防禦素變體及其使用方法

2023-05-12 04:37:06 1

專利名稱：防禦素變體及其使用方法
技術領域：
本發明涉及具有抗病原菌活性的多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。本發明的方法利用這些抗病原菌多核苷酸和多肽控制植物病原體並且增強植物的病原抗性。
背景技術：
植物病害通常嚴重限制了農業生產力，因此影響了農耕作業的歷程和發展。多種病原體導致植物病害，包括真菌、細菌、病毒和線蟲。然而，在農作物傳染病的致病病原中，真菌是經濟上最重要的植物病原體群，它們每年造成大批適銷食物、纖維和飼料損失。在傳統上是通過農耕作業，包括輪作、使用農用化學品以及常規的繁育技術，來控制植物病害的發生。然而，使用化學品控制植物病原體會增加農民的成本，並且對生態系統造成有害影響。消費者和政府管理者等越來越關切生產和使用保護植物免受病原體侵害的合成農用化學品相關的環境危害。由於這些關切，管理者已禁止或限制使用更具危害性的化學品中的一些。通過繁育抗性作物在一定程度上控制了真菌病害的發生。然而，傳統繁育方法是耗時的，且隨著病原體的進化需要連續的努力來維持病害抗性。參見(例如)Groverand Gowthaman (2003) Curr.Sc1.84:330-340 (Grover 和 Gowthaman, 2003 年，《現代科學》，第84卷，第330-340頁)。因此，研究人員對於開發用於控制植物病原體的新型替代方法表現出極大的興趣，該方法與基於傳統農用化學品的方法特性相比具有更低汙染和環境危害風險，並且與常規繁育技術相比繁瑣性更低。最近，農業科學家通過對植物進行基因工程操作使之表達抗病原蛋白，培育出了病原抗性增強的農作物。目前正不斷努力，進行抗病原菌藥劑的鑑別以及病害抗性植物的基因工程操作。因此，鑑於植物病原體，尤其是真菌病原體對作物產量和質量的顯著影響，需要保護植物免受病原體侵害的新組合物和方法。

發明內容
提供了保護植物免受病原體侵害的組合物和方法。該組合物包含抗病原菌(尤其是抗真菌)多肽的新型核苷酸和胺基酸序列。本發明所公開的多肽顯示出對植物真菌病原體的抗病原菌活性。還提供了包含編碼本發明所公開的抗病原菌多肽的核苷酸序列的多核苷酸。通過使用DNA改組鑑別多肽和編碼該多肽的核苷酸序列。在一些實施例中，與用於產生新型抗病原菌多肽編碼序列的DNA改組事件的親本多肽相比時，抗真菌多肽顯示出具有改善的抗病原菌活性。組合物還包含表達盒，其包含編碼本文所公開的抗病原菌多肽的多核苷酸。還提供了包含本發明所公開的多核苷酸和多肽的植物、植物細胞、種子和微生物。該組合物用於涉及在植物中誘導病原抗性，尤其是真菌抗性的方法。在特定實施例中，該方法包括將編 碼抗病原多肽的至少一種多核苷酸引入植物。因此，抗病原多肽在植物中表達，並且病原體暴露於病原體攻擊位點的優選蛋白質，從而增強病原抗性。組織優選的啟動子可用於驅動抗病原菌蛋白在尤其易受病原體攻擊的特定植物組織，例如根、葉、莖、維管組織和種子中的表達。病原體誘導型啟動子也可用於驅動病原體感染位點處或附近抗病原菌蛋白的表達。還提供了抗病原菌組合物和製劑，以及將它們用於保護植物免受病原體，尤其是真菌病原體侵害的方法。在一些實施例中，組合物包含抗病原菌多肽，或包含具有編碼抗病原菌多肽的多核苷酸與載體組合的微生物。使用這些組合物保護植物免受病原體侵害的方法包括通過(例如)噴霧、噴粉、撒播或種子包衣將抗病原菌組合物施用至植物病原體的環境。本發明所公開的方法和組合物可用於保護植物免受病原體，包括真菌病原體、病毒、線蟲等等的侵害。本發明涵蓋以下實施例:1.一種分離的多肽，所述多肽包含選自以下的胺基酸序列:(a) SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的胺基酸序列；以及(b)與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，其中所述多肽具有抗病原菌活性。 2.實施例1的分離的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。3.實施例1或實施例2的分離的多肽，其中所述多肽具有抗真菌活性。4.實施例3的分離的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。5.實施例2的分離的多肽，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌(Colletotrichum graminocola)和禾穀鐮孢菌(Fusarium graminearum)中至少一者的改善的抗真菌活性。6.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列:(a) SEQ ID NO: 3、5、7或9中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。7.實施例6的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；
(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。8.實施例6的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。9.實施例8的分離的多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時具有改善的抗真菌活性。10.實施例8的分離的多核苷酸，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。11.包含實施例6-10中任一項的多核苷酸的表達盒。12.實施例11的表達盒，其中所述多核苷酸有效連接至驅動在植物中表達的啟動子。13.實施例11的表達盒，其中所述多核苷酸有效連接至驅動在微生物中表達的啟動子。14.包含實施例6-10中任一項的多核苷酸的宿主細胞。15.包含實施例11的表達盒的宿主細胞。16.包含有效連接至驅動在植物中表達的啟動子的異源多核苷酸的植物，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。17.實施例16的植物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。18.實施例16的植物，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。
19.實施例18的植物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。20.實施例18的植物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。21.實施例16-20中任一項的植物，其中所述核苷酸序列經過優化，以便在植物中表達。22.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是選自細胞、種子和籽粒的植物部分。23.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是單子葉植物。24.實施例23的植物，其中所述單子葉植物是玉米、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱或裸麥。

25.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物是雙子葉植物。26.實施例25的植物，其中所述雙子葉植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。27.實施例16-20中任一項的植物，其中所述多核苷酸穩定整合到植物的基因組。28.實施例16-20中任一項的植物，其中所述植物顯示出增強了對植物病原體的抗性。29.實施例28的植物，其中所述植物病原體是真菌。30.實施例29的植物，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中的至少一者。31.實施例16-20中任一項的植物，其中所述啟動子是組織優選的啟動子。32.實施例31的植物，其中所述組織優選的啟動子選自葉優選的啟動子、根優選的啟動子、種子優選的啟動子、莖優選的啟動子和維管組織優選的啟動子。33.實施例16-20中任一項的植物，其中所述啟動子是病原體誘導型啟動子。34.實施例16-33中任一項的植物的轉化種子。35.增強植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括為所述植物提供選自如下的多肽:(a)包含SEQ ID NO: 6、8、10或12中示出的胺基酸序列的多肽；以及(b)包含與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。36.實施例35的方法，其中所述多肽具有與SEQ ID NO: 6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少
一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。37.實施例35的方法，其中所述多肽具有抗真菌活性。38.實施例37的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。39.實施例37的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
40.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是選自細胞、種子和籽粒的植物部分。41.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是單子葉植物。42.實施例41的方法，其中所述單子葉植物是玉米、甘蔗、小麥、水稻、大麥、高粱或裸麥。43.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物是雙子葉植物。44.實施例43的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、芸苔、向日葵、棉花或苜蓿。45.實施例35-39中任一項的方法，其中所述植物病原體是真菌。46.實施例45的植物，其中所述真菌是禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中的至少一者。47.實施例35的方法，其中所述植物種植在耕作區，其中所述耕作區具有所述植物病原體，或其中所述種植區的環境條件有利於所述植物病原體的生長。48.實施例35的方法，其中提供多肽包括將包含選自如下核苷酸序列的異源多核苷酸引入所述植物:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性 的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。49.實施例48的方法，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。50.實施例48的方法，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。51.實施例50的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID NO:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。52.實施例50的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。53.實施例48-52中任一項的方法，其中所述多核苷酸穩定整合到植物的基因組。54.實施例48-52中任一項的方法，其中所述異源多核苷酸有效連接至所述植物中具有活性的啟動子。55.實施例54的方法，其中所述啟動子是組織優選的啟動子。56.實施例55的方法，其中所述組織優選的啟動子選自葉優選的啟動子、根優選的啟動子、種子優選的啟動子、莖優選的啟動子和維管組織優選的啟動子。
57.實施例54的方法，其中所述啟動子是病原體誘導型啟動子。
58.包含根據實施例1-5中任一項的至少一種多肽的抗病原菌組合物。59.實施例58的組合物，還包含載體。60.保護植物免受植物病原體侵害的方法，該方法包括將根據實施例58的組合物施用至植物病原體的環境。61.實施例60的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。62.實施例60的方法，其中所述植物病原體是真菌。63.實施例62的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中的至少一者。64.包含有效連接至驅動在微生物中表達的啟動子的至少一種異源多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(a) SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(b)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列；(c)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(d)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。65.實施例64的微生物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:4、6、8或10具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。66.實施例64的微生物，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。67.實施例66的微生物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。68.實施例66的微生物，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。69.包含根據實施例64-68中任一項的至少一種微生物的抗病原菌組合物。70.實施例69的組合物，還包含載體。71.保護植物免受病原體侵害的方法，該方法包括將根據實施例69的組合物施用至植物病原體的環境。72.實施例71的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。73.實施例71的方法，其中所述植物病原體是真菌。74.實施例73的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中的至少一者。
75.控制耕作區中的病原體的方法，所述方法包括:a)評估耕作區的環境條件是否存在病原體或條件是否有利於病原體生長；b)選擇有效量的抗病原菌組合物，其中所述抗病原菌組合物為根據實施例58或實施例69的組合物；以及c)將所述抗病原菌組合物施用至作物、作物部分、種子或所述作物的耕作區。76.控制耕作區中的病原體的方法，所述方法包括:a)評估耕作區的環境條件是否存在病原體或條件是否有利於病原體生長；以及b)在耕作區種植包含有效連接至驅動在植物中表達的啟動子的異源多核苷酸的作物種子或植物，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列:(i)SEQ ID N0:5、7、9或11中示出的核苷酸序列；(ii)編碼包含SEQ ID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列；(iii)與SEQ ID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及(iv)編碼與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。77.實施例76的方法，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQ ID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的 胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者:(a) SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(b)SEQ ID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；(C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQ ID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及(e) SEQ ID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應位置處的絲氨酸(Ser)殘基。78.實施例76的方法，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽。79.實施例78的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。80.實施例78的方法，其中所述多肽與包含SEQ ID N0:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。81.實施例75-80中任一項的方法，其中所述病原體是真菌。82.實施例81的方法，其中所述真菌為禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中的至少一者。本發明的這些和其他方面在以下給出的本發明具體實施方式
中更詳細地公開。


圖1示出了本發明所公開的五雄苦木(Picramnia pentandra)植物防禦素(Pp-PDFl)變體胺基酸序列與Pp-PDFl胺基酸序列(SEQ ID NO:4)的序列比對。
具體實施例方式提供了涉及誘導植物中的病原抗性，尤其是真菌抗性的組合物和方法。該組合物包含抗病原菌多肽的新型核苷酸和胺基酸序列。具體地講，提供了具有SEQ ID N0:6、8、10和12中示出的胺基酸序列的分離的多肽及其變體和片段。還提供了包含編碼SEQ ID N0:6、
8、10和12中示出的胺基酸序列的核苷酸序列的分離的多核苷酸及其變體和片段。新型抗病原菌多肽和編碼該多肽的核苷酸序列通過已知植物防禦素序列，包括五雄苦木植物防禦素Pp-PDFl的DNA改組生成。參見美國專利N0.6，911，577和7，396，980，每個專利全文以引用的方式併入本文。植物防禦素包括硫堇、富含半胱氨酸的小肽、蛋白酶抑制劑、澱粉酶抑制劑等等。按照蛋白質結構分類(SCOP)系統，它們被稱為防禦素基因。防禦素有防禦作用，更具體地講植物對病原體的防禦中發揮作用，並且它們的一級和二級結構與昆蟲防禦素具有相似性。本發明的防禦素歸為蠍毒素樣蛋白超家族和植物防禦素家族。雖然不受任何作用機制的限制，但序列和相關基因在病害引起的病斑周圍的表達可控制症狀發展，如在過敏性反應(HR)中，通過控制蛋白酶介導的細胞死亡機制來控制症狀發展。組合物也可以通過抑制病原體產生的蛋白酶或通過結合病原體的細胞壁組分直接起到抗病原菌蛋白的作用。第三，它們也可以作為擾亂膜功能，導致病原體細胞毒性的兩親性蛋白。防禦素通常為富含半胱氨酸的小肽，並且顯示出抗微生物活性。植物防禦素通常包含約45-54個胺基酸，具有四個二硫鍵(Broekaert etal.(1995)Plant Physiol.(Bethesda) 108:1353-1358 (Broekaert 等 A, 1995 年，《植物生理學》，貝塞斯達，第108卷，第1353-1358頁))。本發明的防禦素抑制一系列病原體的生長，包括(但不限於):微摩爾濃度的真菌、線蟲、細菌、昆蟲和病毒。防禦素通過多種機制抑制病原體損傷，包括(但不限於):膜離子滲透性的改變以及真菌靶標中菌絲分支的誘導(Garcia-Olmeda et al.(1998)Biopolymers, Peptide Science47:479-491(Garcia-Qlmeda等人，1998年，《生物聚合物(肽科學)》，第47卷，第479-491頁)，以引用的方式併入本文)。此前公開的植物防禦素(參見美國專利N0.6，911，577和7，396，980)根據序列同源性分為85組，並且用「CS」後面加三位數字來表示。用於產生本發明所公開的Pp-PDFl變體的DNA改組分析的Pp-PDFl多肽屬於第18組，也可以用CS164來表示。全長Pp-PDFl多肽的核苷酸和胺基酸序列分別在SEQ ID NO:1和2中示出，而成熟Pp-PDFl多肽的核苷酸和胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 3和4中示出。Pp-PDFl多肽及本發明所公開的其變體表現出至少對真菌禾穀鐮孢菌(FGR)、禾生炭疽菌(CGR)、輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)(FVE)和玉米色二孢(Diplodia maydis) (DMA)的抗真菌活性。表I示出了 Pp-PDFl和改組的變體的IC50數據。表1.
權利要求
1.一種分離的多核苷酸,所述多核苷酸包含選自以下的核苷酸序列: (a)SEQ ID N0:3、5、7或9中示出的核苷酸序列； (b)編碼包含SEQID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列； (c)與SEQID N0:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)編碼與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。
2.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
3.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有抗真菌活性的多肽，其中所述抗真菌活性與包含SEQ ID NO:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時有所提聞。
4.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼的多肽與包含SEQID NO:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
5.—種表達盒,所述表達盒包含權利要求1所述的多核苷酸。
6.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求5所述的表達盒。
7.一種微生物,所述微生物包含權利要求5所述的表達盒。
8.一種植物或植物部分，所述植物或植物部分包含有效連接至驅動在所述植物中表達的啟動子的異源多核苷酸，其中所述異源多核苷酸包含選自如下的核苷酸序列: (a)SEQ ID NO:5、7、9或11中示出的核苷酸序列； (b)編碼包含SEQID N0:6、8、10或12的胺基酸序列的核苷酸序列； (c)與SEQ ID NO:5、7、9或11具有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽；以及 (d)編碼與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽。
9.根據權利要求8所述的植物，其中所述多核苷酸編碼具有與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸編碼具有抗病原菌活性的多肽，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基；(d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
10.根據權利要求8所述的植物，其中所述多肽與包含SEQID NO: 2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有改善的抗真菌活性。
11.根據權利要求8所述的植物，其中所述多肽與包含SEQID NO:2或4中示出的胺基酸序列的多肽相比時，具有對禾生炭疽菌和禾穀鐮孢菌中至少一者的改善的抗真菌活性。
12.根據權利要求8所述的植物，其中所述植物是選自細胞、種子和籽粒的植物部分。
13.根據權利要求8所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
14.根據權利要求8所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
15.—種增強植物中植物病原抗性的方法，所述方法包括為所述植物提供選自如下的多肽: (a)包含SEQID N0:6、8、10或12中示出的胺基酸序列的多肽；以及 (b)包含與SEQID N0:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗病原菌活性。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述多肽具有與SEQID NO:6、8、10或12具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，並且其中所述胺基酸序列具有選自如下的胺基酸殘基中的至少一者: (a)SEQ ID N0:6、8、10或12的第I位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (b)SEQID N0:6、8、10或12的第16位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基； (C)SEQ ID N0:6、8、10或12的第25位殘基對應的位置處的精氨酸(Arg)殘基； (d)SEQID N0:6、8、10或12的第36位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基；以及 (e)SEQID N0:6、8、10或12的第42位殘基對應的位置處的絲氨酸(Ser)殘基。
17.根據權利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸穩定整合到所述植物的所述基因組。
18.一種抗病原菌組合物，所述抗病原菌組合物包含根據權利要求2所述的至少一種多肽。
19.根據權利要求18所述的組合物，還包含載體。
20.一種保護植物免受病原體侵害的方法，所述方法包括將根據權利要求18所述的組合物施用至植物病原體的所述環境。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述組合物通過選自噴霧、噴粉、撒播和種子包衣的方法施用。
全文摘要
本發明涉及保護植物免受病原體，尤其是真菌病原體侵害的組合物和方法。組合物包括通過DNA改組生成的抗病原菌多肽的新型變體的胺基酸序列及其變體和片段，其表現出改善的抗病原菌活性。還提供了編碼所述抗病原菌多肽的多核苷酸。還提供了一種使用本文所公開的所述多核苷酸誘導植物中的病原抗性的方法。還提供了包含抗病原菌多肽或具有本發明的抗病原菌多核苷酸與載體組合的微生物的組合物，以及使用這些組合物保護植物免受病原體侵害的方法。還公開了包含本發明的抗病原菌多核苷酸或多肽的植物、植物細胞、種子和微生物。
文檔編號C12N15/82GK103154252SQ201180048727
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月19日 優先權日2010年8月23日
發明者J.J.恩格利什, S.L.格蘭特, J.S.波拉克, J.L.裡特蘭德, G.A.桑達爾 申請人:先鋒國際良種公司