Cpt基因晶片及其檢測方法和應用的製作方法

2023-05-14 08:26:36

專利名稱：Cpt基因晶片及其檢測方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因晶片，尤其涉及一種基於ZipCode序列的CPT基因晶片;此外， 本發明還涉及該基因晶片的檢測方法與應用。
技術背景基因晶片是人類基因組計劃帶來的最具應用價值的科研成果，它融合了生命科 學、化學、微電子技術、計算機科學、統計學和生命信息學等多種學科的最新技術。 隨著微加工技術的發展，高密度寡核苷酸晶片最高密度可達上百萬個探針，因此基因 晶片通量水平並不受晶片技術本身制約，而是受樣本的處理和基因晶片設計方法的限 制。高通量單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)晶片在臨床 診斷中的應用，仍有賴於DNA處理、晶片設計等方面的發展。直接用基因組DNA進行SNP分型顯然可以避開DNA擴增這一問題，並能同時對幾 百萬的SNPs進行分型。低等生物的基因組複雜性較低，已成功地利用晶片直接對基 因組DNA進行了多態分析，這些生物包括酵母(基因組DNA約為12Mb)和擬南芥(基因 組DNA約為120Mb)。然而，人類基因組DNA雖已成功地應用於cDNA、 BAC和寡核苷酸 晶片比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)晶片(Ishkanian AS， Malloff CA， Watson SK， et al. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nat Genet. 2004; 36: 299-303),但由 於人類基因組DNA的高度複雜性，直接進行SNP分析的難度顯然要高於低等生物，從 約30億鹼基對序列中鑑別一個SNP仍是一項艱巨的挑戰工作。通過近幾年的研究， 已有幾種技術可以對人類基因組DNA進行SNP分型，包括膠體金檢測技術、侵入切割 (invasive cleavage)、侵入切割結合滾環擴增(rolling circle amplification) 和等位基因特異性引物延伸法(allele-specific primer extension)結合信號級聯 放大等技術，但這些技術普遍存在DNA用量大、信噪比低、操作複雜或低多重水平等 缺點，它們在疾病基因組學和藥物基因組學等領域和臨床診斷方面的應用，尚有待於 進一步的發展和完善。另一方面，人類基因組約有2-2.5萬個基因，涵蓋這些人類基 因組所有的基因和表達序列標籤對於目前的表達譜晶片技術雖然簡單，但卻往往無法檢測出表達水平低下的基因，即使應用RNA線性擴增技術也無法解決。提高探針長度 可在一定程度上提高檢出率，然而探針長度增加的同時，探針局部序列的特異性也大 為降低，從而造成假陽性率大為增高。鑑於核酸擴增技術不足以解決基因表達譜和SNP晶片存在的問題，如何放大螢光信號將是提高晶片檢測能力的關鍵所在。級聯放大由 於放大倍數有限，顯然不如侵入切割，這也反應在基於這兩種技術的基因組DNA直接 進行SNP分型所用的DNA量(GundersonKL， Steemers FJ, Lee G, et al. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat Genet. 2005; 37: 549-54)。侵入切割對靶DNA序列的檢測是通過螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)來實現。它高效的信號放大作用使得基因組DNA 不經擴增可直接進行SNP分型，但最大的缺陷是信噪比低下，並且探針設計較為複雜， 其在SNP晶片中的最終應用尚有待於進一步發展和完善。循環探針技術(cycling probe technology, CPT)是另一種對靶DNA信號進行放大 的技術(DuckP, Alvarado-Urbina G, BurdickB， et al. Probe amplifier system based on chimeric cycling oligonucleotides. Biotechniques. 1990; 9: 142-8)。 CPT探 針為一含DNA-RNA-DNA的嵌合體，長約25-30個鹼基，內含4-6個連續的嘌呤核苷酸。其 原理是在等溫反應中，探針與單鏈靶DNA序列雜交後，在核糖核酸酶H (RNase H)的作 用下，DNA-RNA-DNA探針中的RNA部分被特異性切割。RNase H是一種核糖核酸內切酶， 它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的 RNA鏈，該酶不能消化單鏈RNA、單鏈或雙鏈DNA。由於酶切後的探針片段的退火溫度遠 低於反應溫度，切割後的CPT探針的兩端DNA部分也隨之從靶DNA序列上脫落下來，使得 靶DNA序列又可以與完整的探針結合，從而提高了耙DNA序列的使用率。因此，每條耙DNA 序列能與許多條完整探針雜交結合，從而產生很多切割的探針片段，其量隨著時間而堆 積，呈線性擴增。通過結合凝膠電泳或免疫學檢測分析，CPT已被成功地應用於細菌及 耐藥檢測。由於CPT具有線性擴增的特性，在探針的兩端DNA序列分別標記上螢光基團和 淬滅基團，就可對螢光信號進行放大，達到實時定量檢測的目的。並且RNase H對 DNA-RNA-DNA探針的切割存在著序列依賴性，只有RNA部分與耙DNA序列完全匹配的探針 才能被切割，因此CPT也可用於SNP檢測。與侵入切割一樣，CPT最大的特點就是不需要這種鏈式的擴增反應，它們是對DNA 或者RNA的信號進行擴增。並且由於不需要鏈式擴增過程，整個反應過程只要控制在探針的退火溫度，不需要像PCR那樣反覆升溫、降溫，因此可以節省很多時伺。並且CPT 與PCR不同，它們不是放大的靶DNA序列被檢測，因此可減少由於PCR自身汙染造成的假陽性。只有當特異的DNA存在時，這種方法才能使信號分析累積，並可用多種儀器檢測。 相比於侵入切割，CPT僅設計一條序列特異性探針或兩條等位基因特異性探針，設計較 為簡單，所能檢測的基因序列更多。另一方面，在侵入切割中，酶切後的探針片段中能 與靶DNA序列互補的序列長度僅比完整的探針少一個鹼基，探針片段和完整的探針與耙 DNA序列的退火與分離的動力學基本一致，兩者與靶DNA序列的結合存在著競爭。而CPT 探針與靶DNA序列結合後，是被RNaseH從中間部分切開，酶切後的探針片段的退火溫度 遠低於反應溫度，脫落的探針片段不太可能再結合到靶DNA序列上，這使得CPT的信號放 大效應遠高於侵入切割。因此，若將CPT應用於基因晶片中，產生的信噪比將明顯優於 侵入切割，能大幅提高低表達基因的檢出率，並降低基因組DNA直接進行SNP分型的難度， 更加適用於高通量、大規模的核酸檢測。當前SNP晶片和表達譜晶片的技術已較為完善，但遠不能滿足生物醫學研究和 臨床檢測診斷所需。在不影響準確率的情況下，如何提高表達水平低下的基因的表達 譜晶片檢出率，如何將基因組DNA以最少的量直接應用於SNP晶片檢測， 一直是當今 基因晶片技術的難點所在。雖然核酸擴增或級聯放大能在一定程度上提高螢光信號， 但這些技術不能根本性解決這些問題，並且操作相對較為複雜。通過改變傳統的每個 靶DM序列只與一條探針雜交的策略，從增加每條靶DM序列所能雜交的探針數目來 提高每條靶DNA序列的使用率，以達到放大螢光信號的目的。其高效的信號放大效應， 不僅使樣本不需任何放大或擴增處理即可用於晶片雜交檢測，而且能使基因組DNA更 易於直接進行晶片檢測，大幅提高表達譜晶片中表達水平低下的基因的檢出率。發明內容本發明要解決的技術問題之一是提供一種CPT基因晶片，該晶片可有效放大檢測 信號，從而顯著提高表達譜晶片中表達水平低下的基因的檢出率。本發明要解決的技術問題之二是提供一種應用上述基因晶片進行檢測的方法。 本發明要解決的技術問題之三是提供上述基因晶片在臨床檢測中的應用。 為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現 在本發明的一個方面，提供了一種CPT基因晶片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定 在固相載體上的Zip探針，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補的ZipCode序列。所述DNA-RNA-DNA探針可在連接有ZipCode序列的一端DNA片段上標記有螢光基 團，並在另一端DNA片段上標記有淬滅基團。所述DNA-RNA-DNA探針可在連接有ZipCode序列的一端DNA片段上不標記螢光或淬 滅基團，在另一端DNA片段上進行標記，該標記包括螢光素標記、生物素標記、放 射性元素標記、電化學發光標記和酶標記。本發明中所述固相基質可選用本領域周知的基質，只要所述基質與所述反應物相 容，不會影響檢測結果就可以。所述DNA-RNA-DNA探針的序列與靶DNA序列互補，優選該探針的RNA序列與靶DNA序 列完全互補，該探針的RNA序列與探針任何序列的連續互補鹼基數不超過3個。所述DNA-RNA-DNA探針的退火溫度為37 75t 。所述DNA-RNA-DNA探針序列可包含1 10個錯配鹼基，較佳地，可包含1 5個 錯配鹼基，更佳地，可包含1 2個錯配鹼基。本發明基因晶片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、 陽性對照探針和固定化對照探針。在本發明的另一方面，提供了一種應用上述基因晶片進行檢測的方法，包括如下 步驟(1) 獲取待測樣品核酸；(2) 將上述的DNA-RNA-DNA探針和待測樣品核酸在含RNase H酶的溶液中進行酶 切，並使其反應足夠時間；(3) 在適於與所述Zip探針進行雜交的條件下，在固定有該Zip探針的晶片上加 入含步驟(2)酶切產物的雜交液，並使其反應足夠時間；(4) 洗滌後檢測雜交反應的結果。本發明中的RNase H酶包括耐高溫和不耐高溫RNase H酶，耐高溫RNase H酶在 變性前後均可加入，而不耐高溫RNase H酶在變性冷卻後加入。所述的雜交溫度為25"C 72'C，所述雜交時間為1分鐘 40小時。可以改變雜交條 件以提高或降低雜交的嚴謹程度、雜交特異性。所述雜交結果在檢測前的洗滌可使用任何適當的洗滌液，該洗滌液可含有0 3% (w/w)的表面活性劑，洗滌可持續適當的時間，如1 30分鐘。可以用室溫的洗滌液進行洗滌，或預熱後洗滌，如42'C。可用不同的洗滌液先後進行洗滌。在本發明的另一方面，還提供了本發明的基因晶片在臨床檢測中的應用。本發明的CPT基因晶片，使基因晶片的檢測能力達到新的高度，不僅大幅提高表 達譜晶片中表達水平低下的基因的檢出率，而且由於本發明CPT探針所含的Zipcode 序列與被檢測物種的基因組DNA不存在同源性，使該基因晶片的非特異性雜交大大減 少，此外，本發明RNaseH酶的酶切反應在液相進行，比原先在固相載體上反應效率更高。


圖1是本發明的晶片雜交與信號放大的原理圖； 圖2是本發明的晶片雜交與信號降低的原理圖；圖3是本發明實施例2的晶片雜交結果圖； 圖4是本發明實施例3的晶片雜交結果圖；圖5是本發明實施例5的晶片雜交結果圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅 用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1 CPT探針和Zip探針設計和晶片製備1. CPT探針設計探針的設計標準如下1)所選擇的基因或SNP位點側翼的序列經Blast,排除 序列特異性差的基因序列或SNPs，以免造成非特異性雜交；2) SNP位點處於RNA序 列中，並位於探針的中間部分；3)探針退火溫度48-6(TC之間，兩端DNA部分的退火 溫度比整條探針至少低15t:，使酶切後的探針片段與靶DNA序列分離；4)探針自身 互補序列不超過3個鹼基對，並且探針之間不得形成二聚體，特別是RNA序列，以免 產生高螢光背景；5)進行SNPBlast，確保探針序列在目的SNP位點外，無其他多態 位點，以免影響雜交效率。2. ZipCode設計ZipCode的設計標準如下1 ) Zipcode序列與被檢測物種的基因組DNA不存在同 源性，特別是目的基因或SNP,因此Zipcode序列能有效減少非特異性雜交；2)探針 長度25個鹼基對；3)退火溫度不低於6(TC: 4)自身互補序列不超過8個鹼基對。3. ZipCode晶片的製備(1) 與ZipCode序列互補的Zip探針溶解ZipCode序列互補的Zip探針合成，先在Zip探針的5'端加上一段連接臂，再 將每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10 mM。將濃度為10 mM的探針與濃度為200 mM 的PBS溶液於384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘， 離心，-2(TC保存，以備點樣使用。(2) 點樣將預先設計併合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、矽片等材 質的固相載體片基上，同時設立陽性和陰性對照。片基採用Cell Associates CSS-100 醛基片基，GeneMachine公司的OrainigridlOO型號的點樣儀，在溼度65—75% (以 FullMoon片基為準)，溫度為25t:的條件下點樣，點樣的格式為1X3，每個矩陣為8 X18，點樣完畢後，放置半小時後，將晶片取出，室溫乾燥保存。實施例2應用具有螢光基團和淬滅基團的CPT探針對基因組DNA進行檢測1.目的基因擴增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 引物1R5， -tgctataagccagctgagagattt-3， (SEQIDN0:2); 弓I物2F5， -3agccaaggctatgacattct-3， (SEQIDN0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3， (SEQIDN0:4)。(2) 探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序 列為RNA序列。rsl3431727-A5' -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3， (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID N0:6);rsl3431727-C5' -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQID N0:7);rsl146808-A5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(Cy3)(TATC)a(ECLIPSE)aattatctg-3，( SEQ ID NO:8); rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(Cy3)(TCTC)a(ECLIPSE)aattatct-3， (SEQ ID NO:9); rsl146808-C5 ， —TGGTGGGGGAGTGGAGGAGGAATAG-ggaaatgt(Gy3)(TGTG)a(EGLIPSE)aattatct—3 ， (SEQ ID NO:10)。用SEQ ID NO:l 4所示序列的引物進行PCR擴增，在60 W反應體系進行，反 應體系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HCl、 50 mM KCl、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上遊和下遊引物的濃度0. 16 MM、基因組DNA 60ng, Taq酶1. 2 U(Takara)。 應用Touch-down PCR反應程序[Don RH, Cox PT， Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS- 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991， 19: 4008]: 94。C變性5 mins; 94。C變性40 s, 64。C退 火lmin，每個循環降低0.5。C， 72。C延伸30 s，共10個循環；然後94"C變性40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30個循環；最後72°C延伸5 mins。2. PCR產物單鏈化處理取上述PCR產物5 W，進行擴增，反應體系含O. 3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、下遊引物的濃度0. 16 MM和Taq 酶0.6U (Takara)。 PCR循環參數94。C變性5 min;然後94。C變性40s， 56。C退火 40 s， 72。C延伸50 s，共35個循環。PCR產物用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No. 28106)純化，操作按照試劑盒說明書。3. 酶切反應將上述的PCR產物95。C變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於 酶切反應。反應體系275 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM MgCl" 10 mM DTT， 0.05% SDS, 15 U RNase H， 200 ng純化PCR產物，1 nM CPT探針。60 'C溫浴15分鐘，隨後加入1 pi的0. 1 M EDTA終止反應。4.雜交和洗漆酶切產物與等量的雜交液混合，用ZipCode晶片進行雜交，55°C 1小時。然後用 含0. 5X SSC和0. 1% SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH20洗滌15秒。 5.檢測雜交結果晶片雜交與信號放大的原理如圖1所示，當RNase H從中間RNA部分切開探針， 標記有淬滅基團的游離端DNA片段和連接有ZipCode序列並標記有螢光基團的DNA片 段分開，當ZipCode序列再與ZipCode晶片上的Zip探針雜交，並通過洗滌去除淬滅 基團後，使晶片的螢光信號放大。洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix 4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的 雜交結果如圖3所示，再用GenePixPro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進 行分析就可以判斷目的序列。實施例3應用僅有螢光基團的CPT探針對基因組DNA進行檢測 1.目的基因擴增(1) 引物序列弓l物1F5， -gtcgcaacctggtgcctataa-3， (SEQ ID N0:1); 弓l物1R5， -tgctataagccagctgag卿ttt-3， (SEQID歐2); 弓i物2F5， -aagccaaggctatgacattct-3，(SEQ ID N0:3); 弓I物2R5， -aattcccggagaacttgtgct-3，(SEQ ID N0:4)。(2) 探針序列CY3是螢光基團，中間括號內大寫鹼基序列為RNA序列。 rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(ATAG)gggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:11); rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(TTGG)ggaattta(Cy3)-3， (SEQID N0:12); rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(TCGG)ggaattta(Cy3)-3, (SEQID N0:13); rsl146808-A5' -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ggaaatgt(TATC)aaattatctg(Cy3)-3' (SEQ ID NO:14);rsl146808-C5， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-ggaaatgt(TCTC)aaattatct(Cy3)-3， (SEQ ID NO:15); rsl146808-C5' -TCGTGCCGGACTCGAGCACCAATAC-ggaaatgt(TGTC)aaattatct(Cy3)-3 ， (SEQ ID NO: 16)。用SEQ ID N0:1 4所示序列的引物進行PCR擴增，在60 W反應體系進行，反 應體系是0.3 mM dNTP、 10 mM Tris-HC1、 50 mM KC1、 2 mM MgCl2、 20% Q solution (Qiagen)、上遊和下遊引物的濃度0. 16幽、基因組DNA 60ng， Taq酶1. 2 U(Takara)。 應用Touch-down PCR反應程序(同實施例2): 94。C變性5 mins; 94t變性40 s， 64 t:退火l min，每個循環降低0.5'C， 72。C延伸30 s，共10個循環；然後94'C變性 40 s， 59。C退火40 s， 72。C延伸30 s，共30個循環；最後72°C延伸5 mins。2.接著依次進行PCR產物單鏈化處理、酶切反應、雜交和洗滌，具體操作步驟 和反應條件同實施例2。 3.檢測雜交結果晶片雜交與信號降低的原理如圖2所示，當RNase H從中間RNA部分切開探針， 標記有螢光基團的游離端DNA片段和連接有ZipCode序列的DNA片段分開，當ZipCode 序列再與ZipCode晶片上的Zip探針雜交，並通過洗滌去除螢光基團後，使晶片的熒 光信號降低。洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的雜交結果如圖4所示，再用GenePixPro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷目的序列。實施例4應用具有螢光基團和淬滅基團的CPT探針對RNA進行檢測 1.總RNA抽提(TRIzol法)(1) 100mg甲狀腺組織可以加入l ml Trizol，用液氮研磨或採用電動勻漿器充分 打碎組織塊。(2) 加入約l/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻l分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。 (3M。C, 12,000 rpm離心15分鐘後小心將上清液轉入新的1. 5 ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。(4) 4°C， 12000 rpm離心10分鐘後，去上清，向沉澱中加入2/5體積的70%乙醇， 4°C， 12000 rpm離心洗滌沉澱15分鐘。(5) 去上清，沉澱室溫晾千後加入適量無RNA酶的水充分溶解沉澱，測定A26。和A28。值c2. cDNA探針的製備(1)從-70冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然後在0.2mlPCR管中配製反應溶液。總RNA隨機引物6聚體(5pg/Vl) 10 mM dNTP mix 無核酸酶的水51 pi 1 nlX pl (補充水至12^1)總體積12 pi(2) 7CTC預變性10 min，立即置於冰上冷卻2 min，隨後在PCR管中配製cDNA第 一鏈合成反應體系5X first-strand buffer 4 jxl0. 1 M DTT 2 piRNA抑制劑 1 pi總體積19 )al42。C保溫2 min後加入l pi Superscript II (200U/ pi) (Invitrogen， USA)。(3) 42。C保溫2小時，70。C變性10 min。 3.酶切反應探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為 RNA序列。rsl3431727-A5， -GATGATCGACGAGACACTCTCGCCA-ggcctt(Cy3)(ATAG)g(ECLIPSE)ggaattta-3' (SEQ ID NO:5);rsl3431727-T5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-ggcctta(Cy3)(TTGG)g(ECLIPSE)gaattta-3， (SEQ ID NO:6);rsl3431727-C5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-ggcctta(Cy3)(TCGG)g(ECLIPSE)gaattta-3' (SEQ ID NO:7)。cDNA於95"變性10分鐘，立即置於冰上，加入RNaseH混勻，用於酶切反應。 反應體系275 mM KCl， 50 mM Tris-HCl (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探針，15 cDNA。 60。C溫浴60分鐘。4.雜交和洗滌酶切產物與等量的雜交液混合，用ZipCode晶片進行雜交，55°C l小時。然後用 含0. 5X SSC和0.1% SDS洗液洗漆5分鐘，最後用ddH20洗滌15秒。洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix 4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的 雜交結果圖，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可以判斷基因表達情況。實施例5應用具有螢光基團和淬滅基團的CPT探針進行DNA直接雜交的檢測 探針序列CY3是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTAAGCACA-cttgtcga(Cy3)(TTCTT)C(ECLIPSE)ttgggat (SEQ ID NO:17);WaZ 5， - CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag (Cy3) (GTAAT)G(ECLIPSE)aaggaa (SEQ ID NO:18);EH10 5' - GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(Cy3) (AAAAA)A(ECLIPSE)cggtgaa (SEQ ID NO:19);EH15， -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(Cy3) (AAAGA)T(ECLIPSE)attcagct (SEQ ID NO:20)。抽提的DNA用DNase I進行片段化，反應體系包括formula see original document page 1337。C溫浴5 min，然後95°C 15 min。片段化產物95。C變性IO分鐘，立即置於冰上，加入RNaseH混勻，用於酶切。 反應體系275幽KC1, 50 mM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C), 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.05% SDS， 20 U RNase H， 1 nM CPT探針。5(TC溫浴120分鐘。然後酶切產物與等 量的雜交液混合，用ZipCode晶片進行雜交，55°C 1小時。然後用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗條5分鐘，最後用ddH20洗滌15秒。洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix 4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到的 雜交結果如圖5所示，再用GenePixPro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進 行分析就可以判斷目的序列。實施例6應用僅有螢光基團的CPT探針進行DNA直接雜交的檢測探針序列CY3.是螢光基團，ECLIPSE是淬滅基團，中間括號內大寫鹼基序列為 RNA序列。Wa2 5， -ACGACTGCGAGGTGCGGTMGCACA-cttgtcga (TTCTT)Cttgggat (Cy3) (SEQ ID NO:21);/WaZ 5， -CGGTCGACGAGCTGCCGCGCAAGAT-gccaagag(GTAAT)Gaaggaa(Cy3) (SEQ ID NO:22);EH10 5， -GCGATCGCCGGGAGATATACCCAAC-ccatctcg(AAAAA)Acggtgaa(Cy3) (SEQ ID NO:23);EH1 5, -GACATTCGCGATCGCCGCCCGCTTT-tcagtaccta(AAAGA)Tattcagct(Cy3) (SEQ ID NO:24)。抽提的DNA用DNase I進行片段化，反應體系包括formula see original document page 1437。C溫浴5 min，然後95°C 15 min。片段化產物95。C變性IO分鐘，立即置於冰上，加入RNase H混勻，用於酶切。 反應體系275 raM KCl， 50 raM Tris-HC1 (pH 8. 3 @ 25°C)， 3 mM Mgcl2， 10mM DTT, 0.05%SDS, 20U RNase H, 1 nM CPT探針。50。C 溫浴120分鐘。然後酶切產物與等量的雜交液混合，用ZipCode晶片進行雜交，55°C 1小時。然後用含0.5X SSC和 0. 1% SDS洗液洗滌5分鐘，最後用ddH20洗滌15秒。洗滌後的晶片，經甩幹後，即可用雷射掃描儀進行掃描(這裡用的是GenePix 4000B共聚焦雷射掃描儀，也可以用其他的雷射掃描儀)。掃描雜交後的晶片得到雜 交結果圖，再用GenePixPro處理圖像得到數據文件，然後對數據文件進行分析就可 以判斷目的序列。序 列 表〈110〉上海生物晶片有限公司〈120> CPT基因晶片及其檢測方法和應用 NP-07-11228〈160〉 24〈170〉 Patentln version 3.3〈210> 1 DNA 人工序列 misc一feature〈223> 引物<400〉 1gtcgcaacct ggtgcctata a 21 〈211〉 〈212> 〈223〉224 腿人工序列misc—feature 引物—〈400> 2tgctataagc cagctgagag attt 24 〈211〉 <213〉〈220〉 <221〉 <223〉321 腿人工序列misc—feature 引物 3aagccaaggc tatgacattc t 21〈210〉 4〈211〉 21 DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc—feature 引物〈400〉 4aattcccgga gaacttgtgc t 21〈210> 5〈211〉 44〈212〉 腿 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (31).. (31)〈220〉〈221> modified—base〈222〉 (36)..(36) 5gatgatcgac g卿cactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44〈210> 6〈211> 44 DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222> (l)..咖〈220>〈221> modified—base<222〉 (32). .(32) <220〉〈221〉 modified—base (37)..(37) 6acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 7 44〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)<220〉<221〉 modified—base〈222〉 (32).. (32) modified—base (37)..(37) 47〈212> DNA 〈213>人工序列〈220>〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25) modified—base〈222> (33). .(33) modified—base〈222〉 (38).. (38)〈400〉 8gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47 9〈211> 46 DNA 〈213>人工序列〈220> misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈220>〈221> modified—base〈222> (33).. (33)〈220〉 modified—base<222〉 (38).. (38) 9gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 10〈211> 46 DNA 〈213>人工序列〈220〉〈221> misc一feature (1)..(25)〈221> modified—base 〈222〉 (33).. (33)〈220〉〈221> modified—base 〈222〉 (38).. (38)〈400> 10tcgtgccgga ctcgagcacc aatacggaaa tgttgtcaaa ttatct 46〈210〉 11〈211> 44 DNA〈213> 人工序列〈220〉〈221> misc一feature〈222> (1)..(25)〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 11gatgatcgac gagacactct cgccaggcct tataggggaa ttta 44<210〉 12 44 DNA 〈213>人工序列〈220〉 misc一feature〈222> (1)..(25)〈220>〈221〉 modified—base〈222〉 (44).. (44)〈400〉 12acgactgcga ggtgcggtaa gcacaggcct tattggggaa ttta 44〈210〉 13〈211> 44〈212〉 DNA〈213> 人工序列 misc一feature〈222> (1)..(25)〈221〉 modified—base〈222〉 (44)..(44)〈400〉 13cggtcgacga gctgccgcgc aagatggcct tatcggggaa ttta 44〈210〉 14 47 〈212〉腿 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉 modified—base〈222> (47).. (47)〈400〉 14gcgatcgccg ggagatatac ccaacggaaa tgttatcaaa ttatctg 47 15〈211〉 46 腿 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉 modified—base〈222> (46).. (46) 15gacattcgcg atcgccgccc gctttggaaa tgttctcaaa ttatct 46〈210〉 16〈211〉 46〈212> 腿 <213〉人工序列〈220〉 misc feature〈222> (1)..(25) 〈220〉 modified—base〈222> (46) . (46) 46〈212〉 腿 〈213〉人工序列〈220> misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉 modified—base〈222〉 (33).. (33)〈220>〈221> modified—base (39).. (39)〈400〉 17acgactgcga ggtgcggtaa gcacacttgt cgattcttct tgggat 46〈210〉 18〈211> 45〈212> 腿〈213〉 人工序列〈220〉〈221〉 misc—feature 〈222〉 (1)..(25)〈221> modified—base <222〉 (33).. (33)<221〉 modified—base〈222〉 (39)..(39)<400〉 18cggtcgacga gctgccgcgc aagatgccaa gaggtaatga aggaa 45 19 46〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220>〈221> misc—feature〈222〉 (1)..(25)〈221〉 modified—base〈222〉 (33).. (33)〈221> modified_base〈222〉 (39).. (39)〈400> 19gcgatcgccg ggagatatac ccaacccatc tcgaaaaaac ggtgaa 46〈210〉 20〈211〉 49 〈212>腿 〈213>人工序列〈221> misc_feature〈222> (1)..(25) modified—base〈222〉 (35).. (35)〈220>〈221> modified—base〈222〉 (41).. (41) 20gacattcgcg atcgccgccc gcttttcagt acctaaaaga tattcagct 49〈210〉 21<211〉 46〈212〉 DNA 人工序列〈220〉 misc—feature〈222〉 (1)..(25) modified—base〈222〉 (46).. (46)〈400〉 21acgactgcga ggtgcggtaa gcacacttgt cgattcttct tgggat 46〈210〉 22〈211〉 45 DNA 〈213〉人工序列〈220〉 (1)..(25) modified—base (45) . (45)〈400> 22cggtcgacga gctgccgcgc a卿tgccaa gaggtaatga aggaa 45 23 46〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 misc一feature〈222〉 (1)..(25)〈220〉〈221> modified—base (46)..(46)〈400> 23gcgatcgccg ggagatatac ccaacccatc tcgaaaeiaac ggtgaa 46〈210> 24<211〉 49 〈212〉腿 人工序列〈220〉 misc—feature〈222> (1)..(25)〈220〉〈221> modified—base〈222> (49).. (49)〈400> 24gacattcgcg atcgccgccc gcttttcagt acctaaaaga tattcagct 49
權利要求
1. 一種CPT基因晶片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定在固相載體上的Zip探針，其特徵在於，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補的ZipCode序列。
2. 如權利要求1所述的CPT基因晶片，其特徵在於，所述DNA-RNA-DNA探針可在連 接有ZipCode序列的一端DNA片段上標記有螢光基團，並在另一端DNA片段上標記有淬 滅基團。
3. 如權利要求1所述的CPT基因晶片，其特徵在於，所述DNA-RNA-DNA探針可在連 接有ZipCode序列的一端DNA片段上不標記螢光或淬滅基團，在另一端DNA片段上進行 標記。
4. 如權利要求3所述的CPT基因晶片，其特徵在於，所述另一端DNA片段上的標記 包括螢光素標記、生物素標記、放射性元素標記、電化學發光標記和酶標記。
5. 如權利要求1所述的CPT基因晶片，其特徵在於，所述DNA-RNA-DNA探針的退火 溫度為37 75t:。
6. —種應用權利要求1所述的CPT基因晶片進行檢測的方法，其特徵在於，包括 如下步驟(1) 獲取待測樣品核酸；(2) 將權利要求1所述的DNA-RNA-DNA探針和待測樣品核酸在含RNase H酶的溶 液中進行酶切，並使其反應足夠時間；(3) 在適於與所述Zip探針進行雜交的條件下，在固定有該Zip探針的晶片上加 入含步驟(2)酶切產物的雜交液，並使其反應足夠時間；(4) 洗滌後檢測雜交反應的結果。
7. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的RNaseH酶包括耐高 溫和不耐高溫RNase H酶。
8. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的步驟(3)中雜交溫度為25'C 72°C，雜交時間為1分鐘 40小時。
9. 權利擎求1所述的CPT基因晶片在臨床檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種CPT基因晶片，包括DNA-RNA-DNA探針和固定在固相載體上的Zip探針，所述DNA-RNA-DNA探針一端的DNA片段末端連接有與Zip探針互補的Zip Code序列。本發明還公開了應用上述基因晶片進行檢測的方法以及該晶片在臨床檢測中的應用。本發明的CPT基因晶片不僅大幅提高低表達基因的檢出率，而且使晶片的非特異性雜交明顯降低。
文檔編號C12Q1/68GK101225434SQ20071003660
公開日2008年7月23日 申請日期2007年1月18日 優先權日2007年1月18日
發明者盛海輝, 肖華勝 申請人:上海生物晶片有限公司