疫苗。
文檔編號A61K45/00GK1520311SQ0281269
公開日2004年8月11日 申請日期2002年6月28日 優先權日2001年6月29日
發明者真弓忠範, 杉山治夫, 大杉義徵, 夫, 徵 申請人:中外製藥株式會社, 真弓忠範, 杉山治夫