使用一組新型低豐度人類血漿蛋白生物標記對肝纖維化進行臨床診斷的製作方法

2023-05-15 02:33:16

專利名稱：使用一組新型低豐度人類血漿蛋白生物標記對肝纖維化進行臨床診斷的製作方法
技術領域：
本申請總體上涉及使用一組抗體診斷肝纖維化或肝硬化的方法，所述抗體靶向一組豐度非常低的新型肝瘢痕化生物標記。這些新型蛋白還可用作肝炎、肝細胞癌(HCC)的生物標記以及肝瘢痕化、肝炎和HCC的藥物靶標。
背景技術：
肝纖維化肝纖維化是創傷癒合反應，該創傷癒合反應以肝臟中瘢痕組織(即細胞外基質)的過度集聚為特徵。組織的正常結構要素被過量的非功能性瘢痕組織取代。穿刺肝臟進行活檢是診斷和評估纖維化的主要手段，但有充分證據顯示該技術有許多限制和缺點，包括患者不適、疼痛、出血以及極少數病例中的死亡。此外，如果纖維化在整個肝臟當中不是均一的，那麼，活檢可能不可靠。肝纖維化可由包括酒精和病毒在內的多種因素引起。肝硬化肝硬化是肝瘢痕化的最嚴重的形式，並且，與肝纖維化不同，通常認為肝硬化是不可逆的且具有結節。在英國，肝硬化每年引起超過6000例的死亡，在美國，肝硬化每年引起大約27，000例的死亡，肝硬化是第九大致死因素(MacSween等，Q002)， Pathology of the Liver，第四版，Churchill Livingstone)。肝硬化是 HCC 的主要風險因素，在肝癌的這個階段，唯一的治療手段是肝臟移植。在病毒誘發的肝癌病例中，肝瘢痕化和HCC可在移植後復發。有必要在可逆的肝瘢痕化早期階段診斷纖維化，從而可預防不可逆的肝硬化。C型肝炎病毒全球約1.7億人口(即世界人口的3% (參見，例如WHO、J. Viral. Hepat. 1999 ；6 :35-47))感染C型肝炎病毒(HCV、H印C)，美國約四百萬人口感染C型肝炎病毒。HCV是肝纖維化和肝硬化的主要病因。約80%急性感染HCV的個體成為慢性感染。 因此，HCV是慢性肝炎的主要病因。一旦慢性感染該病毒，若不進行治療病毒幾乎絕不清除。 在極少數病例中，HCV感染引發臨床急性疾病甚至肝衰竭。慢性HCV感染在個體間可顯著不同，其中一些個體具有臨床上不明顯的肝臟疾病或具有最輕度的肝臟疾病且從不發生併發症，而其它個體具有臨床上明顯的慢性肝炎並繼續發展為肝纖維化和肝硬化。發展成肝硬化的攜帶HCV的個體中的約20%將發展為末期肝臟疾病並且發展成原發性肝癌的風險增加。需要改進的方法來診斷患者中的肝纖維化和肝硬化。

發明內容
本發明提供檢測纖維化和肝硬化的方法。
在一種實施方式中，本發明提供檢測纖維化和肝硬化的方法，所述方法包括(a) 測定取自患者的生物樣本中的HF-相關(HF-ASS0CIATED)多肽的水平；以及(b)將所述水平(a)與所述HF-相關多肽的對照水平進行比較以確定所述纖維化的陽性診斷或陰性診斷。這些生物標記可應用於表現出纖維化的任何疾病，所述纖維化例如肝纖維化、腎纖維化、心纖維化(cardial fibrosis)、皮膚纖維化、胰纖維化等等，但在特定的實施方式中所述纖維化為肝纖維化。本發明選擇下組中的多肽14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素、甲清蛋白、 α-l-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b_結合蛋白β鏈、完整/裂解的補體C3dg、皮質類固醇結合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至？!1 5. 49處的 β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、血液結合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂轉移抑制劑蛋白、視黃醇結合蛋白4、血清對氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。這些生物標記可與國際公布W0/2008/031051中的多肽聯合使用，所述多肽包括間- α -胰蛋白酶抑制劑重鏈Η4片段、α 1抗胰凝乳蛋白酶、載脂蛋白Li、前清蛋白、白蛋白、CD5抗原樣蛋白同等型、β 2糖蛋白I、α 2巨球蛋白及免疫球蛋白成分、結合珠蛋白的α 、α2和β鏈、補體成分(C3、C4和H因子-相關蛋白1)、脂聯素、ApoE、凝血酶原、簇蛋白和血管緊張素原。在其它實施方式中，纖維化包括HF-相關多肽的差異調控。 在其它實施方式中，樣本取自血清或血漿。在另一實施方式中，本發明提供檢測HF-相關多肽的方法，所述方法包括a)從患有纖維化或肝硬化的患者中分離生物樣本，b)從未患有纖維化的患者中分離生物樣本，c) 用2D-PAGE分析來自a)和b)的樣本，以及d)比較2D-PAGE結果以鑑別在患有和未患有纖維化或肝硬化的患者之間差異表達的多肽。使用2D-PAGE時，生物標記可使用常用的寬 PH範圍檢測，所述寬pH範圍例如pH 3至pH 10、pH 3至pH 11或pH 4至pH 7。豐度非常低的生物標記可用PH 3至pH 11的任何窄pH範圍檢測，所述窄pH範圍例如但不限於 pH 3 至 pH 5. 6、pH 3 至 pH 6、pH 3. 9 至 pH 5. 1、pH 4. 7 至 pH 5. 9、pH5 至 pH 8、pH 5. 3 至 pH 6. 5、ρΗ 5. 5 至 pH 6. 7、pH 6 至 pH IUpH 6. 2 至 pH 7. 5、ρΗ 6. 3 至 pH 8. 3、pH 7 至 pH 10、pH 7 至 pH IUpH 3. 5 至 ρΗ 4·5、ρΗ 3 至 pH 7 禾口 pH 6 至 pH 9。覆蓋這些窄 pH 範圍的2D-PAGE凝膠也可用於鑑別其他疾病中的新型生物標記及藥物靶標。在另一實施方式中，本發明提供將纖維化嚴重程度分級的方法，所述方法包括a) 測定取自患者的生物樣本中至少一種HF-相關多肽的水平；以及b)將所述患者的生物樣本中的所述HF-相關多肽水平與預先測定的無纖維化至肝硬化的患者人群中的所述HF-相關多肽的水平進行比較。在另一實施方式中，本發明提供在未治療的個體中以及在治療過程中的纖維化的預後方面有用的試劑盒，所述試劑盒包含HF-相關藥劑，其中所述藥劑特異性檢測HF-相關多肽。在特定的實施方式中，所述藥劑是結合HF-相關多肽的抗體或其功能等同物。這些抗體可用於進行免疫測定，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定、蛋白斑點印跡、蛋白印跡(Western blot)、透射比濁法、散射比濁法等等。HF-相關多肽還可使用非抗體途徑來定量，例如，但不限於，使用質譜進行多反應監測。所述試劑盒可進一步包含至少一種靶標，所述靶標特異性地檢測用作預後指標的另一基因或基因產物。在另一實施方式中，本發明提供測定纖維化的預後的方法，所述方法包括(a)測定取自患者的生物樣本中的HF-相關多肽的水平；及(b)將(a)的所述水平與所述HF-相
5關多肽的對照水平進行比較以確定所述纖維化的陽性診斷或陰性診斷。


圖1至圖4這幾幅圖顯示在主要的新型生物標記的表達中觀察到的變化。每幅圖顯示2D-PAGE凝膠的放大區域，其中，所鑑別的蛋白的相應位置被圈出。圖中顯示了健康個體和肝硬化患者的代表性血漿凝膠圖像。圖1顯示脂轉移抑制劑蛋白在正常血漿中出現但在肝硬化患者血漿中減少。圖2顯示鋅-α -2-糖蛋白在正常血漿中出現但在肝硬化患者血漿中減少。圖3顯示ρΗ 5. 46至ρΗ 5. 49處的β結合珠蛋白的特徵點(feature)減少。上方的圖結合珠蛋白斑點的均勻分布陣列，該陣列顯示正常血漿和肝硬化患者血漿無顯著差別。下方的圖-在約PH 5.46至？!1 5. 49處觀察到的β結合珠蛋白斑點的放大圖像， 圖中顯示出在約PH 5.46至？!1 5. 49處觀察到的β結合珠蛋白斑點在正常血漿中出現但在肝硬化患者血漿中減少。圖4顯示肝硬化中補體C3的裂解減少。上方的圖-顯示補體C3dg未在正常血漿中出現但在肝硬化患者血漿中出現。下方的圖-顯示在補體C3a鏈的硫酯位點之前的補體C3 α鏈的片段在正常血漿中出現但未在肝硬化患者血漿中出現。
具體實施例方式下列描述概括上面總結的發明。然而，本發明不限於所描述的特定方法學、試驗方案、細胞系、動物種屬、構建體、試劑且就其本身而言可改變。同樣地，本文使用的術語僅描述特定實施方式，並非意於限定本發明的範圍。當與健康個體相比時，本發明的發明者發現多種蛋白在HCV-誘發的肝硬化患者的人類血漿樣本中差異表達。該發現通過使用在凝膠基質中雙向分離蛋白以給出離散蛋白斑點的技術來比較這些血清樣本而實現。該方法使用ΡΗ3至ρΗ 5.6的窄範圍？!1值固定？!1 梯度凝膠，該PH梯度凝膠不同於W0/2008/031051中使用的ρΗ 3至ρΗ 10的固定ρΗ梯度凝膠。除非另外定義，本文使用的所有技術術語和科學術語的含義與相關領域普通技術人員的普遍理解相同。就描述及公開的目的而言，本文提及的所有公開出版物和專利通過引用併入本文，例如，可與本發明所述的內容結合使用的公開出版物中所描述的構建體和方法學。上面討論的公開出版物及其全部內容在本發明的申請日之前被單獨提供用於公開。本文不被解釋為承認由於先於本發明的這種公開而本發明的發明人不享有在先權利。a.定義為方便起見，在下面提供說明書、實施例及附加的權利要求中採用的一些術語和短語的含義。除非上下文另外明確說明，單數形式(「a」 「an」和「the」)包括複數含義。「2D-PAGE」是指雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳。「ELISA」是指酶聯免疫吸附測定。「HCC」是指肝細胞癌。
「HCV」是指C型肝炎病毒。「HF」是指肝纖維化。「kDa」是指千道爾頓。「PBS」是指磷酸鹽緩衝鹽水。「 PBS-T 」是指含吐溫的PBS溶液。「生物樣本」包含取自有機體的、可用於診斷或監測分析的多種樣本類型。該術語包含血液和生物來源的其他液體樣本、固體組織樣本(如活檢樣本)，或者由此而來的組織培養物或細胞及其後代。另外，該術語可包含循環腫瘤細胞或其他細胞。該術語尤其包含臨床樣本，並進一步包括細胞培養中的細胞、細胞上清液、細胞裂解液、血清、血漿、尿、羊水、 生物液體及組織樣本。該術語還包含獲取後以任何方式處理的樣本，所述處理例如用試劑處理、溶解、富集某些組分。「生物分子序列」或「序列」是指多核苷酸或多肽序列的全部或部分。「BLAST」是指基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search iTool),它是檢測與給定查詢序列匹配的無間隔的子序列的一項技術。「BLASTP」是將胺基酸查詢序列與蛋白序列資料庫進行比較的BLAST程序。「BLASTX」是將核酸查詢序列(雙鏈)的六框概念翻譯產物與蛋白序列資料庫進行比較的BLAST程序。在本文中可互換使用的「癌症」、「贅生物」和「腫瘤」是指表現出異常生長表型的細胞或組織，所述異常生長表型以細胞增殖顯著失控為特徵。本發明的方法及組合物尤其應用於癌前的(即，良性的)、惡性的、轉移前的、轉移的和非轉移的細胞。「纖維化以HF-相關多肽的差異調控為特徵」是指具有表現出瘢痕化的組織的受治者，並且在所述瘢痕化的組織中HF-相關蛋白具有差異表達。「纖維化表型」是指特徵為纖維化細胞的多種生物現象。該現象可隨纖維化的類型而變化，但纖維化表型通常由瘢痕組織形成中的異常情況來鑑別。「細胞類型」是指來自給定來源(如，組織或器官)的細胞或處於給定分化狀態中的細胞，或與給定病理或基因組成相關的細胞。「互補的」是指探針分子與其靶標相互作用表面的拓撲相容性或相互配對。可將靶標與其探針描述為互補的，並且，接觸表面的特徵是彼此互補的。術語「可檢測的」是指使用本申請中描述的和本領域技術人員熟知的技術可觀察的多肽表達模式。例如，多肽表達可通過標準技術(包括諸如蛋白印跡之類的免疫測定) 來「檢測」。「診斷(「diagnosis」和「diagnosing」)」通常包括確定受治者對疾病或失調的易感性、確定受治者目前是否患有疾病或失調、對患有疾病或失調的受治者進行預後(例如， 對轉移前或轉移的癌狀態或纖維化的鑑別)和診斷評價(therametrics)(例如，監測受治者的症狀以提供關於治療效果或效力的信息)。「差異表達」是指在基因的時間表達模式和組織表達模式中量的差異及質的差異。 例如，差異表達的基因可在正常狀態與疾病狀態中使其表達被激活或完全不激活。這種性質上調控的基因可在受治者給定的組織、細胞類型或血清/血漿中表現出表達模式，所述表達模式在對照狀態或疾病狀態下是可檢測的，或在對照狀態和疾病狀態下皆可檢測但具有不同表達。如本文所使用的「差異表達的蛋白」是指唯一地鑑別出了差異表達的蛋白的胺基酸序列，從而使樣本中差異表達的蛋白的檢測與樣本中差異表達的蛋白的出現相關聯。「表達」通常是指多核苷酸序列經歷成功的轉錄和翻譯，從而表達可檢測水平的胺基酸序列或蛋白的過程。在一些語境中，表達是指mRNA的產生。在其它語境中，表達是指蛋白或其片段的產生。所述片段可通過酶切或者正常狀態或疾病狀態特有的生物過程產生。「表達產物」或「基因產物」是當有機體中的基因被轉錄或翻譯或翻譯後修飾時產生的生物分子，例如蛋白或mRNA。「蛋白片段」是指蛋白的一部分。例如，蛋白片段可包含通過消化從培養的細胞分離的全長蛋白而獲得的多肽。在一種實施方式中，蛋白片段包含至少約6個胺基酸。在另一實施方式中，所述片段包含至少約10個胺基酸。在又一實施方式中，蛋白片段包含至少約16個胺基酸。在本申請的上下文中，術語「功能等同物」是指具有與全部或部分天然HF-相關蛋白基本相似的功能特性或結構特性的蛋白。術語「功能等同物」意於包括天然HF-相關蛋白的「片段」、「突變子」、「衍生物」、「等位基因」、「雜交體」、「變體」、「類似物」或「化學衍生物，，。在免疫球蛋白的上下文中，術語「功能等同物」是指表現出與母體免疫球蛋白基本相似的免疫結合特性的免疫球蛋白分子。「免疫結合特性」是指在免疫球蛋白分子與該免疫球蛋白的特異抗原之間發生的非共價相互作用類型。實際上，例如，單克隆抗體免疫球蛋白的功能等同物可抑制母體單克隆抗體與其抗原結合。功能等同物可包含F(ab' )2片段、 F(ab)分子、Fv片段、噬菌體展示技術單鏈可變片段(scFv)、單結構域抗體、嵌合抗體等等， 只要免疫球蛋白表現出母體免疫球蛋白的特性。術語「融合蛋白」是指由兩個或兩個以上多肽構成的蛋白，雖然典型地，所述多肽不以天然狀態連接，但所述多肽由其相應的氨基和羧基末端通過肽鍵連接形成單一的連續多肽。應當理解的是，兩個或兩個以上的多肽成分可直接相連或通過肽連接體/間隔區間接相連。「基因」是指包含產生多肽或前體所需的調控序列和編碼序列的多核苷酸序列。多肽可由全長編碼序列編碼或由編碼序列的任何部分編碼。基因可構成不間斷的編碼序列或者基因可包含以合適的剪接位點為邊界的一個或一個以上內含子。此外，基因在編碼區或非翻譯區內可包含一種或一種以上修飾，所述修飾可影響表達產物的生物活性或化學結構、表達速率或表達調控方式。這樣的修飾包括但不限於一個或一個以上核苷酸的突變、 插入、缺失和取代。就這點而言，這樣修飾的基因可稱為「天然」基因的「變體」。「基因表達」是指多核苷酸序列經歷成功的轉錄和翻譯，從而表達可檢測水平的核苷酸序列的過程。如本文所使用的術語「同源性」是指互補性的程度。可存在部分同源或完全同源 (即，一致)。部分互補序列是至少部分抑制相同序列與靶多核苷酸的雜交的序列；部分互補序列也是指使用功能性術語「基本同源」。低嚴格條件下，對完全互補序列與靶序列雜交的抑制可使用雜交測定(DNA印跡(Southern blot)或RNA印跡(Northern blot)、液相雜交等等)來檢測。低嚴格條件下，基本同源的序列或探針將競爭並抑制完全同源的序列或探針與靶序列的結合(即，雜交)。這不是說低嚴格條件是允許非特異性結合的條件；低嚴格條件要求兩序列的彼此結合是特異性的(即，選擇性的)相互作用。沒有非特異性結合可通過使用第二靶序列來檢驗，所述第二靶序列甚至缺乏部分互補程度(如，低於30%的一致性)；沒有非特異性結合時，探針將不會與第二非互補的靶序列雜交。本文可互換使用的「個體」、「受治者」、「宿主」和「患者」是指需要診斷、處理或治療的任何哺乳動物受治者。在一種優選的實施方式中，個體、受治者、宿主或患者是人類。其他受治者包括已知發生了 HCC和肝炎的土撥鼠和鴨。其他受治者可包括，但不限於牛、馬、 狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、靈長類及小鼠。「分離的」是指在與天然生成多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主細胞的環境不同的環境中的多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主細胞。「標記」是指能夠直接提供可檢測的信號的藥劑或通過與信號產生系統中的一個或一個以上額外成員相互作用而提供可檢測的信號的藥劑。可直接檢測且可在本發明中使用的標記包括螢光標記。具體的螢光基團包括螢光素、羅丹明、B0DIPY、花青染料等等。本發明還考慮使用放射性同位素(例如MS、32P、3H，等等)作為標記。也可使用諸如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚乙烯、乳膠)珠之類的色度標記。參見，例如，美國專利第 4，366，241 號、第 4，277，437 號、第 4，275，149 號、第 3，996，345 號、第 3，939，350 號、第 3，850，752 號和第 3，817，837 號。術語「正常生理條件」是指有生命的有機體或細胞內的典型條件。儘管一些器官或有機體提供極端條件，但是有機體內和細胞內環境通常在PH 7左右(S卩，從pH 6.5至pH 7. 5)變化，包含水作為主要溶劑，並存在於高於0°C且低於50°C的溫度條件下。不同鹽濃度取決於用作參考的器官、有機體、細胞或細胞區室。本文可互換使用的「多核苷酸」和「核酸」是指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，這些術語包括，但不限於單鏈、雙鏈或多鏈的DNA或 RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體或包含嘌呤鹼基和嘧啶鹼基或其他天然的、化學或生物化學修飾的、非天然的或衍生的核苷酸鹼基的多聚體。這些術語還包括，但不限於包含內含子序列的mRNA或cDNA。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基團(如通常可在RNA或 DNA中發現的)或者修飾的或取代的糖或磷酸基團。可選地，多核苷酸骨架可包含諸如亞磷醯胺之類的合成亞單位的多聚體，因此多核苷酸骨架可為寡脫氧核苷酸的氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸雙酯寡聚體。多核苷酸可包含修飾的核苷酸(例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物)、尿嘧啶、其他糖和諸如氟代核糖和硫代酯之類的連接基團，以及核苷酸支鏈。核苷酸序列可由非核苷酸成分打斷。多核苷酸可在聚合後進行進一步修飾，例如通過與標記成分結合來修飾。此定義中包括的其他類型的修飾為加帽、用類似物取代天然生成的核苷酸中的一個或一個以上，以及引入多核苷酸連接於蛋白、金屬離子、標記成分、其他多核苷酸或固相支持物的方法。術語「多核苷酸」還包括肽核酸。多核苷酸可進一步包括基因組DNA、cDNA或DNA-RNA雜交體。本文可互換使用的「多肽」和「蛋白」是指任何長度的胺基酸的聚合形式，可包括翻譯的、非翻譯的、化學修飾的、生物化學修飾的和衍生的胺基酸。多肽或蛋白可為天然生成的、重組的或合成的或這些的任何組合。此外，多肽或蛋白可包含天然生成的蛋白或肽的片段。多肽或蛋白可為單個分子或可為多分子複合物。另外，這樣的多肽或蛋白可具有修飾的肽骨架。這些術語包括融合蛋白，所述融合蛋白包括含有異源胺基酸序列的融合蛋白， 含有異源和同源前導序列的、含有或不含有N-末端蛋氨酸殘基、免疫標記蛋白的融合蛋白等等。疾病或失調的「易染病體質」指個體對該疾病或失調的易感性。例如，與正常/野生型個體相比，易感的個體在統計學上更可能患上癌症或纖維化。術語「預後(「prognosis」和「prognose」)」是指預測疾病過程的行為或技術。另夕卜，該術語是指通過疾病的一般過程所預期的或由個體病例的特定特徵所顯示的從疾病中生存並恢復的前景。此外，該術語是指根據其體徵和症狀鑑別疾病的行為或技術。術語「預後指標」或「指標」是指可作為預後的根據或基礎的任何事物或與預後的根據或基礎相關的任何事物。這些術語進一步指鑑別診斷的任何根據或基礎，包括如本文描述的測試結果和基因表達的特性，以及將疾病或病症與表現出類似症狀的其他疾病或病症相區分。另外，術語「指標」或「預後指標」是指包括如本文描述的測試結果和基因表達的特性在內的任何根據或基礎，術語「指標」或「預後指標」可用於區分惡性疾病可能的過程。「蛋白捕獲劑」是指可將蛋白結合於自身的分子或多分子複合物。在一種實施方式中，蛋白捕獲劑以基本特異的方式結合它們的結合配偶體。在一種實施方式中，蛋白捕獲劑可表現出低於約10-6的解離常數(KD)。蛋白捕獲劑可包含諸如蛋白或多核苷酸之類的生物分子。該生物分子可進一步包含天然生成的、重組的或合成的生物分子。蛋白捕獲劑的例子包括免疫球蛋白、抗原、受體或其他蛋白或其部分或片段。此外，應當理解的是，蛋白捕獲劑不限於僅通過非共價相互作用與其結合配偶體相互作用的藥劑。相反，蛋白捕獲劑還可共價連接於與它們結合的蛋白。例如，蛋白捕獲劑在結合後可與其結合配偶體發生光交聯。「序列一致性」是指相似或互補的程度。可存在部分一致性或完全一致性。部分互補序列是至少部分抑制相同序列與靶多核苷酸雜交的序列；也指使用功能性術語「基本一致」。低嚴格條件下，對完全互補序列與靶序列的雜交的抑制可使用雜交測定(DNA印跡或 RNA印跡、液相雜交等等)來檢測。低嚴格條件下，基本一致的序列或探針將競爭並抑制完全一致序列或探針與靶序列的結合(即，雜交)。這不是說低嚴格條件是允許非特異性結合的條件；低嚴格條件要求兩序列彼此的結合是特異性的(即，選擇性的)相互作用。沒有非特異性結合可使用第二靶序列來檢驗，所述第二靶序列甚至缺乏部分程度的互補性(如， 低於30%的一致性)，沒有非特異性結合時，探針將不會與第二非互補靶序列雜交。本文中對兩個核酸或多肽序列觀察序列一致性的另一方法包括參考當在特定區域內進行最大對應性的比對時的兩個序列中的相同殘基。如本文所使用的序列一致性的百分數是指通過在比較窗口中比較兩個最佳對齊序列而測定的值，其中與兩個序列的最佳比對的參考序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口中部分多核苷酸序列可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分數通過下列方式計算測定在兩條序列中都出現的相同核酸鹼基位點的數目以產生匹配位點數目，用匹配位點數目除以比較窗口中位點的總數，然後將結果乘以100，從而產生序列一致性的百分數。「嚴格條件」是指在此條件下探針可與其靶多核苷酸序列雜交而不與其他序列雜交的條件。嚴格條件是依賴序列的(例如，較長序列在較高溫度的條件下特異性雜交)。通常，選擇嚴格條件為約5°C，低於特定序列在限定的離子強度和pH條件下的熱熔點(Tm)。Tm 是平衡時50%與靶序列互補的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和多核苷酸濃度條件下)。典型地，嚴格條件對短探針(例如，10至50個核苷酸)而言是約pH 7. 0
10至約pH 8.3,鹽濃度為至少約0. OlM至約1. OM的鈉離子濃度(或其他鹽)，且溫度為至少約30°C的條件。嚴格條件還可通過加入諸如甲醯胺之類的去穩定劑而實現。「基本純化的」是指從自然環境中分離出來的化合物，且所述化合物至少約60%， 至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約83%，至少約85%，至少約 88 %，至少約90 %，至少約91 %，至少約92 %，至少約93 %，至少約94 %，至少約95 %，至少約96%，至少約97%，至少約98%，至少約99%，至少約99. 9%，或至少約99. 99%或更多不含與其天然結合的其它組分。「靶蛋白」是指與蛋白捕獲劑特異性雜交或結合的多肽，所述多肽通常來源於生物樣本。所述靶蛋白的存在或缺乏會被檢測，或者所述靶蛋白會被定量。所述靶蛋白具有可被指向靶標的相應的蛋白捕獲劑識別的結構。所述靶蛋白或胺基酸還可指蛋白捕獲劑所指向的更大蛋白的特定亞結構或期望檢測其表達水平的整體結構(例如，基因或mRNA)。術語「治療(「treatment」，「treating」，「treat」，等等)」是指獲得預期的藥理學和/或生理學效果。所述效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可為預防性的，和/或所述效果就部分或完全穩定或者部分或完全治癒疾病和/或由疾病引起的不利影響而言可為治療性的。「治療」包括哺乳動物(尤其是人類)疾病的任何治療，並包括(a)預防在受治者中發生疾病或症狀，所述受治者可易於感染所述疾病或症狀但尚未診斷出患有該疾病或症狀；(b)抑制疾病症狀，即，阻止其發展；或者(c)緩解疾病症狀，即，使疾病或症狀復原。b. HF-相關多肽一方面，本發明涉及「HF-相關多肽」，所述「HF-相關多肽」包括其差異表達與肝纖維化相關的多肽。HF-相關多肽還包括天然生成的蛋白的變體，其中這樣的變體與天然生成的蛋白相同或基本相似。總體上，由BLAST檢測時，變體多肽的序列與本文描述的HF-相關多肽具有至少約80 %的序列一致性，通常具有至少約90 %的序列一致性，且更通常地，具有至少約98%的序列一致性。變體多肽可為天然或非天然糖基化的。總體上，如用本領域熟知的方法(例如BLAST)所測定的，本文描述的HF-相關多肽的變體具有大於至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約83%、至少約85 %、至少約88 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %、至少約99. 9 %或可大於至少約99. 99%的序列一致性。在一種實施方式中，變體HF-相關多肽可為突變多肽。HF-相關多肽中的突變可由胺基酸取代、添加或缺失(但不限於此)產生。胺基酸取代可為保守胺基酸取代或去除非必須胺基酸的取代。總體上，保守胺基酸取代是保持被取代胺基酸的常規電荷、疏水性、親水性和/或位阻效應的胺基酸取代。在一些突變的HF-相關多肽中，胺基酸可被取代以改變磷酸化位點或乙醯化位
點ο重要的是，變體多肽可設計成保持或具有提高的蛋白特定區域(例如，功能性結構域和/或與共有序列有關的區域，其中多肽是蛋白家族成員)的生物活性。用於產生變體的胺基酸改變的選擇可基於胺基酸的可接近性(內部的與外部的)、變體多肽的熱穩定性、預期糖基化位點、預期二硫橋、預期的金屬結合位點及脯氨酸環內的預期取代。半胱氨酸耗竭突變蛋白可依照美國專利第4，959，314號的公開內容而產生。變體還包括本文公開的HF-相關多肽的片段，尤其是生物活性片段及對應於功能結構域的片段。典型地，目標片段將為至少約IOaa至至少約15aa長，通常至少約50aa長， 並可長達300aa或更長。本文描述的蛋白變體由本發明範圍內的多核苷酸編碼。本發明的HF-相關多肽在非天然生成的環境中提供，例如，從其天然生成的環境中分離。在一些實施方式中，HF-相關蛋白以基本純化的形式存在。c. HF-相關藥劑調節劑及結合配偶體另一方面，本發明提供「HF-相關藥劑」，所述HF-相關藥劑是指由「HF-相關多肽結合配偶體」構成的一類分子。HF-相關多肽結合配偶體是結合於HF-相關多肽的分子。示例性的多肽結合配偶體是免疫球蛋白。結合配偶體可調節HF-相關多肽的生物活性，但毋需如此。d.免疫球蛋白用於鑑別HF-相關蛋白的HF-相關藥劑包括特異性結合於HF-相關多肽的免疫球蛋白及免疫球蛋白的功能等同物。術語「免疫球蛋白」和「抗體」可互換使用且在本文中以其最廣的意義使用。因此，「免疫球蛋白，，和「抗體」包括完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出預期的生物活性。在一種實施方式中，受治者免疫球蛋白包含至少一個人類恆定結構域。 在另一實施方式中，HF-相關藥劑免疫球蛋白包含表現出與人類恆定結構域至少約90%至 95%的序列一致性但保持人類效應功能的恆定結構域。免疫球蛋白HF-相關藥劑或其功能等同物可為人類的、嵌合的、人源化的、鼠的、CDR-嫁接的、噬菌體展示的、細菌展示的、酵母展示的、轉基因小鼠產生的、誘變的和隨機化的。i. 一般性抗體術語「抗體」和「免疫球蛋白」包括可結合抗原的完全組裝的抗體和抗體片段(例如，Fab』、F』(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙價小抗體)，包括重組抗體和抗體片段。優選地，免疫球蛋白或抗體是嵌合的、人類的或人源化的。重鏈和輕鏈的可變結構域識別同源抗原的特定表位或結合於同源抗原的特定表位。術語「表位」是指免疫球蛋白的可變末端結合的抗原上的特異性結合位點或抗原決定簇。表位可為線性的，即，由在原HF-相關序列中發現的胺基酸殘基序列組成。表位也可為構象的，從而使得免疫球蛋白識別在摺疊的HF-相關分子中發現的3-D結構。表位也可為線性與構象性元件的組合。此外，如由目標方位的腫瘤細胞表達的分子的碳水化合物部分也可為表位。如果1)免疫球蛋白表現出結合活性的閾值水平，和/或2)免疫球蛋白不與已知的相關多肽分子進行顯著地交叉反應，那麼認為所述免疫球蛋白是「特異性結合的」。本領域普通技術人員可容易地測定免疫球蛋白的結合親和力，例如，通a^atchard分析 (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51 :660-672,1949)來測定。在一些實施方式中，本發明的免疫球蛋白以高於其他蛋白至少IO3倍，更為優選地至少104倍，更為優選地至少IO5倍，甚至更為優選地至少IO6倍的水平結合於HF-相關蛋白。ii.多克隆抗體和單克隆抗體本發明的免疫球蛋白可為多克隆的或單克隆的，並可由任何本領域熟知的方法產生。優選地，多克隆抗體通過多次皮下(sc)、腹膜內(ip)或肌肉內(im)注射相關抗原和佐劑而在動物中產生。將相關抗原結合於蛋白可以是有用的，所述蛋白在待免疫的物種中是免疫原性的。另外，諸如明礬之類的聚集劑或其他藥劑適用於增強免疫反應。術語「單克隆抗體」指從基本同源的抗體群獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原位點。此外，與典型地包括針對不同決定簇的不同抗體的多克隆抗體的製備不同，每個單克隆抗體針對抗原的單個決定簇。除了其特異性外，單克隆抗體的優點還在於他們可被合成而不被其他免疫球蛋白汙染。例如，單克隆抗體可通過雜交瘤方法或通過重組DNA方法產生。單克隆抗體HF-相關藥劑還可從噬菌體抗體文庫中分離。iii.嵌合抗體和人源化抗體根據可變區可來自一個物種(例如嚙齒類)，恆定區可來自第二物種(例如人)這種定義，HF-相關多肽結合免疫球蛋白或抗體可為「嵌合的」。非人類HF-相關蛋白結合抗體的「人源化」形式是嵌合抗體，所述嵌合抗體含有來自非人類免疫球蛋白的最少序列。大多數情況下，人源化抗體是其中受體高變區的殘基被具有期望的特異性、親和性及能力的非人類物種高變區的殘基(供體抗體)取代的人類免疫球蛋白(受體抗體)，所述非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類。一些情況下，人類免疫球蛋白的骨架區(FR)殘基被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現的殘基。通常，人源化抗體可包含基本全部的至少一個可變結構域，且典型地，人源化抗體可包含基本全部的兩個可變結構域，其中，全部或基本全部高變環對應於非人類免疫球蛋白的高變環且全部或基本全部FR是人類免疫球蛋白序列的FR。在一種實施方式中，人源化抗體包含表現出與受體(非人類)FR(例如，鼠FR)的序列一致性為至少65%的人源化FR。 人源化抗體還可包含免疫球蛋白恆定區(Fe)(尤其是人類免疫球蛋白)的至少一部分。本領域已描述了對非人類抗體進行人源化的方法。優選地，人源化抗體含有從非人類來源引入的一個或一個以上胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基通常稱為「導入」殘基，這些非人類胺基酸殘基典型地取自「導入」可變結構域。人源化基本上可通過用高變區序列取代人類抗體的相應序列來實現。因此，這樣的人源化抗體是嵌合的，其中，用非人類物種中的相應序列取代基本上小於完整人類可變結構域的區域。實際上，典型地，人源化抗體是人類抗體，在該人類抗體中，一些高變區殘基以及可能是一些FR殘基被嚙齒類抗體類似位點中的殘基取代。待用於製備人源化抗體的人類可變結構域(輕鏈和重鏈)的選擇對降低抗原性是非常重要的。其他方法一般包括對抗體受體可變區骨架賦予供體⑶R結合親和力。一種方法包括同時嫁接並優化可變區結合片段的結合親和力。另一方法涉及優化抗體可變區的結合親和力。iv.抗體片段「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab』、F (ab』)2、Fv片段、雙價小抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。
對抗體進行木瓜酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段具有單個抗原結合位點，以及殘餘的「Fe」片段。Fab片段還包含輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區(CHI)。胃蛋白酶處理產生含有兩個抗原結合位點的F (ab』)2片段且該片段仍能與抗原交聯。Fab』片段與Fab片段不同之處在於Fab』片段的重鏈CHI結構域羧基末端添加了幾個殘基，所述殘基包括抗體鉸鏈區的一個或一個以上半胱氨酸。Fab』 -SH是其中恆定結構域的半胱氨酸殘基具有至少一個游離的巰基的Fab』在本文中的名稱。F(ab』)2抗體片段起初作為成對Fab』片段而產生，所述成對Fab』片段之間含有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學偶聯為本領域所熟知的。「Fv」是包含完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區域由一個重鏈可變結構域與一個輕鏈可變結構域以緊密的非共價結合方式形成的二聚體構成。在此構型中，每個可變結構域的三個高變區互相作用以限定VH-VL 二聚體表面的抗原結合位點。六個高變區共同地賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單個可變結構域(或只包含對抗原特異的三個高變區的Fv的一半)也有能力識別並結合抗原，儘管親和力比整個結合位點低。「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體的VH和VL結構域，其中，這些結構域存在於單個多肽鏈中。Fv多肽可進一步包含VH和VL結構域之間的多肽連接體，所述多肽連接體能夠使scFV形成抗原結合的預期結構。參見PLUCKTHUN，113THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES 269-315 (Rosenburg 和 Moore 主編 1994)。另外參見國際公布 WO 93/16185、美國專利第 5，587，458 號和第 5，571，894 號。為了產生抗體片段已開發出多種技術。傳統地，這些片段通過蛋白酶水解消化完整抗體而得到。然而，現在這些片段可直接由重組宿主細胞產生。v.結合與標記抗-HF-相關蛋白抗體可以它們「裸露的」形式或非結合的形式給藥，或可具有與它們結合的其它藥劑。例如抗體可為可檢測地標記的形式。抗體可通過使用放射性同位素、親和標記 (例如生物素、親和素等)、酶標(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記(例如 FIFC或羅丹明等)、順磁性原子等等而被可檢測地標記。實現這樣的標記的過程為本領域所熟知的。vi.雙特異性抗體本發明的雙特異性抗體是含有兩個抗原結合位點的小抗體片段。每一片段包含重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域(VH)連接於在同一多肽鏈(VH-VL)中的輕鏈可變結構域(VL)。通過使用長度太短以致於無法使在同一條鏈上的兩個結構域配對的連接體， 結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。製備雙特異性抗體的方法為本領域所熟知。全長雙特異性抗體的傳統生產是基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩條鏈具有不同的特異性。在另一方法中，具有預期的結合特異性的抗體可變結構域(抗體-抗原結合位點) 可融合於免疫球蛋白恆定結構域序列。具體地，可變結構域與免疫球蛋白重鏈恆定結構域融合，所述重鏈恆定結構域包含至少部分鉸鏈區、CH2區和CH3區。在一種實施方式中，融合蛋白包含第一重鏈恆定區(CHI)，因為它含有輕鏈結合必需的位點。編碼免疫球蛋白重鏈融合和免疫球蛋白輕鏈(如果需要的話)的多核苷酸可插入單獨的表達載體中並共轉染到合適的宿主有機體內。當構建體中所使用的不等比例的三條多肽鏈提供最優產量時，上述方法在調整實施方式中的三個多肽片段的相互比例方面提供高度的靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相等速率表達引起高產時，或者當所述速率沒有特別意義時，在一個表達載體中插入兩條或全部三條多肽鏈的編碼序列是可能的。雙特異性抗體還使用亮氨酸拉鏈和單鏈Fv (sFv) 二聚體來產生。e.纖維化治療的診斷、預後及評估因此，另一方面，本發明提供使用本文描述的HF-相關多肽診斷及預後纖維化的方法。在具體的非限制性實施方式中，該方法在檢測細胞或血清/血漿中的HF-相關多肽、 促進受治者中纖維化的診斷和受治者中纖維化嚴重性的診斷、促進受治者預後的確定、測定受治者對纖維化的易感性及評估受治者對治療的響應性(例如，通過提供對治療效果的測量(例如，在化療方案之中或之後評估腫瘤負荷))方面有用。這些方法可包括檢測患者生物樣本(例如，血清/血漿或疑似或即將產生的纖維化組織或細胞)中HF-相關多肽的水平。本發明的檢測方法可在分離的細胞上或在全部組織或體液(例如，血液、血漿、血清、 尿液，等等)中體外或體內實施。在一種實施方式中，HF-相關多肽可用來檢測並評估纖維化。這些生物標記可應用於表現出纖維化的任何疾病，例如肝纖維化、腎纖維化、心纖維化、 皮膚纖維化、胰纖維化等，但更優選地，所述纖維化是肝纖維化。f.檢測HF-相關多肽本發明提供檢測血清或血漿中HF-相關多肽的方法。各種已知方法中的任何一種均可用於檢測，包括但不限於使用編碼的多肽的特異性抗體的免疫測定和對編碼的多肽的功能性檢測，所述使用編碼的多肽的特異性抗體的免疫測定例如，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、蛋白斑點印跡、蛋白印跡、透射比濁法、散射比濁法等等； 所述對編碼的多肽的功能性檢測例如生物活性。HF-相關多肽還可使用非抗體途徑來定量， 所述非抗體途徑例如，但不限於，使用質譜進行多反應監測。在閱讀本發明的說明書之後，對本領域普通技術人員來說顯而易見的是，本文所述的檢測方法和其他方法可易於改變。這樣的改變在本發明預期的範圍之內。例如，在上面的檢測方案中，檢測中使用的探針可固定於固相支持物上，且測試樣本與固定的探針接觸。測試樣本與探針的結合隨後可以各種方式檢測，例如，通過檢測結合於測試樣本的可檢測標記，從而有利於檢測測試樣本-固定的探針複合物。本發明進一步提供使用HF-相關多肽的特異性抗體檢測生物樣本中HF-相關多肽的存在和/或測量HF-相關多肽水平的方法。具體地，檢測生物樣本中HF-相關多肽的存在的方法可包含如下步驟使樣本與單克隆抗體接觸並檢測樣本中抗體與HF-相關多肽的結合。更具體地，抗體可使用化合物來標記，從而產生可檢測信號，所述化合物包括但不限於放射性標記、酶、發色團和螢光基團。與合適的對照相比時，檢測到HF-相關多肽的特異性抗體或其功能等同物的特異性結合是HF-相關多肽存在於樣本中的象徵。合適的對照包括已知不含HF-相關多肽的樣本和與非特異性針對編碼的多肽的抗體(例如，抗-獨特型抗體)接觸的樣本。本領域已知檢測特異性抗體-抗原相互作用的各種方法並可用於下列方法，包括但不限於，標準免疫組織學方法、免疫沉澱、酶免疫分析和放射免疫測定。一般而言，特異性抗體將直接或間接地被可檢測地標記。直接標記包括放射性同位素；產物可檢測的酶(例如，螢光素酶、3-半乳糖苷酶，等等)；螢光標記(例如，異硫氰酸螢光素、羅丹明、藻紅蛋白，等等)；發射螢光的金屬(例如，通過諸如EDTA之類的金屬螯合基團連接於抗體的112Eu或鑭系元素的其他成員)；化學發光化合物(例如，魯米諾、異魯米諾、吖啶鹽，等等)；生物發光化合物(例如， 螢光素、水母蛋白(綠色螢光蛋白)，等等)。抗體可連接(偶聯)於不溶支持物，例如聚苯乙烯板或珠。非直接標記包括編碼的多肽的特異性抗體(「特異性一抗」)的特異性二抗和特異性結合配對物的成員，其中，所述二抗如上文所述被標記，所述特異性結合配對物的成員例如，生物素-親和素，等等。生物樣本可接觸並固定於諸如硝化纖維之類的固體支持物或載體上，所述固體支持物或載體能夠固定細胞、細胞顆粒或可溶蛋白。隨後所述支持物可用合適的緩衝液來洗滌，然後與可檢測地標記的特異性一抗接觸。檢測方法是本領域所知曉的並將根據可檢測標記發射的信號來選擇檢測方法。檢測一般通過與合適對照及合適標準進行對比來實現。g.試劑盒檢測方法可作為試劑盒的部分而提供。因此，本發明還提供用於檢測生物樣本中 HF-相關多肽的存在和/或檢測HF-相關多肽水平的試劑盒。使用這些試劑盒的步驟可由臨床實驗室、實驗性實驗室、醫師或個人進行。本發明的試劑盒用於檢測在纖維化過程中差異性表達的HF-相關多肽。該試劑盒可提供在步驟中有用的額外組分，包括，但不限於，緩衝劑、展開劑、標記、反應表面、檢測方法、對照樣本、標準、說明書及解釋信息。實施例比較來自健康個體的血漿與來自肝硬化患者的血漿時建立的差異表達蛋白與健康個體相比時，本發明的發明者發現多種蛋白在HCV-誘發的肝硬化患者的人類血漿樣本中差異表達。該發現通過使用雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳OD-PAGE)來比較這些血漿樣本而實現，所述雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳是一種在凝膠基質上雙向分離蛋白得到離散蛋白斑點的技術。使用寬範圍PH 3至pH 10的2D-PAGE先前已在國際公布 W0/2008/031051中使用以鑑別肝纖維化的血清中的生物標記。本發明中纖維化生物標記的鑑別不同於國際公布W0/2008/031051，因為使用了窄範圍pH 3至pH 5.6。選擇此pH範圍是因為它在三種豐度最高的血漿/血清蛋白(清蛋白、IgG、鐵傳遞蛋白)的主要同等型的範圍之外。這是首次將該PH 3至pH 5. 6範圍用於生物標記的發現。新型生物標記在疾病中的發現受血清和血漿中的跨越了十個數量級的動態蛋白濃度範圍的限制。因此，高豐度蛋白(尤其是白蛋白、免疫球蛋白和鐵傳遞蛋白)限制了低豐度蛋白的檢測。為了克服尋找生物標記中的這個問題，很多人嘗試了基於抗體和基於染料親和力的初步分離策略以在電泳前從樣本中將高豐度蛋白耗竭從而提高低豐度蛋白的表現。但是，免疫沉澱法是昂貴的，因為需要大量抗體來耗竭這些高豐度的蛋白，而染料親和法效率較低且特異性較低，伴隨著大量非白蛋白的不必要的去除，且因此可能在蛋白質組分析中除去了潛在的生物標記。不像本發明使用的大量蛋白Omg)，由於高豐度蛋白除去過程中的回收問題以及濃縮過程中的損失，多個樣本在耗竭後以類似的高水平蛋白加樣很有挑戰性。雖然有血漿中高豐度蛋白的問題，國際公布W0/2008/031051中已在寬範圍pH 3至PH 10中使用2D-PAGE成功鑑別了肝纖維化的幾個新型候選生物標記。本申請中，這組肝纖維化的生物標記通過使用窄範圍PH 3至pH 5.6的20^^^得以增加，該範圍在白蛋白、免疫球蛋白和鐵傳遞蛋白的主要同等型範圍之外，從而使得加樣的蛋白比國際公布 TO/2008/031051多四倍。這使低豐度特徵點的表現得以提高且使分離得以改善。使用此 PH範圍實現了血清酸性蛋白組及血漿酸性蛋白組基於凝膠的分離得以顯著改善，並使在使用寬範圍PH 3至pH 10的國際公布W0/2008/031051中不可見的低豐度肝纖維化生物標記得以鑑別。實施例1雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳QD-PAGE)為了鑑別HCV-誘發的肝瘢痕化的生物標記，在基於2D-PAGE的蛋白組學研究中分析健康個體的血漿樣本和HCV-誘發的肝硬化患者的血漿樣本(每組6名個體)。全部血漿樣本收集於PlOO管(BD，Oxford，UK)中。選擇這些PlOO血漿管是因為與其他血液收集管不同，它們含有專有蛋白穩定劑，所述專有蛋白穩定劑當血液被收集時立刻溶解，所述專有蛋白穩定劑提高蛋白的回收及保存，使它們適用於蛋白組分析和生物標記的發現。與分析來自不同程度肝纖維化患者的血清的國際公布WCV2008/031051不同，本發明僅集中探討來自健康個體的樣本和來自肝硬化患者的樣本之間差異表達的蛋白。採用該方法是因為先前在輕度纖維化和中度纖維化中鑑別的所有差異表達蛋白在肝硬化中也被發現，這表明在本研究中分析這些中間階段將不會產生任何其它候選纖維化生物標記。將2毫克血漿蛋白在第一向凝膠中使用PH 3至pH 5. 6的非線性梯度通過電荷分離，然後在第二向中使用 9%至16% (w/v)的SDS-PAGE梯度通過分子量(尺寸)分離。如Gangadharan等，(2007) 在Clin. Chem.，53，1792中所述的那樣進行電泳、螢光染色和凝膠掃描。實施例2 差異圖像分析與蛋白鑑別通過計算機輔助圖像分析，在正常血漿樣本與肝硬化血漿樣本之間比較生成的斑點的二維陣列。全部2D-PAGE凝膠的掃描圖像由如Gangadharan等，Q007)，Clin. Chem.， 53，1792所述的計算機輔助圖像分析來進行分析。大於或等於2倍差異的差異表達改變被認為是顯著的。如Gangadharan等，(2007)，Clin. Chem.，53，1792所述，總共57個差異表達的特徵點被切割、用胰蛋白酶消化並進行質譜分析。實施例3鑑別肝硬化引起的肝纖維化的人類血漿生物標記差異圖像分析顯示了潛在的血漿生物標記的初步證據。參見圖1至圖4。該分析顯示脂轉移抑制蛋白、鋅-α-2-糖蛋白、pH 5.46至？!1 5. 49處的β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b-結合蛋白β鏈、對氧磷酶/芳香酯酶1、 視黃醇結合蛋白4、甲清蛋白、α -2-HS-糖蛋白、皮質類固醇結合球蛋白、富亮氨酸α _2_糖蛋白和纖維蛋白原Y鏈的表達在肝硬化血清中減少了，而完整補體C3dg、免疫球蛋白J鏈、 性激素結合球蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素和α-1-抗胰蛋白酶的表達增加了。還觀察到糖蛋白血液結合素的翻譯後修飾。已在國際公布WCV2008/031051中所述的纖維化生物標記也被鑑別⑶5抗原樣蛋白和Iga / κ鏈增加；α -1-抗胰凝乳蛋白酶、簇蛋白、補體C4、間- α -胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和運甲狀腺素蛋白減少。就間- α -胰蛋白酶抑制劑重鏈H4而言，由質譜對肽序列的分析證實該蛋白的未裂解形式減少了，而先前在國際公布W0/2008/031051中只有35kDa和 70kDa的裂解片段被鑑別為是減少的。所有上述蛋白被質譜分析鑑定為最高得分蛋白。在凝膠特徵點中鑑別出其他較低得分蛋白，儘管不能被排除，但是所述較低得分蛋白較不可能是產生差異表達改變的原因。 鑑別出的較低得分蛋白是IgX鏈和載脂蛋白AI增加，白蛋白、AMBP、凝血酶原、色素上皮衍生因子和血清澱粉樣P-組分減少。
權利要求
1.一種檢測及評估纖維化/肝硬化嚴重性的方法，所述方法包括a)測定取自患者的生物樣本中的至少一種HF-相關多肽的水平；以及b)將(a)的所述水平與所述HF-相關多肽的對照水平進行比較以確定所述纖維化的陽性診斷或陰性診斷。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述纖維化是肝纖維化。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述多肽選自14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素、甲清蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b結合蛋白β鏈、 完整/裂解的補體C3dg、皮質類固醇結合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至？!1 5. 49處的β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、血液結合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂轉移抑制劑蛋白、視黃醇結合蛋白4、血清對氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其中，所述纖維化包括HF-相關多肽的差異調控。
5.如權利要求1所述的方法，其中，所述生物樣本為血清或血漿。
6.一種將纖維化的嚴重性分級的方法，所述方法包括a)測定取自患者的生物樣本中的至少一種HF-相關多肽的水平；以及b)將所述患者的生物樣本中的所述HF-相關多肽水平與預先測定的無纖維化至肝硬化的患者群中的所述HF-相關多肽的水平進行比較。
7.如權利要求6所述的方法，其中，所述纖維化是肝纖維化。
8.如權利要求6所述的方法，其中，所述多肽選自14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素、甲清蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b結合蛋白β鏈、 完整/裂解的補體C3dg、皮質類固醇結合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至？!1 5. 49處的β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、血液結合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂轉移抑制劑蛋白、視黃醇結合蛋白4、血清對氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。
9.如權利要求6所述的方法，其中，所述纖維化包括HF-相關多肽的差異調控。
10.一種用於纖維化的預後的試劑盒，所述試劑盒包含HF-相關藥劑，其中，所述藥劑特異性檢測HF-相關多肽。
11.如權利要求10所述的試劑盒，其中，所述藥劑是結合HF-相關多肽的抗體或其功能等同物。
12.如權利要求11所述的試劑盒，其中，所述抗體用於進行ELISA分析。
13.—種檢測HF-相關多肽的方法，所述方法包括a)從患有纖維化的患者中分離生物樣本，b)從未患有纖維化的患者中分離生物樣本，c)用2D-PAGE分析來自a)和b)的樣本，d)比較2D-PAGE結果以鑑別在患有纖維化和未患有纖維化的患者之間差異表達的多肽。
14.一種測定纖維化的預後的方法，所述方法包括a)測定取自患者的生物樣本中的HF-相關多肽的水平；及b)將(a)的所述水平與所述HF-相關多肽的對照水平進行比較以確定所述纖維化的陽性診斷或陰性診斷。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述纖維化是肝纖維化。
16.如權利要求14所述的方法，其中，所述多肽選自14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素、甲清蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b結合蛋白 β鏈、完整/裂解的補體C3dg、皮質類固醇結合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至？!1 5. 49處的β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、血液結合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸 α-2-糖蛋白、脂轉移抑制劑蛋白、視黃醇結合蛋白4、血清對氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。
17.如權利要求14所述的方法，其中，所述纖維化以HF-相關多肽的差異調控為特徵。
18.—種檢測與疾病相關的生物標記或多肽的方法，所述方法包括a)從患有所述疾病的患者中分離生物樣本，b)從未患有所述疾病的患者中分離生物樣本，c)用窄範圍2D-PAGE分析來自a)和b)的樣本，及d)比較所述窄範圍2D-PAGE的結果以確定在患有和未患有所述疾病的患者之間差異表達的生物標記或多肽。
19.如權利要求18所述的方法，其中，窄pH範圍選自pH3至pH 5. 6、pH3至pH 6、pH 3. 9 至 pH 5. UpH 4. 7 至 pH 5. 9、pH 5 至 pH 8、pH 5. 3 至 pH 6. 5、ρΗ5· 5 至 pH 6. 7、pH 6 至 pH IUpH 6. 2 至 pH 7. 5、ρΗ 6. 3 至 pH 8. 3、ρΗ 7 至 pH 10,pH 7 至 pH IUpH 3. 5 至 pH 4· 5、pH 3 至 ρΗ 7 禾口 ρΗ 6 至 ρΗ 9。
全文摘要
本發明提出一組新型的用於診斷肝纖維化和肝硬化的人類血漿蛋白生物標記。目前沒有可靠的評估肝纖維化的無創方式。基於2D-PAGE的蛋白組學研究用於鑑別潛在的纖維化生物標記。分析了來自患有C肝病毒(HCV)感染誘發的肝硬化的患者的血漿。鑑別了與肝瘢痕化相關且與病毒感染潛在相關的數種蛋白。這些蛋白包括14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯素、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b-結合蛋白β鏈、完整/裂解的補體C3dg、皮質類固醇結合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至pH 5.49處的β結合珠蛋白、結合珠蛋白相關蛋白、血液結合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂轉移抑制劑蛋白、視黃醇結合蛋白4、血清對氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。這些生物標記可與國際公布WO/2008/031051中的多肽聯合使用。這些新型生物標記的濃度可使用免疫分析來測定，其中，所述濃度將反映纖維化的程度。本發明提出所述新型生物標記中的每一個的纖維化評分分級。所有新型生物標記的分值相加的結果將給出更為可靠的纖維化程度指標，而非檢測單個生物標記。
文檔編號G01N33/576GK102460174SQ201080031411
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月13日 優先權日2009年5月14日
發明者妮科爾·齊茲曼, 貝文·甘加達蘭, 雷蒙德·A·德韋克 申請人:牛津大學之校長及學者