一種控制玉米株高的分子標記及應用的製作方法
2023-05-14 08:17:11 1
一種控制玉米株高的分子標記及應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於植物基因工程【技術領域】，與分子標記製備和應用領域相關。本發明的分子標記來源於ZmGA3ox21基因片段，位於玉米第3染色體，控制玉米株高性狀。分離克隆ZmGA3ox2基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其cDNA序列如SEQ?ID?NO：2所示。獲得一個作為玉米株高的分子標記，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：6-9所示。利用圖位克隆的策略證實該基因的自然變異可以影響玉米株高的數量變異，其自然變異可以引起玉米節間細胞長度的變化，表達量的變化及體內活性GA含量的變化。該基因的自然變異不影響產量及花期相關性狀。對矮稈突變體d1-6016的遺傳分析證實該基因的大片段缺失可以導致玉米植株矮化。
【專利說明】—種控制玉米株高的分子標記及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程【技術領域】。具體涉及一種分子標記的製備及應用，本發明的分子標記來源於QTUPH3.1基因片段，其位於玉米第3染色體上，控制玉米株高性狀。本發明公開了 QTLqPH3.1基因的分離克隆及作為控制玉米株高的分子標記，本發明還涉及該分子標記的開發及應用。
【背景技術】
[0002]玉米是重要的糧食、飼料、工業原料和生物質能作物。生物學產量和籽粒產量都是玉米遺傳育種的目標性狀。株高與玉米籽粒產量和生物學產量密切相關，是一個重要的產量相關性狀。因此，株高是玉米遺傳和育種發明中重要的目標性狀，對株高基因的鑑定與克隆具有重要的指導意義。
[0003]矮杆基因的應用在水稻和小麥中掀起了第一次綠色革命。當前，利用矮杆突變體已經克隆出大量的株高基因，這些基因大都涉及到赤黴素(GA)的生物合成及信號傳導，著名的水稻和小麥的綠色革命基因就屬於此類(Monna et al., 2002;Peng etal., 1999; Sasaki et al., 2002; Spielmeyer et al.，2002)，表明內源激素 GA 的含量與植物株高緊密相關，精確調控活 性GA的生物合成與降解對莖杆的正常延伸非常重要。因此，通過對內源生物活性GA水平的遺傳操縱從而產生矮杆植株是一個可行的策略。植物內源活性GA的量是由活性GA的合成速率與其轉化為非活性GA的速率兩方面共同決定的。在整個GA生物合成途徑中，GA2氧化酶(GA 2-oxidase, GA2ox)負責將活性GA分解代謝為非活性GA。因此，通過抑制生物活性GA的合成或促進其分解代謝都可以用來減少內源GA的含量。基於這兩條減少內源GA含量的途徑，不同的發明小組提出了很多想法，並在水稻中做了一些嘗試，其中利用GA生物合成基因0sGA3ox2(D18)的啟動子來驅動GA2ox基因的異位表達，從而達到減少植株體內活性GA水平的方法，在水稻中取得了很好的突破(Sakamotoet al.，2003)，說明利用生物技術的手段也可以創造出矮杆品種。在玉米中，大量的玉米矮杆突變體也已經被鑑定(Sheridan，1988)，但是這些突變體往往伴隨著植株的嚴重矮化，對產量和其他農藝性狀也有很大的影響，不適合在實際育種中應用。因此，鑑定和克隆表現為數量變異的株高基因非常有必要。
[0004]鑑於此，本發明利用圖位克隆的策略，克隆了一個位於玉米第3染色體的株高QTLqPH3.1，並最終鑑定到了一個住噶基因ZmGA3oX2。基於連鎖分析、關聯分析和突變體分析三種途徑，均檢測到ZmGA3oX2對株高有顯著效應。另外，來自於表達、細胞學及生理學等分析也從邏輯上支持候選基因的正確性。
【發明內容】
[0005]本發明是利用圖位克隆策略分離位於玉米第3染色體的株高性狀的QTL qPH3.1，並對最終的候選基因進行功能驗證，將獲得的該基因命名為QTL qPH3.1 (在下面的描述中以QTL qPH3.1代替QTL qPH3.1基因，二者的含義相同)，以該基因的片段作為控制玉米株高的分子標記及應用。
[0006]本發明利用玉米第3染色體ND1-ND75區段近等基因系(NIL)綜3 (國家農作物種質中心)和SL15(或稱HB522，國家農作物種質中心)雜交構建的分離群體，對qPH3.1進行精細定位。在2007年， 申請人:構建了一個含有161個單株的NIL-F2群體，利用該群體 申請人:對株高及產量相關性狀包括百粒重、行粒數、穗行數、穗粗、穗長進行QTL鑑定。結果表明，在ND1-ND75區段確實存在一個株高QTL，可以解釋32.3%的表型變異。而未檢測到任何產量相關性狀的QTL，說明qPH3.1僅影響株高，而不影響產量相關性狀。 申請人:在2008年和2009年構建了 2個更大的NIL-F2分離群體，分別含有617和2153個單株，對qPH3.1進行精細定位。在2008年分離群體中， 申請人:評估了 qPH3.1對產量相關性狀及兩個花期性狀(抽雄期和吐絲期)的影響。結果表明:qPH3.1對產量及花期性狀均無影響。利用8個含有不同重組的目標區段的跨疊系(sub-NILMf qPH3.1定位至ND87—ND88區間，兩個標記間距離為12.6kb，在該12.6kb的區間內僅存在一個開放閱讀框(0RF)， 申請人:將其作為候選基因。使用快速擴增cDNA末端(RACE)技術獲得了該基因的1892bp全長cDNA，同時PCR擴增該基因的完整的編碼區DNA片段及其啟動子。序列分析顯示，該基因包含3個外顯子，2個內含子，cDNA序列含有I個1149bp的0RF，其編碼382個胺基酸，5'-非編碼區(5' -UTR)和3'-非編碼區(3' -UTR)的長度分別為238bp和505bp。因該基因與水稻的0sGA3ox2表現出80%的胺基酸一致性， 申請人:將其命名為ZmGA3ox2。 申請人:分析了玉米矮杆突變體dwarf-1 (dl)的其中一個等位突變體dl-6016 (美國玉米種質中心,Stock center USA)發現其ZmGA3oX2基因存在2304bp的片段缺失，包括734bp的起始密碼子上遊序列和1570bp的編碼區。 申請人:同時構建了 dl-6016的分離群體，ZmGA3ox2基因內的標記ND88和表型表現出完美的共分離。dl-6016中ZmGA3ox2基因的大片段缺失及ND88與表型的共分離表明ZmGA3ox2就是負責dl的基因，ZmGA3oX2具有控制玉米株高的功能。細胞學觀察發現SL15的節間細胞顯著長於綜3(p〈0.01)，表明SL15相對於綜3節間的延長是由於細胞長度的縱向增加，而非細胞數目的增加。生物信息學及表達分析表明ZmGA3ox2是玉米營養器官中唯一起作用的GA3氧化酶,在莖杆延伸中起著決定性作用。 申請人:利用quantitative RT-PCR分析了 ZmGA3oX2在4個不同時期的綜3和SL15的莖尖組織中的表達，結果表明在莖尖中，ZmGA3ox2在SL15中的表達水平顯著高於綜3，意味著SL15相對於綜3將擁有更多的活性GA，進而導致SL15的株高高於綜3。外源赤黴素(GA)噴施處理可以消除綜3和SL15的株高差異。候選基因關聯分析表明ZmGA3oX2啟動子區的自然變異影響玉米植株高度。
[0007]本發明的優點在於:
[0008](I)本發明在玉米中克隆並證實了一個控制株高的QTL，再一次證實了株高與GA生物合成的關係。
[0009](2)本發明為玉米株高的遺傳改良提供了新的基因和可供用於分子標記輔助選擇改良玉米株高的分子標記。該基因可以改變株高大約20cm，而不影響產量及其相關性狀。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]序列表SEQID NO:1是本發明克隆的與玉米株高基因ZmGA3ox2的核苷酸序列。
[0011]序列表SEQID NO:2是本發明克隆的與玉米株高基因ZmGA3ox2的全長cDNA。
[0012]序列表SEQID NO:3是本發明克隆的與玉米株高基因ZmGA3ox2編碼的胺基酸序列。
[0013]序列表SEQ ID NO:4是本發明克隆的矮杆突變體dl-6016中的ZmGA3ox2的核苷酸序列。
[0014]序列表SEQ ID NO:5是本發明用於候選基因關聯分析所測序列。
[0015]序列表SEQ ID NO:6_9是本發明開發的分子標記ND78和ND88的引物序列。
[0016]圖1:是綜3和SL15(HB522)的株高、節間長度比較。注:(a)和(b):成熟期的綜3和SL15的株高。白色箭頭標註玉米的節(比例尺:50cm)。(c):綜3和SL15的雄穗和各節間長度的比較。*和***分別代表0.05和0.001的顯著水平。誤差線代表SD，nS3=48，nSU5=63。t-test檢驗差異的顯者性。糖上節間用1、2、3、4、5、6標註，糖下節間用-1、-2、-3、-4、-5、-6和-7標註，雄穗用T標註。
[0017]圖2:是qPH3.1的圖位克隆。注:(a)基於2008年所構建的分離群體定位的qPH3.1位置。(b)SL15(HB522)、綜3及8個跨疊系的基因型和表型。#670，#348和#427是由2008年分離群體中的交換單 株發展而來，其餘5個跨疊系來自於2009年分離群體。表型數據代表均值土標準差。n，每個跨疊系評估表型的單株數目。**，表示跨疊系的均值與綜3的均值在0.01水平顯著。NS，在0.01水平不顯著。
[0018]圖3:是ZmGA3ox2的基因結構及綜3與SL15 (HB522)間的多態性。注:灰盒和白盒分別代表外顯子和UTR區域。垂直線代表SNP，其中3個SNP位於啟動子區(位於-999bp, -885bp, _626bp 處)，I 個位於 5' UTR 區(_7bp 處)，I 個位於第一外顯子(181bp處)。三角形代表插入缺失(InDel)，上三角形表示綜3相對於SL15的缺失，下三角形表示SL15相對於綜3的缺失。數字表示缺失鹼基的數目。
[0019]圖4:是 dl-6016 等位基因的突變。注:(a) +/dl-6016 和 dl-6016/dl_6016 分別表示雜合和純合突變體。(b)利用引物4046F和7762R擴增B73和dl-6016純合子中的ZmGA3ox2。(c) ZmGA3ox2的基因結構，灰盒和白盒分別表示外顯子和UTR區域，dl-6016等位基因缺失的區域用虛線表示。箭頭標明引物4046F和7762R的位置。三角形標註ND88的位置。(d) ND88和表型共分離。
[0020]圖5:是ZmGA3ox2在不同的器官和組織中的表達。注:RNA自以下組織提取:冠根(CR)，胚根(PR)，再生根(SR)，側根(LR)，中胚軸(CM)，幼苗地上部分(SH)，莖(ST)，未成熟葉片(IL)，幼雌穗(IE)，幼雄穗(IT)，純合dl-6016突變體的幼雄穗(IT-dl)。
[0021]圖6:是綜3和SL15 (HB522)四個不同時期的ZmGA3ox2的表達分析。注:拔節後對綜3和SL15 (HB522)的莖尖部位進行取材，共4個時期，每個時期間隔7天。Actin(NM_001155179作為內參)。每個時期的綜3的表達量作為1，每個樣品3次生物學重複，數據代表均值土標準差。t-test用來計算P值。
[0022]圖7:是成熟期玉米節間的徒手縱切片。綜3與SL15(HB522)節間細胞長度比較，誤差線代表標準差(n>600)。t-test用來比較細胞長度差異的顯著性。
[0023]圖8:外源GA3處理對綜3和SL15(HB522)株高的效應。注:所有植株種植於溫室，從萌芽後第2周開始測量株高。每組測量13至17株。各個時間點的綜3(_)與SL15(_)比較，綜3(+)與SL15(+)比較，誤差線不重疊的表明在P〈0.01水平，均值顯著差異。綜3(_)，SL15 (_)，綜3 (+)，SL15 (+)分別代表對照綜3，對照SL15，處理的綜3和處理的SL15。【具體實施方式】
[0024]以下實施實例進一步定義本發明，並描述了 qPH3.1的定位、克隆、功能驗證及分子標記開發的方法。根據以下的描述和實例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出適當的完善和修改，以使其適用各種用途和條件。
[0025]實施例1:qPH3.I的精細定位
[0026](I) SL15 (HB522)的遺傳構成及其與綜3的表型差異
[0027]SL15 (HB522，來自國家農作物種質中心)和綜3 (來自國家農作物種質中心)是本試驗用於QTL定位群體製備的親本材料。SL15是一個染色體片段代換系，其主要遺傳背景來自於綜3，而在第3染色體的umc2369標記附近的染色體區段與綜3存在差異，其導入片段來源於HB522 (國家農作物種質保存中心種質庫)。 申請人:使用了均勻分布於全基因組的245個SSR標記，對SL15和綜3間的遺傳差異進行評價。結果表明，SL15中導入片段的兩側可初步界定於bnlgl647-bnlgl447之間。為更準確界定導入片段的兩端位置，基於B73參考基因組bnlgl647-bnlgl447區段兩側序列， 申請人:新開發了 2個SSR標記NDl (位於bnlgl647上遊)和ND75 (位於bnlgl447下遊)，並最終作為導入片段的界限。本發明所開發的標記見表I。以上幾個標記在染色體上的順序為NDl-bnlgl647-umc2369-bnlgl447-ND75，ND1與ND75所界定的導入片段的物理距離為2.6Mb。該導入片段跨越玉米第3染色體的3.02birT3.03bin。另外，全基因組SSR掃描發現，僅在第3染色體上3.06bin存在一個與綜3具有差異的分子標記dupssr23，說明在SL15中dupssr23附近的染色體片段來自於供體親本，與綜3具有等位差異。SSR分析表明，SL15與綜3基因組的相似性為97.96%，兩個自交系間的遺傳差異很小，僅為2.04%。SL15和綜3就是本發明用於qPH3.1定位的親本材料。`
[0028]比較SL15與綜3的株高、節間數目和節間長度， 申請人:發現SL15的株高為203.9± 10.8cm，顯著高於綜3的株高179.7±10.5cm (見圖la，圖lb);SL15與綜3間的節間數目相同，均為穗上6個節間，穗下7個節間，表明兩個材料間株高的差異是由於節間長度的差異所引起的，而不是節間數目的變化。為了展示節間長度的差異， 申請人:定義穗下的節間為-1到-7，穗上的節間為I到6，雄穗為T (圖la)。比較綜3與SL15間相對應的節間長度和雄穗長度，結果表明SL15的所有節間都顯著長於綜3相對應的節間，但二者間雄穗的長度無顯著差異(圖lc)。
[0029]表I本發明開發的用於qPH3.1精細定位的SSR和InDel標記
[0030]
【權利要求】
1.一種分離克隆的ZmGA3OX2基因在控制玉米株高中的應用，其特徵在於，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.如權利要求1所述基因的應用，其特徵在於作為玉米株高的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6_9所示`。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451200SQ201210171780
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優先權日:2012年5月29日
【發明者】張祖新, 騰峰, 翟立紅, 鄭用璉 申請人:華中農業大學