一種蛇足石杉組織培養的方法

2023-05-14 20:52:01 2

專利名稱：一種蛇足石杉組織培養的方法
技術領域：
本發明屬於植物組織培養技術領域，具體涉及到一種蛇足石杉組織培養體系建立 的方法。
背景技術：
蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]又名救命王、金不換、千層塔、山 芝、蛇足草，屬蕨類石杉科(Huperiaceae)石杉屬(Huperzia Bemh.)，是一種珍貴的藥用 蕨類植物。民間常用其全草治療跌打損傷、淤血腫毒、精神分裂等疾病。其所含的石杉鹼 甲AOluperzine A)已被藥理實驗證明可低毒、高效、可逆且高選擇性地抑制乙醯膽鹼酯酶 (AchE)，已開發出多種成藥，可用於治療重症肌無力、提高學習效率以及改善老年人的記憶 功能等，為目前治療老年痴呆等疾病的特效藥，市場前景廣闊。由於人工合成的石杉鹼甲A 類似物副作用大且成本高，因此目前用於成藥的石杉鹼甲A都來自野生資源。石杉鹼甲的 野生資源主要來源於石杉科石杉屬植物蛇足石杉、石杉科馬尾杉屬及石杉屬其他植物。目 前絕大部分用於成藥的石杉鹼甲A均提取自野生蛇足石杉。由於蛇足石杉多生長在人跡罕至的山地密林或溝谷陰溼土中，對生境要求苛刻， 生長緩慢，生產周期長；加之石杉鹼甲在全草中含量甚微，目前，藥品生產完全依賴野生資 源，價格昂貴，長期採挖造成資源急劇減少，其野生資源總量十分有限。因此，尋求石杉鹼甲 再生資源勢在必行。目前的研究顯示通過芽孢、扦插、壓條和分株等營養繁殖方式進行蛇 足石杉的人工栽培雖然可行，但繁殖係數和生物量較低，進行大規模人工栽培的條件還不 成熟。而組織培養具有需要材料少、條件可控、不受季節限制、周期短、重複性強等優點，是 石松植物快速繁殖和大規模工廠化生產的理想手段。通過組織培養技術對蛇足石杉進行擴 大繁殖，旨在尋找一條方便快捷的繁殖途徑，以便為人工大量栽培提供技術支持，為滿足市 場需求打下基礎。應用組織培養技術對蛇足石杉進行繁殖，既可擴大藥材來源，又能保護野 生資源。蛇足石杉組織培養過程中存在外植體滅菌困難、無菌外植體的獲得率低，外植體 接種後汙染和褐化現象嚴重，不能正常生長、分化和增殖，愈傷組織的誘導率極低且增殖困 難等問題。雖然國內外研究者也進行了一些相關方面的嘗試，但是至今還沒有蛇足石杉組 織培養成功的報導。

發明內容
針對蛇足石杉組織培養過程中存在外植體滅菌困難、無菌外植體的獲得率低，外 植體接種後汙染和褐化現象嚴重，不能正常生長、分化和增殖等問題，本發明通過對滅菌方 法、培養基和培養條件的研究，實現了蛇足石杉組織培養較低的汙染率、低褐化率、高成活 率、高生長率、高分化率和高生根率；本發明旨在提供一種蛇足石杉組織培養的方法。本發明的具體操作步驟如下一種蛇足石杉組織培養的方法包括以下步驟
(1)選擇外植體從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子體，切取莖尖，經 自來水衝洗乾淨；(2)殺滅表面菌將洗淨的莖尖在超淨臺中先浸入濃度70%的乙醇溶液30-50s ；接著置於濃 度0. 的升汞(HgCl2)溶液浸泡7-lOmin，再轉入濃度7%的雙氧水(H202)溶液中浸泡 10-15min，最後用無菌水衝洗3-5次，作為蛇足石杉組織培養的外植體；(3)接種培養將所述外植體接種在促進莖尖生長的改良MS培養基上，置於22_27°C、光照時間 12-14h/d、光照強度800-20001x條件下進行培養2_3周；(4)殺滅內生菌將接種培養後的外植體轉至含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基上，繼續培 養2-3周，培養條件同步驟(3)；對內生菌進行殺滅。(5)擴繁培養將步驟(4)經內生菌殺滅後無菌的外植體轉入叢生芽分化擴繁的改良MS培養基 繼續培養一段時間，當莖尖頂芽長到5-8mm後，切取新長出的外植體頂芽約3_5mm轉接到叢 生芽分化擴繁的改良MS培養基中進行組培苗的分化和增殖培養，培養條件同步驟(3)，從 組培苗莖基部分化產生出叢生苗；(6)生根培養切取步驟(5)中從組培苗莖基部分化產生的叢生苗轉至生根培養基中，置於培養 室進行生根培養，培養條件同步驟(3)；所述改良MS培養基由下列物質組成950mg/L硝酸鉀(KN03)、825mg/L硝酸銨 (NH4N03)、185mg/L 硫酸鎂(MgS04 7H20)、220mg/L 氯化鈣(CaCl2 2H20)、85mg/L 磷酸二 氫鉀(KH2P04)、8. 45mg/L 硫酸錳(MnS04 H20)、4. 3mg/L 硫酸鋅(ZnS04 7H20)、3. lmg/L 硼 酸(H3B03)、0. 415mg/L 碘化鉀(KI)、0. 125mg/L 鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20)、0. 025mg/L 硫酸銅 (CuS04 5H20)、0. 025mg/L 氯化鈷(CoCl2 6H20)、50mg/L 肌醇、lmg/L 甘氨酸、0. 5mg/L 鹽酸 吡哆醇(VB6)、0. 5mg/L煙酸(VB5)、0. lmg/L鹽酸硫胺素_、9. 3lmg/L乙二胺四乙酸二鈉 (Na2-EDTA 2H20)、6. 96mg/L 硫酸亞鐵(FeS04 7H20)、30g/L 蔗糖、5. 6g/L 瓊脂；所述含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基由下列物質組成在改良MS培養 基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0. 5mg/L孔雀石綠；所述叢生芽分化擴繁的改良MS培養基由下列物質組成在改良MS培養基中加入 2umol/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培養基由下列物質組成在改良MS培養基中加入10 u mol/L 3_吲哚丁 酸(IBA)。所述步驟(1)中切取莖尖1. 5-2. 0cm，用自來水衝洗乾淨，轉入每升滴加0. 2ml洗 潔精的自來水中浸泡漂洗20min，再用自來水衝洗乾淨。步驟(3)中經表面滅菌後的莖尖外植體需用無菌濾紙吸乾表面水分後再用於接 種培養。所述lOOmg/L抗生素AAS含30mg/L青黴素、50mg/L鏈黴素和125 u g/L兩性黴素B，100mg/L抗生素AAS現配現用，AAS和孔雀石綠均過濾除菌後添加。步驟(6)中所述的生根培養所用的叢生苗為經步驟(5)中從組培苗莖基部分化 產生的叢生芽長至5-8mm。所述改良MS培養基、叢生芽分化擴繁的改良MS培養基和生根培養基滅菌前均於 50-60°C下，調節 pH 至 5. 8，且均於 121°C、104kPa 下滅菌 17_20min。所述含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基中的孔雀石綠和抗生素AAS先經
0.22um微孔濾膜過濾除菌，然後再添加到經高溫高壓滅菌並冷卻至50-60°C的改良MS培養基。本發明的有益技術效果體現在以下方面1、由於選取了蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb. ) Trev.]的孢子體莖尖作為外 植體，採用了乙醇、升汞和雙氧水配合對外植體表面的微生物進行殺滅，再通過孔雀石綠與 抗生素相結合來殺滅內生菌的方法，獲得了 50%左右的無菌外植體，提高了無菌外植體的 得率，有效控制了外植體的褐化和白化，達到了外植體較低的汙染率和褐化率的技術效果。2、由於選擇了改良MS培養基作為組織培養的基本培養基，並且在22_27°C、光照 時間12-14h/d、光照強度800-20001X條件下培養，外植體褐化輕，實現了莖尖外植體的成 活率高達90 %，生長速度達6-8mm/月，生長良好的技術效果。3、由於選擇了改良MS培養基附加2iimol/L 6_苄氨基嘌呤(6-BA)作為叢生芽分 化擴繁培養基，並且在22-27°C、光照時間12-14h/d、光照強度800-20001X條件下培養，實 現了組培苗的分化率達到90%，月增殖倍數達2. 1-3. 5，無褐化，生長效果好的技術效果。4、由於選擇了改良MS培養基附加了 lOymol/L 3_吲哚丁酸(IBA)作為生根培養 基，並且在22-27°C、光照時間12-14h/d、光照強度800-20001x條件下培養，實現了叢生苗 的生根率達到100%，根系生長快且生根數達1. 6-3. 4/株，苗生長速率達9. 4mm/月，新葉形 成數達4片/月，生物量增加5. 1倍，叢生苗生長健壯且根系較發達的技術效果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步地說明。本發明的特點和優點將隨著描述 而更清楚，但這示例性的實施例僅僅用來說明本發明，並不對本發明的範圍構成任何限制。實施例(1)選擇外植體從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata (Thunb. ) Trev.]的孢子體，切取莖尖
1.5-2. 0cm用自來水衝洗乾淨，轉入每升滴加0. 2ml (2-3滴)洗潔精的自來水中浸泡漂洗 20min，再用自來水衝洗乾淨後作為組織培養的外植體待滅菌；實驗結果表明，採用合適長 度的莖尖作為外植體，褐化輕、易成活。孢子體在植物世代交替的生活史中，產生孢子和具2倍數染色體的植物體。由受 精卵(合子)發育而來。苔蘚植物的孢蒴及其附屬結構(蒴柄和基足)、蕨類和種子植物的 習見植物體都是孢子體。蛇足石杉孢子體從野外採回後，最多在15_22°C環境中保溼放置7-8天；孢子體放 置時間過長不利於莖尖外植體的滅菌和存活，孢子體採回後宜立即切取莖尖用於滅菌和培養。
(2)殺滅表面菌將洗淨後的莖尖在超淨臺中先浸入濃度70%的乙醇溶液30-50s ；接著置於濃度 0. 的升汞(HgCl2)溶液浸泡7-lOmin，再轉入濃度7%的雙氧水溶液中浸泡10-15min， 最後用無菌水衝洗3-5次，作為蛇足石杉組織培養的外植體；實驗結果表明，採用濃度70% 的乙醇溶液、濃度0. 的升汞(HgCl2)和濃度7%的雙氧水，表面滅菌效果好，汙染率僅為 36%，汙染率較低。濃度70%的乙醇溶液、濃度0. 1 %的升汞(HgCl2)溶液和濃度7%的雙氧水(H202) 溶液用無菌水配製。(3)接種培養將蛇足石杉組織培養的外植體接種在促進莖尖生長的改良MS培養基上，置於 22-27°C、光照時間12-14h/d、光照強度800-20001x條件下進行培養；實驗結果表明，在此 培養基上培養2-3周後，無菌外植體的成活率達90%，褐化輕。改良MS培養基由下列物質組成950mg/L硝酸鉀(KN03)、825mg/L硝酸銨 (NH4N03)、185mg/L 硫酸鎂(MgS04 7H20)、220mg/L 氯化鈣(CaCl2 2H20)、85mg/L 磷酸二 氫鉀(KH2P04)、8. 45mg/L 硫酸錳(MnS04 H20)、4. 3mg/L 硫酸鋅(ZnS04 7H20)、3. lmg/L 硼 酸(H3B03)、0. 415mg/L 碘化鉀(KI)、0. 125mg/L 鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20)、0. 025mg/L 硫酸銅 (CuS04 5H20)、0. 025mg/L 氯化鈷(CoCl2 6H20)、50mg/L 肌醇、lmg/L 甘氨酸、0. 5mg/L 鹽酸 吡哆醇(VB6)、0. 5mg/L煙酸(VB5)、0. lmg/L鹽酸硫胺素_、9. 3lmg/L乙二胺四乙酸二鈉 (Na2-EDTA 2H20)、6. 96mg/L 硫酸亞鐵(FeS04 7H20)、30g/L 蔗糖、5. 6g/L 瓊脂。(4)殺滅內生菌將接種培養後的外植體轉至含0. 5mg/L孔雀石綠和100mg/L抗生素AAS的改良MS 培養基上，於22-27°C、光照時間12-14h/d、光照強度800-20001x條件下繼續培養2_3周， 對內生菌進行殺滅；實驗結果表明，通過添加殺菌劑到培養基中，再經培養的外植體吸收到 體內後對內生菌進行殺滅，滅菌效果良好，3周後外植體的汙染率僅為3%。含0. 5mg/L孔雀石綠和100mg/L抗生素AAS的改良MS培養基，是在上述改良MS 培養基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0. 5mg/L孔雀石綠組成。具體操作如下含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基中的孔雀石綠和抗生素 AAS先經0. 22 y m微孔濾膜過濾除菌，然後再添加到經高溫高壓滅菌並冷卻至50-60°C的改 良MS培養基中。(5)擴繁培養將步驟(4)中經內生菌殺滅後無菌的外植體轉入叢生芽分化擴繁的改良MS培養 基繼續培養一段時間，當莖尖頂芽長到5-8mm後，切取新長出的外植體頂芽約3_5mm轉接到 附加了 2iimol/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的改良MS培養基上，於22_27°C、光照時間12_14h/ d、光照強度800-20001X條件下在培養室中進行叢生芽的分化和增殖培養；實驗結果表明， 組培苗的分化率達到90%，月增殖倍數達2. 1-3. 5，無褐化。叢生芽分化擴繁的改良MS培養基，是在上述改良MS培養基中加入2 ii mo 1 /L 6_苄氨基嘌呤(6-BA)組成的。(6)生根培養切取(5)中從組培苗莖基部分化產生的叢生苗轉至生根培養基中，於22_27°C、光
7照時間12-14h/d、光照強度800-20001X條件下在培養室中進行生根培養；實驗結果表明， 叢生苗的生根率達到100%，根系生長快且生根數達1. 6-3. 4/株，苗生長速率達9. 4mm/月， 新葉形成數達4片/月，生物量增加5. 1倍，叢生苗生長健壯且根系較發達。生根培養基是在上述改良MS培養基中加入10 u mol/L 3_吲哚丁酸(IBA)組成 的。上述改良MS培養基、叢生芽分化擴繁的改良MS培養基和生根培養基滅菌前均於 50-60°C下，調節 pH 至 5. 8，且均於 121°C、104kPa 下滅菌 17_20min。
權利要求
一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)選擇外植體從野外採集蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子體，切取莖尖，經自來水衝洗乾淨；(2)殺滅表面菌將洗淨的莖尖在超淨臺中先浸入濃度70％的乙醇溶液30 50s；接著置於濃度0.1％的升汞(HgCl2)溶液浸泡7 10min，再轉入濃度7％的雙氧水(H2O2)溶液中浸泡10 15min，最後用無菌水衝洗3 5次，作為蛇足石杉組織培養的外植體；(3)接種培養將所述外植體接種在促進莖尖生長的改良MS培養基上，置於22 27℃、光照時間12 14h/d、光照強度800 2000lx條件下進行培養2 3周；(4)殺滅內生菌將接種培養後的外植體轉至含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基上，繼續培養2 3周，培養條件同步驟(3)；對內生菌進行殺滅。(5)擴繁培養將步驟(4)經內生菌殺滅後無菌的外植體轉入叢生芽分化擴繁的改良MS培養基繼續培養一段時間，當莖尖頂芽長到5 8mm後，切取新長出的外植體頂芽約3 5mm轉接到叢生芽分化擴繁的改良MS培養基中進行組培苗的分化和增殖培養，培養條件同步驟(3)，從組培苗莖基部分化產生出叢生苗；(6)生根培養切取步驟(5)中從組培苗莖基部分化產生的叢生苗轉至生根培養基中，置於培養室進行生根培養，培養條件同步驟(3)；所述改良MS培養基由下列物質組成950mg/L硝酸鉀(KNO3)、825mg/L硝酸銨(NH4NO3)、185mg/L硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、220mg/L氯化鈣(CaCl2·2H2O)、85mg/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)、8.45mg/L硫酸錳(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)、3.1mg/L硼酸(H3BO3)、0.415mg/L碘化鉀(KI)、0.125mg/L鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)、0.025mg/L硫酸銅(CuSO4·5H2O)、0.025mg/L氯化鈷(CoCl2·6H2O)、50mg/L肌醇、1mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸吡哆醇(VB6)、0.5mg/L煙酸(VB5)、0.1mg/L鹽酸硫胺素(VB1)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二鈉(Na2 EDTA·2H2O)、6.96mg/L硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、30g/L蔗糖、5.6g/L瓊脂；所述含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基由下列物質組成在改良MS培養基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0.5mg/L孔雀石綠；所述叢生芽分化擴繁的改良MS培養基由下列物質組成在改良MS培養基中加入2μmol/L 6 苄氨基嘌呤(6 BA)；所述生根培養基由下列物質組成在改良MS培養基中加入10μmol/L 3 吲哚丁酸(IBA)。
2.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於所述步驟(1) 中切取莖尖1. 5-2. 0cm，用自來水衝洗乾淨，轉入每升滴加0. 2ml洗潔精的自來水中浸泡漂 洗20min，再用自來水衝洗乾淨。
3.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於步驟(3)中經表面滅菌後的莖尖外植體需用無菌濾紙吸乾表面水分後再用於接種培養。
4.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於所述100mg/L 抗生素AAS含30mg/L青黴素、50mg/L鏈黴素和125 u g/L兩性黴素B，100mg/L抗生素AAS 現配現用，AAS和孔雀石綠均過濾除菌後添加。
5.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於步驟(6)中 所述的生根培養所用的叢生苗為經步驟(5)中從組培苗莖基部分化產生的叢生芽長至 5-8mm 。
6.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於所述改良MS培 養基、叢生芽分化擴繁的改良MS培養基和生根培養基滅菌前均於50-60°C下，調節pH至 5. 8，且均於 121°C、104kPa 下滅菌 17_20min。
7.根據權利要求1所述的一種蛇足石杉組織培養的方法，其特徵在於所述含孔雀石 綠和抗生素AAS的改良MS培養基中的孔雀石綠和抗生素AAS先經0. 22 y m微孔濾膜過濾 除菌，然後再添加到經高溫高壓滅菌並冷卻至50-60°C的改良MS培養基。
全文摘要
本發明公開了一種蛇足石杉組織培養的方法。該方法包括選擇外植體、殺滅表面菌、接種培養、殺滅內生菌、擴繁培養和生根培養操作步驟。蛇足石杉是一種珍貴的藥用蕨類植物，對生境要求苛刻，在自然條件下生長緩慢、生產周期長，常規方法繁殖係數和生物量低，無法滿足藥品生產的需要。本發明使蛇足石杉試管苗的分化率達到90％，月增殖倍數達2.1-3.5，生根率達到100％，根系生長快且生根數達1.6-3.4/株，再生苗生長健壯且根系較發達。本發明方法簡便易行，效率高，有效地抑制了蛇足石杉外植體的汙染和褐化，促進了外植體的存活生長，成本低，為實現蛇足石杉的人工大量栽培提供了重要的技術支持。
文檔編號A01H4/00GK101889551SQ201010252709
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者楊雪飛, 梁昊, 羅建平 申請人:合肥工業大學