一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法及其專用量子點螢光免疫試劑盒的製作方法

2023-08-11 03:30:51 1

專利名稱：一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法及其專用量子點螢光免疫試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法及其專用量子點螢光免疫 試齊U盒。 目前其中獸藥殘留問題是影響動物性食品安全的最主要因素之一，由於動物樣本 成分複雜，待測物濃度較低，而且大多數取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提 出了更高的要求。量子點(Quantum dot,QD)由於具有獨特的光學和電學性質，使其在螢光 免疫分析中得到越來越多的應用，作為螢光探針，QD的光學特性比在免疫螢光分析法中經 常採用的傳統發色團如羅丹明6G或其它有機染料分子有明顯的優越性QD的激發光譜寬， 且連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，螢光發射波長可通過改變量子點的大小而 加以調節，因而不同大小的半導體量子點能被單一波長的光激發而發出不同顏色的螢光。 量子點可持續發光，其螢光壽命可達染料分子的100倍以上，比常規的酶聯免疫吸附檢測 方法的抗背景幹擾能力強，自動化程度高，提高了分析方法的精密度，在獸醫學、醫學、食品 分析等方面將會有更廣闊的應用前景。慶大黴素(Gentamicin，GEN)是一種氨基糖苷類廣 譜抗生素，可作用於多種革蘭氏陽性和陰性菌，主要用於呼吸道感染以及乳腺感染等獸醫 臨床治療及飼料藥物添加劑。在獸醫臨床上，慶大黴素主要通過注射途徑給藥，但該藥的排 洩較慢，如果使用不當，容易造成在動物性產品中的殘留蓄積。不規範用藥會引起畜產品， 尤其是泌乳動物的乳汁中有藥物殘留，對人類的健康構成潛在危害，造成耳毒性和腎臟毒 性。國內外相繼規定了其在動物性食品中的最高殘留限量，我國農業部規定慶大黴素在牛 奶中的最高殘留限量為200 μ g/L。動物組織中慶大黴素殘留的檢測方法主要採用液相色譜 法、液相色譜_聯質譜法、酶聯免疫法等。本發明的一個目的是提供一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法及其專用量 子點螢光免疫試劑盒。本發明提供的檢測慶大黴素和/或小諾黴素的量子點螢光免疫試劑盒，包括慶大 黴素特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為慶大黴素半抗原與載體蛋白的偶聯 物；其結構式如式I所示
背景技術：

發明內容
所述試劑盒還包括濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩衝液、封閉液和量子點標記抗 抗體；所述試劑盒由慶大黴素特異性抗體、包被原、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復溶 液、包被緩衝液、封閉液和量子點標記抗抗體組成。所述慶大黴素特異性抗體為慶大黴素單克隆抗體或慶大黴素多克隆抗體，所述慶 大黴素單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN 分泌的抗體。所述標準品溶液中標準品的濃度為0 μ g/L、l μ g/L、5 μ g/LUO μ g/L、50 μ g/L或 100 μ g/L，所述標準品為慶大黴素；所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩衝液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的 磷酸鹽緩衝液混合得到的溶液；所述包被緩衝液是pH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩衝液；所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、 PH值為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。所述包被原是按照如下方法製備得到的將每IOOmg慶大黴素半抗原、20mg載體 蛋白和2mL 50mM磷酸緩衝液混勻，得到混合液，記作溶液A ；將150mg乙基二甲氨基碳化二 亞胺(EDC)溶於ImL水中，得到溶液B ；將溶液B逐滴加入溶液A中，25°C攪拌反應2h，將得 到的產物透析，得到所述包被原。所述慶大黴素半抗原的結構式如式II所示 所述慶大黴素半抗原為慶大黴素。所述量子點標記抗抗體為量子點QD650標記羊抗鼠抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清 蛋白。本發明的另一個目的是提供一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法。本發明提供的檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理
向每IOmL牛奶中加入200 μ 1 50% (體積百分含量)的三氯乙酸水溶液，混勻；以 3000g離心5min ；取上清液，用復溶液稀釋5倍後得到樣本溶液；所述復溶液為將所述濃縮 復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液稀釋10倍得到的；2)利用所述的檢測慶大黴素的量子點螢光免疫試劑盒檢測步驟1)中的樣本溶液。由保藏號為CGMCC No. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN分泌的慶大 黴素單克隆抗體也屬於本發明的保護範圍。保藏號為CGMCC No. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN也屬於本發 明的保護範圍。該細胞株已於2010年4月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號為 CGMCC No. 3778。慶大黴素的通用名稱為慶大黴素，化學名稱為9α-氟基-11 β，17α-二羥 基-6 α -甲基-孕烷-1，4-二烯-3，20-酮。本發明的實驗證明，本發明的量子點螢光免疫試劑盒主要採用間接競爭方法定性 或定量檢測慶大黴素的殘留量，該試劑盒的主要內容物採用了方便使用的工作液形式，工 作液保存性及穩定性好；利用本發明試劑盒檢測慶大黴素的殘留量的方法，可用於檢測牛 奶樣品中慶大黴素的殘留量，具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈 敏度高、精確度高等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。因此本發明檢測方法及其 專用試劑盒將在動物源性食品中慶大黴素的殘留檢測中發揮重要作用。


圖1為慶大黴素標準曲線圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中各試劑盒的檢測原理如下當在量子點螢光板微孔上預包被慶大黴素半抗原與載體蛋白的偶聯物時，加入樣 本溶液或標準品溶液後，再加入慶大黴素抗體溶液，樣本中殘留的慶大黴素或慶大黴素標 準品與量子點螢光板上包被的慶大黴素偶聯抗原競爭慶大黴素抗體，加入量子點標記抗抗 體，用螢光酶標儀檢測螢光強度，樣本螢光強度值與樣本中慶大黴素的含量成負相關，與標 準曲線比較即可得出樣本中慶大黴素的殘留量。實施例1、量子點螢光免疫試劑盒的製備及其檢測方法一、量子點螢光免疫試劑盒包括(1)將包被原溶解於包被緩衝液中得到的，其中包被原在包被原溶液中的濃度為 0. 08μ g/mL ；包被原為慶大黴素半抗原與載體蛋白偶聯物的偶聯物。(2)量子點標記羊抗鼠抗抗體工作液用稀釋液稀釋量子點標記的羊抗鼠抗抗體 得到的，稀釋度為1 500;稀釋液為牛血清白蛋白和50mL磷酸鹽緩衝液混合得到；所述磷酸鹽緩衝液的濃
6度為0. 02M, pH值為7.4。羊抗鼠抗抗體購自北京博奧森，產品目錄號為bs_0295G。(3)慶大黴素標準品溶液將標準品溶於稀釋液中得到的，其中標準品在慶大黴 素標準品溶液的濃度分別ο μ g/L，1 μ g/L，5 μ g/L，10 μ g/L，50 μ g/L，100 μ g/L，稀釋液為 pH7. 4、0. 05M的磷酸鹽緩衝液。慶大黴素標準品為慶大黴素，購自中國獸醫藥品監察所，產品目錄號為K0070604。(4)慶大黴素單克隆抗體工作液將單抗溶於稀釋液中得到的，單抗與稀釋液的配比為1 1000;單克隆抗體由保 藏號為CGMCC No. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN產生。稀釋液為25g酪蛋白、0. 03g疊氮化鈉和IOOOmL磷酸鹽緩衝液混合得到。(6)濃縮洗滌液將0. 05g疊氮鈉化鈉與IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽 緩衝液混合得到。(7)濃縮復溶液將0. Ig牛血清白蛋白與IOOmL濃度為0.05mol/L、pH值為7. 4 的磷酸鹽緩衝液混合而成。400mL/瓶，1瓶。(8)包被緩衝液pH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩衝液。(9)封閉液將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH 值為7. 4的磷酸鹽溶液混合而成。二、試劑盒的製備1、量子點螢光板的製備(1)慶大黴素半抗原的合成慶大黴素結構中含有氨基，可以與載體蛋白質直接偶聯，因此不用進行結構改造， 可以直接作為半抗原。所述慶大黴素半抗原的結構式如式II所示 (2)包被原的製備採用碳二亞胺法將慶大黴素半抗原和卵清蛋白偶聯得到包被 原。將IOOmg慶大黴素(GEN)、20mg卵清蛋白OVA和2mL 50mM PBS攪拌混勻得到混合 液，記作溶液A;然後另稱取150mg EDC(乙基二甲氨基碳化二亞胺)溶於ImL水中，得到溶 液B ；將溶液B逐滴加入溶液A中，25°C攪拌反應2h ；將反應液置於0. OlM PBS (pH 7.4)中，4°C攪拌透析72h後，離心取上清液得到包被原。所述包被原為慶大黴素半抗原與載體蛋白 的偶聯物；其結構式如式I所示(3)量子點螢光板的製備用包被緩衝液將步驟(2)得到的包被原(即慶大黴素半抗原和卵清蛋白偶聯物) 稀釋成0. 08 μ g/mL,每孔加入100 μ 1，37°C溫育2h，傾去包被液，用稀釋20倍的洗滌液洗滌 2次，每次30秒，拍幹，然後在每孔中加入150 μ 1封閉液，37°C溫育lh，傾去孔內液體，乾燥 後獲得包被有包被原的量子點螢光板，用鋁膜真空密封保存。2、慶大黴素單克隆抗體的製備(1)免疫原合成將慶大黴素半抗原和牛血清白蛋白通過碳二亞胺法偶聯得到免疫原。具體製備過程如下與包被原的製備方法相同，不同的是將卵清蛋白(OVA)替換 為牛血清白蛋白BSA。(2)動物免疫與細胞融合採用Balb/c小鼠作為免疫動物，以步驟2的(1)獲得的免疫原進行免疫，免疫劑 量為IOOyg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多 點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四 免後腹腔加強免疫一次，3天後取脾細胞。取免疫BALB/c小鼠脾細胞，按5 1比例(數量配比)與SP2/0骨髓瘤細胞融合。 採用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化， 直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，將此細胞株命名為GEN。經篩選得到對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN，該細胞株已於2010年4月12 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽 區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCCNo. 3778。(3)細胞凍存和復甦將上述單克隆雜交瘤細胞株GEN CGMCC No. 3778用凍存液 製成5X IO6個/mL的細胞懸液，分裝於凍存管，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立 即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。(4)單克隆抗體的製備與純化增量培養法將上述培養的雜交瘤細胞置於細胞培養基中，在37°C條件下進行培 養，用下述辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存。所述細胞培養基為向RPMI-1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉得到的細胞 培養基，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20% (體積百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞 培養基中的終濃度為0.2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的PH為7. 4。辛酸-飽和硫酸銨法1) 50 %飽和度鹽析取上述細胞培養液5mL，加等量
0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)混勻，然後逐漸滴加等體積的飽和硫酸銨(pH7. 4)溶液(使硫酸銨溶 液的飽和度達到50% )，邊加邊攪拌，室溫放置30min，3000g離心30min，棄上清液留沉澱。 2)33%飽和度鹽析在步驟1)得到的沉澱中分別加入5mL 0. Olmol/LPBS(1L溶液中含有磷 酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化鉀0. 2g，氯化鈉8. 8g)溶解沉澱，再加飽和 硫酸銨溶液達到33%飽和度，邊加邊攪拌，室溫放置30min，棄上清液留沉澱。重複操作2 次。3)脫鹽取0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫 二鈉2. 86g，氯化鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)溶解步驟2)得到的沉澱，裝於透析袋中，懸於盛有 0. 01mol/L、pH7. 4的PBS (1L溶液中含有磷酸二氫鉀0. 27g，12水合磷酸氫二鈉2. 86g，氯化 鉀0. 2g，氯化鈉8. Sg)的燒杯中脫鹽，放置於4°C，每天換液3-4次，BaCl2檢測直至透 析液中無硫酸根離子為止。4)透析完畢，3000g離心5min，取上清液得到純化的慶大黴素單 克隆抗體，_20°C冰箱保存。3、量子點與羊抗鼠抗體的製備表面氨基(-NH2)修飾的水溶性量子點QD650購自北京中科物源，產品目錄號為 W-4007-650 ；羊抗鼠抗體購自北京博奧森，產品目錄號為bs-0259G ；(1)活化量子點表面氨基(-NH2)修飾的水溶性QD6502mL經20 μ 1偶聯劑 SMCC (琥珀醯亞胺4- [N-甲基馬來酸]-1-羧環己烷)活化，形成活性表面，得到活化的量子 點。凝膠柱去除過量的SMCC。(2)還原羊抗鼠抗體羊抗鼠抗體2mL中加入還原劑DTT 25 μ 1 (dithiothreitol， 二硫蘇糖醇)，斷開二硫鍵形成的巰基。凝膠柱去除DTT。(3)將活化的量子點和還原的羊抗鼠抗體混合，37°C反應1小時，10 μ 1 beta-巰 基乙醇終止反應，形成量子點標記的羊抗鼠抗體。三、用步驟一所述試劑盒檢測樣品中殘留的慶大黴素的方法方法如下1、樣品前處理樣品為牛奶樣本。向IOmL牛奶中加入200 μ 1 50% (體積百分含量)的三氯乙酸水溶液，混勻；以 3000g離心5min ；取200 μ 1上清液，用復溶液稀釋5倍後得到樣本溶液，進行試驗分析；所 述復溶液為將所述濃縮復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液稀釋10倍得到 的。2、檢測向步驟一獲得包被有包被原(慶大黴素半抗原與卵清蛋白偶聯物)的量子點螢光 板微孔中加入慶大黴素標準品溶液或樣本溶液50 μ 1，再加入慶大黴素單克隆抗體工作液 50 μ 1，用蓋板膜封板，37°C恆溫箱中反應30min ；倒出孔中液體，每孔加入250 μ 1洗滌液， 30秒後倒出孔中液體，如此重複操作共洗板5次，用吸水紙拍幹；每孔加入量子點標記的羊 抗鼠抗抗體工作液100mL，37°C恆溫箱中反應30min，倒出孔中液體，重複洗滌步驟；用螢光 酶標儀，測定每孔螢光強度值。3、結果分析用所獲得的每個濃度的標準品溶液的螢光強度平均值(B)除以第一個標準溶液(0標準)的螢光強度值(BO)再乘以100%，即百分螢光值。計算公式為百分螢光值(%) = (B/BO) X 100%以慶大黴素標準品溶液的濃度(μ g/L)的半對數值為X軸，百分螢光值為Y軸，繪 制標準曲線圖(圖1)。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分螢光值，相對應每一個樣品的濃 度則可從標準曲線上讀出樣本中慶大黴素的殘留量。本發明中檢測結果的分析也可以採用 回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體， 此法更便於大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需1. 5小時可以完成。按照上述方法獲得三批試劑盒(01批、02批、03批)。實施例2、試劑盒靈敏度、準確度和保存期試驗一、試劑盒靈敏度實驗對零標準溶液(即稀釋液為pH7. 4、0. 05M的磷酸鹽緩衝液)進行20次檢測，測定 結果的平均值加上3倍標準差作為試劑盒的最低檢測限。表1零標準測定結果統計表μ g/L 由表1可知，試劑盒的最低檢測限為1. 0 μ g/L。二、標準品精密度試驗從實施例1中所述的三批試劑盒(01批、02批、03批)中每批抽取10個試劑盒，
測定10 μ g/L標準品溶液的發光強度值，計算變異係數。檢測方法與實施例1中實驗三所
述一致。實驗設3次重複，結果如表2所示，表明變異係數範圍在4. 2% 10. 5%之間，符 合精密度小於或等於20%的規定。表2標準可重複性試驗(CV % ) 三、樣本精密度和準確度試驗1、樣品精密度試驗將不含慶大黴素的牛奶按照實施例1的方法進行樣品前處理後，添加慶大黴素標 準品，使其終濃度為20 μ g/L。從實施例1中所述的三批試劑盒(01批、02批、02批)中每批抽取3個試劑盒，進行實驗，每個實驗重複5次，分別計算變異係數，結果如表3所示(表 中的數值為5次重複的平均值)。結果表明牛奶樣本的變異係數均小於20%，符合了《農業 部文件》農醫發200517號附件2試劑盒備案參考評判標準中第四點精密度和準確度的 精密度標準。表3牛奶樣本可重複性試驗 2、樣本準確度試驗將不含慶大黴素的牛奶按照實施例1中所述的樣品前處理方法進行處理，然後向 牛奶中加入慶大黴素標準品溶液，使其終濃度分別為50 μ g/L和100 μ g/L ；然後用實施例 1中所述的試劑盒檢測牛奶中慶大黴素，每個濃度做4個平行，分別計算準確度(即添加回 收率)(準確度=實測值/添加值)。結果如表4所示，表明各樣本以50 μ g/L和200 μ g/L 慶大黴素添加回收率均在76. 4% -95. 2%之間。表4試劑盒的準確度 四、交叉反應率試驗選擇與慶大黴素有類似結構和類似功能的8種藥物測定交叉反應率。通過各種藥 物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應率。交叉反應越小，那麼此試劑盒對慶大黴素的檢測特異性就越好。交叉反應率(％)=(抑制50%慶大黴素標準品的濃度/抑制50%的慶大黴素類 似物濃度)X100%表5試劑盒的特異性實驗結果表明，本發明所研製的試劑盒對慶大黴素和小諾黴素的特異性好。五、試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2_8°C，保存6個月後，測定試劑盒的50%抑制濃度、慶大黴素 實際添加測定，結果表明試劑盒的50%抑制濃度均在正常範圍之內。考慮在運輸和使用過 程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37°C保存的條件下放置6天，進行加速老化實 驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放 入-20°C冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑 盒可以在2-8°C至少可以保存6個月以上。
藥物
絲呈座空(%)
慶大黴素 小諾黴素 西索米星 新黴素 卡那黴素 新黴胺 鏈黴素 安普黴素 大觀黴素
100 130 3.2 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 <0.權利要求
一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的量子點螢光免疫試劑盒，包括慶大黴素特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為慶大黴素半抗原與載體蛋白的偶聯物；其結構式如式I所示(式I)。FSA00000215761000011.tif
2.根據權利要求1所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括濃 縮洗滌液、濃縮復溶液、包被緩衝液、封閉液和量子點標記抗抗體；所述試劑盒由慶大黴素特異性抗體、包被原、標準品溶液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、包 被緩衝液、封閉液和量子點標記抗抗體組成。
3.根據權利要求1或2所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於所述慶大黴素特 異性抗體為慶大黴素單克隆抗體或慶大黴素多克隆抗體，所述慶大黴素單克隆抗體是由保 藏號為CGMCC No. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN分泌的抗體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於所述標準品溶液中標準品的濃度為O μ g/L、1 μ g/L、5 μ g/L、10 μ g/L、50 μ g/L或 100 μ g/L，所述標準品為慶大黴素；所述濃縮洗滌液是將0. 05g疊氮化鈉和IOOmL濃度為0. 02M、pH為7. 4的磷酸鹽緩衝 液混合得到溶液；所述濃縮復溶液是將0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 05mol/L、pH為7. 4的磷酸 鹽緩衝液混合得到的溶液；所述包被緩衝液是PH值為9. 6的濃度為0. 03mol/L的碳酸鹽緩衝液；所述封閉液是將0. Olg疊氮化鈉、IOg牛血清白蛋白和IOOmL濃度為0. 03mol/L、pH值 為7. 4磷酸鹽溶液混合得到的溶液。
5.根據權利要求1-4中任一所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於所述包被原是按照如下方法製備得到的將每IOOmg慶大黴素半抗原、20mg載體蛋白 和2mL 50mM磷酸緩衝液混勻，得到混合液，記作溶液A ；將150mg乙基二甲氨基碳化二亞胺 溶於ImL水中，得到溶液B ；將溶液B逐滴加入溶液A中，25°C攪拌反應2h，將得到的產物透 析，得到所述包被原；所述慶大黴素半抗原的結構式如式II所示
6.根據權利要求1-5中任一所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於 所述慶大黴素半抗原為慶大黴素。
7.根據權利要求1-6中任一所述的量子點螢光免疫試劑盒，其特徵在於 所述量子點標記抗抗體為量子點QD650標記羊抗鼠抗抗體；所述載體蛋白為鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白，優選為卵清蛋白。
8.—種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法，包括以下步驟1)樣品前處理向每IOmL牛奶中加入200 μ 1 50% (體積百分含量)的三氯乙酸水溶液，混勻；以 3000g離心5min ；取上清液，用復溶液稀釋5倍後得到樣本溶液；所述復溶液為將所述濃縮 復溶液用0. 05mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩衝液稀釋10倍得到的；2)利用權利要求1-7中任一所述的檢測慶大黴素的量子點螢光免疫試劑盒檢測步驟 1)中的樣本溶液。
9.由保藏號為CGMCCNo. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN分泌的慶大黴 素單克隆抗體。
10.保藏號為CGMCCNo. 3778的對慶大黴素的單克隆雜交瘤細胞株GEN。
全文摘要
本發明公開了一種檢測慶大黴素和/或小諾黴素的方法及其專用量子點螢光免疫試劑盒。本發明提供的檢測慶大黴素的量子點螢光免疫試劑盒，包括慶大黴素特異性抗體、包被原和標準品溶液；所述包被原為慶大黴素半抗原與載體蛋白的偶聯物。本發明的實驗證明，本發明的試劑盒具有樣品前處理過程簡單、操作簡便、費用低廉、特異性高、靈敏度高、精確度高等特點，能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。
文檔編號G01N33/577GK101907623SQ20101024404
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者史為民, 吳聰明, 張素霞, 曹興元, 湯樹生, 沈建忠, 王戰輝, 程林麗 申請人:中國農業大學