胡黃連苷i在製備治療B型肝炎藥物中的應用及其製劑和製備方法
2023-05-14 09:12:21 2
專利名稱：胡黃連苷i在製備治療B型肝炎藥物中的應用及其製劑和製備方法
技術領域：
本發明屬於中藥新藥研發領域，具體而言，涉及胡黃連苷I在製備治療B型肝炎藥物中的應用，並提供了胡黃連苷I的製備方法及其治療B型肝炎的藥物製劑。
背景技術：
眾所周知，中國是一個B肝疾病大國。目前，全世界估計有600種以上用於治療病毒性肝炎的藥物，但至今尚無令人滿意的治療藥物。世界衛生組織西太平洋地區永遠榮譽主席韓相泰博士表示，現時最常用的治療B型肝炎藥物是細胞幹擾素(Cytokine Interferon)及核苷類似物(Nucleoside Analogues)。常用的細胞幹擾素包括幹擾素-α，幹擾素必須每天注射，副作用較多，包括出現頭痛及發燒等流感徵狀、肌肉痛、抑鬱及腹瀉等，用藥與否也取決於肝功能，若肝功能已嚴重損壞，則不適合使用幹擾素。另一種細胞幹擾素Peg-intron也在開始使用。至於常用的核苷類似物，則包括拉米夫定(Lamivudine)及阿德福韋(Adefovir)。拉米夫定被用作治療慢性B型肝炎，屬口服藥物，副作用少，抑制病毒的效能高，但長期服用會出現耐藥性，製造出變種的病毒。阿德福韋毒副作用少，此藥亦用於抑制愛滋病毒的研究，但研究發現大劑量服用會影響腎功能，腎功能不良者不宜使用。使用細胞幹擾素與核萁類似物的缺點之一，都在於長期使用會導致嚴重的副作用。部分調節免疫系統的藥物例如胸腺肽(Thymosin)亦被發現有治療功效，但目前未被廣泛用作治療B型肝炎，因為詳細的治療功效不及其它藥物清楚，價格亦相當昂貴。
到目前為止，沒有一種藥物對於抑制B型肝炎有絕對效用。韓相泰博士認為，在未來治療B型肝炎的方法上，中草藥可以擔當一個重要的角色。世界衛生組織亦已將中藥治療B型肝炎作為未來新導向，並希望以中西合璧作為未來的療法。因此人們把目光逐漸集中到中草藥治療B肝上來。
中醫過去一直慣用中草藥治療B型肝炎，應用中藥治療肝炎已經歷了長期的實踐，也積累了豐富的經驗。中草藥治療B型肝炎價錢便宜、療效可靠而且副作用小，已越來越成為我國治療B肝的主要藥物。B型肝炎的中藥治療包括以下幾種方法(1)清肝利溼促進黃疸消退；(2)活血化瘀改善肝臟微循環；(3)調理氣血調動全身免疫機能；(4)健脾益腎改善肝炎的臨床症狀；(5)滋陰、補氣，治療各種併發症。但中草藥在治療B型肝炎的有效性及安全性方面均欠缺科學數據。為此，迫切需要為眾多的B型肝炎疾病患者提供藥理作用明確，藥效高，毒副作用低的治療B型肝炎的藥物。
中藥胡黃連原出於《唐本草》謂其「大寒」，「主骨蒸勞熱，補脾膽，明目」。《新修本草》曰「主骨蒸勞熱，補肝膽，明目，……厚腸胃」。《開寶本草》謂其「味苦、平、無毒」。《雷火熗製藥性解》中，其歸經「入肝、膽、胃三經」。繆希雍《本草經疏》曰「胡黃連，善除溼熱，……一切溼熱，邪熱，陰分伏熱所生諸病，莫不消除。」《藥品化義》曰「胡黃連，獨入血分而清熱。」《本草正義》言「溼火結聚，非此不能直達病所。」胡黃連善除溼熱、消積聚，補肝膽，可清除慢性B型肝炎的溼熱病邪，保肝膽以助除疫毒，為徹底治療本病提供了依據。
胡黃連是玄參科植物胡黃連Picrorhiza scrophulariifloraPennell乾燥根莖，是多年生草本植物，生長於高寒地區的巖石上及土堆中，或者淺土層的向陽處，分布於四川西部，雲南西北部、西藏南部。據文獻記載，胡黃連中含有環烯醚萜苷類、葫蘆素類、酚苷類，另外還含有少量的芳香酸和D-甘露醇，其中胡黃連苷I(Picroside I)是屬於環烯醚萜苷類化合物。有關胡黃連苷I的製備方法及其在製備治療B型肝炎的藥物中的應用還未見報導。
本發明人採用傳統中醫理論和現代科學成果相結合，採用先進的提取分離純化技術，從中藥胡黃連藥材中提取其治療B肝的有效成分胡黃連苷I，使其含量超過90％，並對胡黃連苷I及其相應的藥物製劑進行了治療B型肝炎的藥效學、藥理毒理學研究，結果發現該單體藥理作用清楚，具有抑制B型肝炎病毒複製、保肝降酶、利膽退黃、免疫調節等效果，毒副作用極低，使用安全性高，可為廣大B肝患者提供一種高效低毒的中藥新藥。
發明內容
本發明的目的在於提供一種胡黃連苷I的醫療用途，具體而言，是在製備治療B型肝炎藥物中的應用。
本發明的另一個目的在於提供胡黃連苷I的製備方法及其治療B型肝炎的藥物劑型。
本發明進一步提供了含有胡黃連苷I的用於治療B型肝炎的中藥組合物。
胡黃連苷I(Picroside I)屬於環烯醚萜苷類化合物。該化合物為白色無定型粉末，易溶於水和甲醇，熔點100-102℃。分子式為C24H28O11，結構式如下 本發明提供了具有工業價值的胡黃連苷I的製備方法。其分離純化方法快速、簡單、實用，生產成本較低，極有利於工業化生產。
本發明提供的胡黃連苷I提取、分離、純化的方法如下(1)提取取西藏胡黃連(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黃連(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的乾燥根莖或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮等溶劑或其二種、多種混合溶劑提取，提取液在70℃以下減壓濃縮至幹(或無有機溶劑)，加水至合適的體積，離心除沉澱，得上清液；(2)分離上清液通過常規處理好的吸附柱，分別用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集含薄層檢識有胡黃連苷I的洗脫液，70℃以下減壓濃縮、真空乾燥，粉碎，得胡黃連苷I粗品；(3)純化將胡黃連苷I粗品用無水乙醇溶解，過濾，濾液拌入矽膠，水浴揮幹溶劑，加載於矽膠柱頂端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶劑洗脫，收集流出液，減壓乾燥，粉碎得胡黃連苷I樣品。
上述提取過程中所用的胡黃連藥材可以是純天然的藥材，也可以是人工繁殖的藥材。採用人工種植的胡黃連藥材可以保證藥材的來源穩定，質量可控，且可降低生產成本。
上述提取過程中所用的胡黃連藥材可以粉碎成10～30目大小的粒度，可以有利於有效成分的提取。
上述提取過程中所用的溶劑可以是水、乙醇、丙酮，既可以單獨使用，也可以以兩種或兩種以上的溶劑合併使用。採用的提取方法可以用回流、滲漉或者索氏提取器提取。
上述分離過程中所用的填充吸附柱的填料可以是非極性或弱極性的樹脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型樹脂等，具體可採用D-101型、ZTC型、AB-8型等。
上述提取、分離、純化過程中的最優條件可通過L9(34)正交表進行正交篩選實驗，以胡黃連苷I的含量和轉移率為指標，篩選出最佳實驗條件。
按照上述方法製得的胡黃連苷I樣品中胡黃連苷I含量在95％以上，轉移率在55％以上。提取結果穩定，重複性好，可用於規模化生產。
本發明所述的胡黃連苷I在用於治療B型肝炎時疾病時，可以單獨使用，也可以通過含有胡黃連苷I的藥物組合物的形式使用。
本發明提供的藥物組合物可按本領域內已知方法製備，並可通過口服、舌下、經皮、肌肉或皮下、皮膚黏膜、尿道、陰道或靜脈等途徑給藥。
本發明提供了以胡黃連苷I為活性成分，用於治療B型肝炎的藥物製劑和相應的藥物劑型。該藥物製劑是以上述胡黃連苷I為有效活性成分，並包括了藥劑學上可接受的其他輔料組分，其中所述的胡黃連苷I含量超過90％，最好高於95％。本發明的藥物製劑包括口服劑和非腸道給藥製劑，其中口服劑包括膠囊劑、口服液、口嚼劑、丸劑、片劑、顆粒劑等，非腸道給藥製劑包括注射液劑型及注射用凍乾粉針劑型等。本發明的藥物製劑還包括局部給藥製劑，包括霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。本發明所述的劑型並不限於此。
在製備口服製劑時可選用的輔型劑可以是澱粉、糊精或環糊精、蔗糖、硬脂酸鹽等常規充填劑。在製備凍乾粉針劑可以通過無菌噴霧乾燥、低溫真空乾燥、冷凍乾燥等方法製備。各製劑的後期製備工藝及設備均屬製藥領域的常規技術，本發明對此不作限定，故在此不予詳述。
本發明的創造性在於通過系列實驗證明胡黃連苷I具有明顯的治療B型肝炎的作用。為了證明胡黃連苷I對B型肝炎有治療作用，包括對急性、慢性B型肝炎的治療作用，發明人使用上所述方法製得的胡黃連苷I及相應的藥物劑型，採用了不同的動物模型，通過口服和注射途徑進行了大量的動物實驗，實驗結果表明(1)對四氯化碳、D-胺基半乳糖和對乙醯氨基酚造成急性肝損傷大鼠和小鼠的肝臟有明顯的預防保護和治療作用；(2)對免疫性肝炎和四氯化碳造成慢性肝損傷大鼠的肝臟有明顯的預防保護和治療作用；(3)能明顯增加正常大鼠膽汁中的直接膽紅素含量，即有明顯的利膽作用；(4)可增加異硫氰酸-1-奈酯(ANIT)致黃疸性肝損傷小鼠血清中的直接膽紅素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)含量，即對異硫氰酸-1-奈酯致小鼠黃疸性肝損傷有明顯的治療作用；(5)能明顯增加正常小鼠巨噬細胞吞噬指數，對非特異性免疫功能具有明顯的增強作用；(6)可明顯增加在正常小鼠免疫器官重量，促進溶血素的生成，具有增強體液免疫功能的作用；(7)對鴨乙型病毒性肝炎有明顯的治療作用；(8)能明顯降低2.2.15細胞培養上清液中B肝病毒表面抗原和e抗原的含量。
本發明的主要藥效學實驗方法及結果如下實驗一 注射用胡黃連苷I對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的治療作用通過檢測小鼠血清ALT、AST的變化來觀察注射用胡黃連苷I對D-氨基半乳糖(D-Galn)致小鼠急性肝損傷的保護作用。取昆明種小鼠按體重隨機分為空白對照組、模型對照組、甘利欣組(50mg/kg)、注射用胡黃連甘-I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)三個劑量組，除空白對照組外，其餘各組均腹腔注射1000mg/kg的D-氨基半乳糖造成小鼠急性肝損傷，各給藥組於造模後1h，11h及21h按0.1mL/10g體積靜脈注射給藥，造模22h後，摘眼球取血測血清ALT、AST值，並計算肝臟係數。結果見下表。
表1注射用胡黃連苷I對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較△△△P＜0.001。
表2注射用胡黃連苷I對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠肝臟係數的影響(x±s)
注與空白對照組比較△P＜0.05。
上述實驗結果表明注射用胡黃連苷I小、中、大三個劑量組與模型對照組相比，ALT、AST值均有顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
結論注射用胡黃連苷I對D-氨基半乳糖誘發的小鼠急性肝損傷有明顯的治療作用。
實驗二 注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷的預防保護作用觀察注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷的預防保護作用。取Wistar大鼠雌雄各半，根據體重隨機分為空白對照組、模型對照組、甘利欣組(30mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)劑量組。各給藥組均尾靜脈注射給藥，每日1次，連續給藥4周。給藥7天後，除空白對照組大鼠外，其餘各大鼠均皮下注射25％CCl4花生油溶液2mL/kg，每周2次，共3周，造成慢性肝損傷模型。於末次給藥後24小時腹主動脈取血，測定血清ALT、AST、TP、ALB、MDA、SOD、GSH含量及肝糖原、肝羥脯氨酸。結果見下表。
表3 注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷血清AST、ALT的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對照組比較△△△P＜0.001。
表4 注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損TP、ALB的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對照組比較△△P＜0.01。
表5 注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷的肝糖原和肝臟羥脯氨酸的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較△△△P＜0.001。
表6 注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷血清中MDA、SOD、GSH含量的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與空白對照組比較△P＜0.05，△△△P＜0.001。
上述實驗結果表明注射用胡黃連苷I能明顯降低血清ALT、AST、MDA及肝羥脯氨酸，升高SOD、GSH、TP、ALB及肝糖原值，具有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001)。
結論注射用胡黃連苷I對CCl4致大鼠慢性肝損傷有明顯的預防保護作用。
實驗三 胡黃連苷I對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用觀察胡黃連苷I口服給藥對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的治療作用。取Wistar大鼠採用四氯化碳(CCl4)造成慢性肝損傷後，隨機分為模型對照組、聯苯雙酯組(150mg/kg)、胡黃連苷I小(15mg/kg)、中(30mg/kg)、大(60mg/kg)劑量組，並設立空白對照組平行操作。各組連續灌胃給藥，連續給藥4周。空白對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水。於末次給藥後24小時，各組動物麻醉後進行腹主動脈取血，分離血清，測血清ALT、AST、TP、ALB值，並取肝臟做病理組織檢查，測定肝臟羥脯氨酸及肝糖元含量。結果見下表。
表7胡黃連苷I對慢性肝損傷大鼠血清ALT、AST、A/G的影響(x±s)
注與空白對照組比較，△△△P＜0.001；與模型對照組比較，*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001。
表8胡黃連苷I對慢性肝損傷大鼠肝糖元、羥脯氨酸含量及肝係數的影響(x±s)
注與空白對照組比較，△△P＜0.01△△△P＜0.001；與模型對照組比較，*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001。
上述實驗結果表明胡黃連苷I小、中、大劑量組與模型對照組比較，ALT、肝羥脯氨酸明顯降低(P＜0.05)，肝糖元明顯升高(P＜0.05)；胡黃連苷I中、大劑量組與模型對照組比較AST、肝係數明顯降低，A/G比例明顯升高(P＜0.05)。病理檢查結果提示各給藥組與模型對照組比較無明顯差別。
結論胡黃連苷I對四氯化碳所致大鼠慢性肝損傷有明顯的治療作用。
實驗四 注射用胡黃連苷I對正常小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響觀察注射用胡黃連苷I對正常小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響。將ICR小鼠隨機分空白對照組、環磷醯胺組(50mg/kg)、左旋咪唑組(30mg/kg)、注射用胡黃連苷I小劑量組(5mg/kg)、中劑量組(10mg/kg)、大劑量組(15mg/kg)，共6組，環磷醯胺組每日按0.02mL/10g腹腔注射給藥，左旋咪唑組按0.2mL/10g灌胃給藥，注射用胡黃連苷I各劑量組均按0.1mL/10g體積尾靜脈注射相應藥物，空白對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水，每日一次，連續7天。末次給藥後24h，進行碳廓清實驗，計算吞噬指數。同時取小鼠肝和脾臟進行稱重，計算臟器係數。結果見下表表9注射用胡黃連苷I對正常小鼠巨噬細胞吞噬指數的影響(x±s)
注與空白對照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01表10 注射用胡黃連苷I對實驗動物臟器係數的影響(x±s)
注與空白對照組比較△△△P＜0.001上述實驗結果表明注射用胡黃連苷I中、大劑量組與空白對照組比較，吞噬指數均有所上升，經統計學處理差異均具有顯著性(P＜0.05)，臟器係數則無明顯變化(P＞0.05)。
結論注射用胡黃連苷I對非特異性免疫功能具有明顯的增強作用。
實驗五 注射用胡黃連苷I對正常小鼠體液免疫功能的影響通過觀察注射用胡黃連苷I對正常小鼠溶血素生成的影響，來檢測其對體液免疫功能的影響。將ICR種小鼠按體重隨機分為6組，即空白對照組，左旋咪唑(30mg/kg)組，環磷醯胺組(20mg/kg)組，注射用胡黃連苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)劑量組，其中除左旋咪唑組按0.2mL/10g灌胃給藥外，各組均按0.1mL/10g尾靜脈注射相應藥物，連續8天。給藥第二天，各組小鼠腹腔注射CRBC懸液0.2mL，連續7天，於末次免疫後1h，取血進行溶血素OD值測定，取胸腺、脾臟稱重、計算臟器係數。結果見下表。
表11 注射用胡黃連苷I對正常小鼠免疫器官的影響(x±s)
注與空白對照組比較△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表12 注射用胡黃連苷I對正常小鼠溶血素含量的影響(x±s)
注與空白對照組比較△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001上述實驗結果表明與空白對照組比較注射用胡黃連苷I中、大劑量組溶血素OD值均明顯升高，經統計學處理差異均有顯著性(P＜0.05、P＜0.001)。與空白對照組比較注射用胡黃連苷I大劑量組脾臟係數明顯升高，經統計學處理差異有非常顯著性(P＜0.01)。
結論注射用胡黃連苷I有增強正常小鼠體液免疫功能的作用。
實驗六 注射用胡黃連苷I對正常大鼠的利膽作用通過觀察注射用胡黃連苷I對膽汁分泌量及膽汁中直接膽紅素含量的影響，研究注射用胡黃連苷I的利膽作用。方法取Wistar雄性大鼠50隻，體重220～240g，根據體重隨機分為空白對照組、陽性藥苯丙醇膠丸組(250mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)和大(10mg/kg)劑量組，共5組。大鼠麻醉後打開腹腔，作膽總管插管引流膽汁，收集藥前0h～0.5h膽汁，然後分別從舌下靜脈給藥1mL/100g，收集給藥後0h～0.5h，0.5h～1.0h，1.0h～1.5h，1.5h～2.0h，2.0h～2.5h，2.5h～3.0h的膽汁流量並測定直接膽紅素含量。結果見下表。
表13 注射用胡黃連苷I對大鼠膽汁流量的影響(x±s)
注與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與自身給藥前比較△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表14注射用胡黃連苷I對大鼠膽汁直接膽紅素的影響(x±s)
注與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與自身給藥前比較△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述實驗結果表明注射用胡黃連苷I各劑量組與空白對照組相比，各時間段膽汁流量均有不同程度升高，且可明顯增加膽汁中的直接膽紅素含量(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001)。
結論注射用胡黃連苷I有明顯的利膽作用。
實驗七 注射用胡黃連苷I對異硫氰酸-1-奈酯致小鼠黃疸性肝損傷的治療作用通過檢測小鼠血清總膽紅素(TBIL)、結合膽紅素(DBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、穀草轉氨酶(AST)的變化來觀察注射用胡黃連苷I對黃疸性肝損傷的治療作用。昆明種小鼠按體重隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性茵梔黃(200mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(5mg/kg)、中(10mg/kg)、大(15mg/kg)劑量組共6組，每組12隻。除空白對照組外，其餘各組均按0.1mL/10g灌服ANIT(100mg/kg)花生油溶液造成小鼠急性黃疸模型，造模後6h、24h、47h給藥三次。末次給藥後1小時(即造模後48小時)，各組動物摘眼球取血，離心血清測TBIL、DBIL、ALT、AST。取肝臟，稱重計算臟器係數。結果見下表。
表15注射用胡黃連苷I對ANIT致小鼠黃疸性肝損傷血清TBIL和DBIL的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較△△△P＜0.001。
表16 注射用胡黃連苷I對ANIT致小鼠黃疸性肝損傷血清ALT和AST的影響(x±s)
注與模型對照組比較*P＜0.05；與空白對照組比較△△△P＜0.001。
上述實驗結果表明注射用胡黃連苷I中、大劑量組與模型對照組比較，血清TBIL、ALT值均明顯降低，經統計學處理具有顯著性差異(P＜0.05)。其餘各指標與模型對照組比較，無明顯差異(P＞0.05)。
結論注射用胡黃連苷I對小鼠黃疸性肝損傷有明顯的治療作用。
實驗八 注射用胡黃連苷I對鴨乙型病毒性肝炎的影響觀察注射用胡黃連苷I對鴨B型肝炎病毒(DHBV)的影響。實驗設6組，正常對照組、模型組、陽性藥組(拉米夫定20mg/kg)、注射用胡黃連苷I小(10mg/kg)、中(20mg/kg)、大(40mg/kg)劑量組，除正常對照組外，其餘各組均採用麻鴨B肝模型，給藥採用靜脈途徑，分別檢測給藥前(T0)、給藥後第5天(T5)、第10天(T10)和停藥後第3天(P3)鴨血清中DHBV-DNA和前s表面抗原(DHBpresAg)的含量。實驗重複三批。結果見下表。
表17 注射用胡黃連苷I(HD-I)對鴨血清DHBV-DNA含量的影響
注*成對t檢驗給藥組不同時間(T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與未給藥前(T0)平均光密度值比較。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△組間t檢驗給藥組不同時間(T0、T5、T10、P3)鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與模型組(T0、T5、T10、P3)平均光密度值比較。△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001表19 注射用胡黃連苷I(HD-I)對鴨血清DHBpresAg水平的影響
注*成對t檢驗給藥不同時間(T5、T10、P3)鴨血清DHBpresAg OD值與未給藥前(T0)OD值比較。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
△組間t檢驗給藥組不同時間(T0、T5、T10、P3)鴨血清DHBpresAg OD值與模型組(T0、T5、T10、P3)OD值比較。△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
上述實驗結果表明對鴨血清中DHBV-DNA含量測定結果為三批實驗中注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天的鴨血清DHBV-DNA平均光密度值與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01)；注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天的血清DHBV-DNA水平分別與相應的模型組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天相比均有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)，並具有一定的劑量效應關係。對鴨血清中DHBpresAg含量測定結果為三批實驗中注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天的鴨血清DHBpresAg OD值與給藥前比較有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)；注射用胡黃連苷I小、中、大劑量組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天的血清DHBpresAg水平分別與相應的模型組給藥後第5天、第10天和停藥後第3天相比均有顯著性下降(P＜0.001或者P＜0.01或者P＜0.05)。
結論注射用胡黃連苷I體內對鴨B肝病毒具有較明顯的抑制作用。
實驗九 注射用胡黃連苷I對B肝病毒抑制作用的體外研究體外觀察注射用胡黃連苷I對B肝病毒(HBV)是否具有抑制作用。用MTT法檢測注射用胡黃連苷I對2.2.15細胞的毒性；用ELISA方法檢測不同濃度注射用胡黃連苷I作用於2.2.15細胞不同時間後細胞培養上清中HBV相關抗原—表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的含量，計算藥物對細胞的半數毒性濃度(TC50)和對抗原的半數抑制濃度(IC50)，以TC50和IC50的比值(即治療指數)來評價藥物的有效性和安全性，TI＞2為安全有效。同時設置正常對照組，空白對照組，及陽性藥拉米夫定(3TC)組平行操作。結果見下表。
表20 注射用胡黃連苷I對HbsAg和HBsAg的治療指數
注判定標準為TI＞2為有效；1≤TI≤2為有毒有效；TI＜1為毒性作用。
上述實驗結果說明三批實驗注射用胡黃連苷I對HBsAg和HBeAg治療指數的平均值分別為2.97和4.83；陽性藥拉米夫定對HBsAg的治療指數是4.83，對HBeAg沒有抑制作用。
結論注射用胡黃連苷I體外對HBV具有明顯的抑制作用。
藥效學實驗結果表明胡黃連苷I不但具有較好的保肝降酶、利膽退黃和免疫調節作用，而且還具有顯著的抗B肝病毒作用。
為了研究胡黃連苷I對機體可能存在的毒性作用，評價利用該單體製備成的中藥藥物的用藥安全性，本發明人進行了一般毒性實驗和特殊毒性實驗。
一、一般毒性實驗1.急性毒性研究實驗結果表明胡黃連苷I的注射劑型靜脈注射給藥對小鼠的LD50值為1040mg/kg，靜脈注射給藥對大鼠的LD50值為171.4mg/kg，腹腔注射給藥對大鼠的LD50為552mg/kg藥物對動物的重要組織和臟器無明顯急性毒性損傷。
2.長期毒性研究(1)胡黃連苷I注射劑型腹腔注射給藥對大鼠的長期毒性研究共設4組，分別為溶劑對照組(等體積生理鹽水)，胡黃連苷I注射劑型的小40mg/(kg·d)、中150mg/(kg·d)和大300mg/(kg·d)三個劑量組，分別相當於藥效學有效劑量的5倍、21倍、42倍。以動物給藥前後的一般表現、體重、攝食量、血液學及血清生化指標、尿常規、骨髓分類、臟器重量、臟器係數為檢測指標，並輔以動物各組織臟器的病理學檢查，綜合評價藥物的毒性情況。結果顯示，胡黃連苷I注射劑型大劑量組動物體重增長緩慢，其餘各項指標均正常。中、小劑量組動物的各項檢測指標亦未見明顯異常。病理組織學檢查結果顯示，三個劑量組動物各組織臟器未見異常。可認為中劑量以下為安全劑量。
(2)胡黃連苷I注射劑型靜脈滴注給藥對Beagle的長期毒性研究共設4組，分別為溶劑對照組(等體積生理鹽水)，胡黃連苷I注射劑型小20mg/(kg·d)、中77.46mg/(kg·d)和大150mg/(kg·d)三個劑量組。分別相當於藥效學有效劑量的10、40和70倍。觀測指標同上。結果顯示，大、中、小劑量組動物各項檢測指標亦未見異常。病理檢測結果提示，三個劑量組動物各重要組織臟器無明顯異常。
綜合上述兩個長期毒性研究結果，我們認為注射用胡黃連苷I毒性較低，安全範圍廣，遠遠超過藥效學有效劑量的範圍。
二、特殊毒性實驗1.胡黃連苷I的致突變作用研究通過「鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗」、「中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)染色體畸變實驗」和「小鼠骨髓嗜多染細胞微核形成實驗」分別研究了胡黃連苷I在體外和體內潛在的致突變性。結果表明，胡黃連苷I無論在體外還是體內，均無明顯的直接或間接致突變作用。
2.胡黃連苷I的致畸作用研究通過胡黃連苷I的致畸敏感期生殖毒性試驗觀察胡黃連苷I在大鼠致畸敏感期連續給藥，是否可致畸胎發生。結果表明胡黃連苷I各劑量均無明顯的致畸作用。
綜上所述，胡黃連苷I毒副作用較小，藥理作用明確，它不但具有較好的保肝降酶、利膽退黃和免疫調節作用，而且還具有顯著的抗B肝病毒作用，這是本發明的創造性所在之一，是國內同類產品所不具備的特點。此外作為注射劑，該藥物起效迅速，對急性肝炎有良好的治療效果。作為口服劑，其主要優點是較西藥如拉米夫定、阿西洛韋等毒性較小，宜長期服用。上述實驗證明胡黃連苷I為一種治療B型肝炎包括急慢性B型肝炎疾病的有效化合物，含有胡黃連苷I的藥物組合物是一味治療B型肝炎疾病的良好藥物。
目前胡黃連可以採用人工種植的方法進行繁殖，保證了藥材的來源穩定，質量可控，且大量種植與開發可降低生產成本。鑑於我國為B肝大國，胡黃連苷I開發成治療B型肝炎的藥物必將有較廣闊的市場應用前景。
具體實施例用以下的實施例對本發明作進一步闡述，但本發明並不限於下列實施例包含的內容。
實施例1胡黃連苷I的製備方法取胡黃連藥材3000g(藥材中胡黃連苷I含量3.19％)，粉碎成過10目篩的藥粉。用12倍藥材重量體積(v/w)的70％乙醇回流，所得滲漉液在60℃濃縮成相對密度為1.18～1.20的濃縮液，所得濃縮液加入水稀釋，離心，所得上清液以1.2L/Kg.h的速度通過D-101大孔吸附樹脂柱(樹脂徑∶高＝1∶10，樹脂用量為藥材重量的2.5倍)，待藥液完全流入樹脂後，依次用20倍藥材重量體積(v/w)的水、32倍藥材重量體積(v/w)15％乙醇洗脫雜質，然後用20倍藥材重量體積(v/w)25％乙醇洗脫胡黃連苷I，收集洗脫液，60℃減壓濃縮，真空乾燥，粉碎，再用無水乙醇將藥粉溶解，濾過，濾液拌入矽膠，60℃水浴揮幹溶劑，加載於矽膠柱頂端(矽膠徑∶高＝1∶10，矽膠用量為1倍藥材重量)，用10倍藥材重量體積(V/W)乙酸乙酯洗脫，收集流出液，60℃減壓乾燥，粉碎得胡黃連苷I樣品56.85g，胡黃連苷I含量95.24％，胡黃連苷I重量54.14g，胡黃連苷I轉移率56.57％。(注「L/Kg.h」表示每公斤藥材一小時流出液的體積數，下同。)實施例2胡黃連苷I的製備方法取胡黃連藥材84kg(藥材中胡黃連苷I含量3.19％)，粉碎成過10目篩的藥粉。用8倍藥材重量體積(v/w)的70％乙醇速度滲漉，所得滲漉液在60℃濃縮成相對密度為1.18～1.20的濃縮液，所得濃縮液加水稀釋，離心，所得上清液通過ZTC型樹脂柱，待藥液完全流入樹脂後，依次用18倍藥材重量體積(v/w)的水、25倍藥材重量體積(v/w)15％乙醇洗脫雜質，然後用25倍藥材重量體積(v/w)25％乙醇洗脫，收集洗脫液，60℃減壓濃縮，真空乾燥，粉碎，再用1倍藥材重量體積(v/w)無水乙醇將藥粉溶解，濾過，濾液拌入矽膠，60℃水浴揮幹溶劑，加載於矽膠柱頂端，用10倍藥材重量體積(V/W)丙酮洗脫，收集流出液，60℃減壓乾燥，粉碎得胡黃連苷I樣品1.55kg，胡黃連苷I含量95.30％，胡黃連苷I重量1.48kg，胡黃連苷I轉移率55.12％。
注射用胡黃連苷I製備工藝處方胡黃連苷I60.0g，製成1000支。
製法取胡黃連苷I60.0g，加入注射用水約2800mL，65℃水浴使溶解，加入總配製量2.0‰活性炭(6.0g)，攪拌半小時，過濾，於濾器上加水至3000mL，繼以0.45μm、0.22μm微孔濾膜分級過濾，濾液以每瓶3mL定量分裝於10mL西林瓶中，冷凍乾燥，回充高純度氮氣，加塞，軋蓋，包裝，即得。
胡黃連苷I片劑製備工藝處方共製成1000片，各組分及含量如下黃連苷I 30g澱粉 180g微晶纖維素 60g乳糖 30g硬脂酸鎂 1.5g製法取胡黃連苷I樣品，其中胡黃連苷I含量超過90％，將其粉碎過80目篩，與澱粉、微晶纖維素、乳糖等混合均勻，用8％澱粉漿制軟材，乾燥，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，質檢，包裝，即得。
權利要求
1.胡黃連苷I的醫療用途，其特徵是在製備治療B型肝炎藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵是胡黃連苷I在製備治療急、慢性B型肝炎藥物中的應用。
3.根據權利要求1所述的藥物，其特徵是含有黃連苷I的用於治療B型肝炎的藥物組合物。
4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特徵是該組合物可以通過口服、舌下、經皮、肌肉、皮下、皮膚黏膜、尿道、陰道、靜脈等途徑給藥。
5.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特徵在於該組合物可以以口服劑、注射劑及局部給藥製劑形式存在，其中口服劑包括膠囊劑、口服液、口嚼劑、丸劑、片劑、顆粒劑等，注射劑包括注射液劑型及注射用凍乾粉針劑型等，局部給藥製劑包括包括霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。
6.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特徵在於所述的胡黃連苷I含量超過90％。
7.根據權利要求1～6所述的胡黃連苷I，其特徵在於可以通過下述方法得到(1)提取取西藏胡黃連(Picrorhiza scrophulariiflora Pennell)和印度胡黃連(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)的乾燥根莖或其粉碎品，用水、乙醇、丙酮等溶劑或其二種、多種混合溶劑提取，提取液在70℃以下減壓濃縮至幹，加水至合適的體積，離心除沉澱，得上清液；(2)分離將所得的上清液通過常規處理好的吸附柱，分別用水及不同濃度的乙醇洗脫，收集含薄層檢識有胡黃連苷I的洗脫液，70℃以下減壓濃縮、真空乾燥、粉碎，得胡黃連苷I粗品；(3)純化將胡黃連苷I粗品用無水乙醇溶解，過濾，濾液拌入矽膠，水浴揮幹溶劑，加載於矽膠柱頂端，用乙酸乙酯、丙酮或其二者的混合溶劑洗脫，收集流出液，減壓乾燥，粉碎得胡黃連苷I樣品。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於提取方法可以用回流、滲漉或者索氏提取器提取方法。
9.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於分離過程中所用的填充吸附柱的填料可以是非極性或弱極性的樹脂，如苯乙烯型(包括甲基苯乙烯型、乙基苯乙烯型)、丙烯腈型樹脂等。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於分離過程中所用的樹脂為D-101型、ZTC型、AB-8型。
全文摘要
本發明屬於中藥新藥研究開發領域，具體而言，涉及胡黃連苷I在製備治療B型肝炎藥物中的應用。胡黃連苷I毒副作用較小，藥理作用明確，不但具有較好的保肝降酶、利膽退黃和免疫調節作用，而且還具有顯著的抗B肝病毒作用，對B型肝炎包括急、慢性B型肝炎均有較好的治療效果。本發明還提供了胡黃連苷I的製備方法及治療B型肝炎的藥物劑型。本發明提供的胡黃連苷I的製備方法成本低廉、操作簡便、極有利於工業化大生產。
文檔編號A61P1/16GK1788732SQ20041009864
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月15日 優先權日2004年12月15日
發明者周亞偉 申請人:周亞偉