一種使牛trim5α基因沉默的siRNA及其應用的製作方法

2023-05-14 21:52:51 1

一種使牛trim5α基因沉默的siRNA及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了使牛trim5α基因沉默的幹擾方法，siRNA序列，siRNA人慢病毒表達載體，複製缺陷型人慢病毒，人慢病毒感染的MDBK細胞。本發明的RNAi和siRNA慢病毒表達載體有效的幹擾牛trim5α基因的表達，顯著提高人慢病毒載體在牛腎傳代細胞MDBK中的基因表達。本發明為牛病毒病相關基因功能和轉基因牛培育的研究提供新的技術支持。CCTCC No. C20141162014.07.08
【專利說明】-種使牛trims a基因沉默的si RNA及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於細胞生物學領域，具體地說，本發明涉及一種牛trims a下調表達的 SiRNA及其應用。
[0002] 發明背景
[0003] 在RNA幹擾技術出現W前，基因敲除（gene knockout)是主要的反向遺傳學 (reverse genetics)研究手段，但其技術難度高，操作複雜，周期長。由於RNA幹擾可W利 用SiRNA或SiRNA表達載體快速、經濟、簡便的同時又具有高度的序列專一性，可W特異地 使特定基因沉默，獲得功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達，現在已經成 為探索基因功能的重要研究手段。在功能基因組研究中，需要對特定基因功能喪失或減低 突變，W確定其功能，因此RNA幹擾可W作為一種強有力的研究工具，用於功能基因組的研 究。
[0004] 大量研究表明，針對同一祀基因的不同SiRNA序列具有不同的沉默效率，要從具 有不同沉默效率的SiRNA序列中篩選出高效的SiRNA序列，運用RNAi技術更有效地沉默 祀基因，SiRNA序列的設計是關鍵環節。SiRNA序列在祀基因中的位置一般從祀基因起 始密碼子AUG下遊50?100個核巧酸開始搜尋理想的SiRNA序列，越靠近祀基因的3 ' 端，其基因沉默效果可能越好（McManus MT等.RNA，2002,8 (6) :842-850)。W前的研究表 明；不要W 5'非翻譯區巧'UTR)和3'非翻譯區（3' UTR)及起始密碼子附近序列作 為設計SiRNA的模板，該些區域含有調節蛋白結合位點（如翻譯起始複合物），調節蛋白 可與RNA誘導的沉默複合物巧ISC)競爭結合SiRNA序列，降低RNAi效應腳bashir SM 等.2002,26(2) =199-213);也要避開外顯子與外顯子的交界區域和單核巧酸多態性（SNP) 區域。但也有研究發現，在5' UTR中引入一個抑巧順譯的莖-環結構，該樣可W改變mRNA 半衰期（Anthonisen IL 等.RNA，2001，7(7):1024 - 1033)。當 5'UTR 的序列中存在著鹼 基配對時，就可形成發卡式或莖環狀二級結構。該類結構會阻止核糖體小亞基的遷移，對 翻譯起始具有順式阻抑作用。因此運用RNAi技術作用於5' UTR或3' UTR序列，同樣 可引起碑!基因沉默值oench JG 等.Genes Dev, 2003,17 (4) :438-442 ;Eckmann CR 等.Dev Cell, 20023(5) :697-710)，該些發現使SiRNA序列的篩選範圍涉及到了基因全序列的非編 碼區和編碼區。
[0005] 目前常用的H種RNAi的研究策略如下；第一種是直接合成針對祀基因的SiRNA, 通過轉染的方法使之進入細胞內，參與到RNAi途徑，發揮使祀基因沉默的效應。二是構建 ShRNA的質粒表達載體轉染細胞，在細胞內轉錄生成shRNA，利用細胞內的Dicer酶生成相 應的SiRNA,發揮RNAi作用。H是構建ShRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載 體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較 高的特點，解決了用質粒載體轉染效率低的缺陷。利用病毒載體把ShRNA導入細胞，載體中 的U6啟動子確保ShRNA總是表達；該種裝載了 ShRNA載體可被傳遞到子代細胞中去，從而 使基因的沉默可被遺傳。
[0006] 對哺乳動物細胞進行基因轉移是基因功能及基因治療研究中的重要環節。病毒 載體W其高的轉染率等優點已被廣泛應用。重組慢病毒是近年逐步發展起來的新型基 因轉移載體，相比其它常用的病毒載體如逆轉錄病毒、痘病毒等具有較獨特的優點，例如 可有效感染非分裂期細胞、具穩定整合能力、細胞毒性低、免疫反應小等（Joseph A等.J Virol, 2008, 82化）：3078-3089)。慢病毒載體目前已發展至第H代，在系統穩定性和安全 性等方面獲得了很大提高，顯示出巨大的應用潛力（Niemann H，Kues WA. R巧rod Fertil Dev, 2007,19化）：762-770.)。目前慢病毒也被廣泛地應用於表達RNAi的研究中。由於有 些類型細胞用脂質體轉染效果差，轉移到細胞內的SiRNA半衰期短，體外合成SiRNA對基因 表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。採用事先在體外構建能夠 表達SiRNA的載體，然後轉移到細胞內轉錄SiRNA的策略，不但使脂質體有效轉染的細胞種 類增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色於體外合成SiRNA,在長期穩定表達載體的細胞 中，甚至可W發揮長期阻斷基因表達的作用。在所構建的SiRNA表達載體中，是由RNA聚合 酶III啟動子來指導RNA合成的，該是因為RNA聚合酶III有明確的起始和終止序列，而且合成 的RNA不會帶poly A尾。當RNA聚合酶III遇到連續4個或5個T時，它指導的轉錄就會停 止，在轉錄產物3'端形成1 - 4個U。U6和化RNA啟動子是兩種RNA聚合酶III依賴的啟動 子，其特點是啟動子自身元素均位於轉錄區的上遊，適合於表達21ntRNA和SOntRNA莖環結 構（stem loop)。在SiRNA表達載體中，構成SiRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動子分別 轉錄，然後兩條鏈互補結合形成SiRNA ;也可由載體直接表達小發卡狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)，載體包含位於RNA聚合酶III啟動子和4 - 5個T轉錄終止位點之間的莖環結 構序列，轉錄後即可摺疊成具有1 - 4個U的3'突出端的莖環結構，在細胞內進一步加工 成siRNA。慢病毒載體能夠產生表達ShRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、 幹細胞、受精卵W及分化的後代細胞中表達ShRNA,實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中 特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究 基因功能，W及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。
[0007] 牛腎傳代細胞（MDBK)是一種研究病毒感染增殖的常用細胞。MDBK細胞對小鼠 N型逆轉錄病毒和人1型HIV(Human immunodeficiency virus type)病毒的感染率極低， 在感染指數MOI為1的情況下，感染百分率不到1 % (Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)，質粒載體的直接脂質體轉染效率也很低，造成了 MD服 細胞對攜帶外源基因的小鼠N型逆轉錄病毒和人1型HIV病毒重組載體的轉染效率低，外 源基因表達水平低下，使外源基因高水平穩定表達的轉基因MD服細胞有效篩選成為費時 費力的工作。


【發明內容】

[0008] TRIMCTripartite motif)家族蛋白具有3個保守的結構域。該H個結構域從N端 至Ij C端的順序依次是RING結構域（RING domain)、1個或2個B-box結構域、一個捲曲螺旋 結構域（Coiled-coil domain)，此外該家族還具有一個可變的C-末端，因此TRIM家族也 稱為RBCC家族。自從1991年TRIM(RBCC)蛋白家族第一個成員XNF7克隆鑑定後，目前人 類基因組已發現和鑑定近70個TRIM蛋白成員。研究人員在建立能夠被HIV-I感染並產生 致病作用的動物模型時，2004年在非人靈長動物舊世紀猴中首次發現了 trims a (Stremlau M，等.化化re, 2004, 427:848-853.)，在多種靈長類品系中如人、類人猿和新世紀猴中也 發現了 TRIMS基因的存在。在其他哺乳動物品系中如牛和兔亦存在TRIMS基因。TRIMS 基因具有多種可變剪接形式（TRIM5 a，目，Y，5，e等），trims a是各種剪接體中最 長的一個，是其中唯一 C端具有B30. 2 (PRYSPRY)結構域的剪接體，牛trims a的基因位 於15號染色體上，全長2630bp。目前有關trimSa的主要研究有；trimSa基因序列 (Ylinen, L M.等.2006, J. Virol. 80 (15)，7332-7338)、分子進化（Si, Z.等.Proc.化tl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103 (19)，7454-7459)、抗病毒感染作用（Li X 等.Virology, 2007 ; 366(2) : 2:34-244 ;Brass A L 等.Science, 2008, 3,19 (5865) :234-244 ;Diaz-Griffero F 等.J Virol, 2009:83 (20): 10737-10751)。研究表明部分TRIM蛋白具有抗病毒功能，尤其 是對逆轉錄病毒具有限制作用，並且參與了與天然免疫相關一系列生物過程。
[0009] 申請人:發現通過RNA幹擾牛trims a基因表達能夠有效地提高人慢病毒載體在牛 腎傳代細胞中的基因表達。獲得了牛trims a下調表達的SiRNA序列，SiRNA人慢病毒表 達載體，SiRNA複製缺陷型人慢病毒，SiRNA複製缺陷型人慢病毒感染MDBK細胞。
[0010] 本發明提供一種使牛trims a基因沉默的RNA幹擾方法，其幹擾牛trims a基因， 下調牛的trims a表達從而提高外源基因在MDBK細胞中的表達水平。
[0011] 本發明的RNA幹擾方法使用選自牛trims a基因的特異SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5，-AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，，如沈Q ID No. I-No. 4。其中，5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3 ' 幹擾trim5a基因的5'-UTR非編碼區，5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'， 5'-押0：441'〔4161'口'6〔464-3'和5'-46441641'口'6610：4464-3'幹擾付11115〇基因的編碼 區。
[001引 優選地，本發明的RNA幹擾方法使用5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'作為SiRNA序 列。
[0013] 本發明提供一種牛trims a下調表達的SiRNA序列，其能夠下調牛的trims a表 達從而提高外源基因在MDBK細胞中的表達水平。
[0014] 本發明提供一種使牛trims a下調表達的siRNA，所述SiRNA優選選自 牛 trimSa 基因（L0C505265)的特異 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、 5> -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。所述 SiRNA 特別優選選自 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，。
[0015] 本發明還提供所述SiRNA序列用於製備一種trims a基因沉默的哺乳動物細胞的 用途。所述哺乳動物細胞優選為牛細胞。更優選地，所述哺乳動物細胞為MDBK細胞。
[0016] 本發明還提供一種SiRNA病毒表達載體，能夠下調牛的trims a表達從而提高外 源基因在MDBK細胞中的表達水平。
[0017] 所述SiRNA病毒表達載體包含牛trims a下調表達的SiRNA序列，能夠下調牛的 trims a表達從而提高外源基因在MD服細胞中的表達水平。所述SiRNA優選選自牛trims a 基因的特異 SiRNA 序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特別優選選自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0018] 進一步地，本發明上述SiRNA病毒表達載體為慢病毒表達載體pLV-shRNA-puro、 pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。優選為 pLV-shRNA-puro。
[0019] 進一步地，本發明上述SiRNA病毒表達載體為pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a -480、pLV-shRNA-trim5 a -808、pLV-shRNA-trim5 a -1037。優選地 pLV-shRNA-trim5a -337。
[0020] 本發明還提供一種構建上述SiRNA病毒表達載體的方法，包括W下步驟：
[0021] (1)根據牛trims a基因（L0C505265)mRNA全序列篩選RNA幹擾祀點，設計SiRNA 序列和對照隨機序列，
[0022] (2)酶切病毒載體，
[0023] (3)合成接頭引物，退火後連接到病毒載體，
[0024] (4)連接產物轉染大腸桿菌感受態地5 a，培養過夜，
[00巧](5)挑取克隆進行PCR鑑定，獲得測序正確的克隆，大提質粒定量後備用。
[0026] 進一步地，上述方法中SiRNA序列優選選自牛trims a基因（L0C505265) 的特異 SiRNA 序列 5，-CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，、5，-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3，、 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3，。特別優選選自 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>。
[0027] 上述構建方法中，病毒表達載體為慢病毒表達載體，優選為人慢病毒表達載體。優 選為 pLV-shRNA-puro、pLVX-shRNAl、pLVX-shRNA2。特別優選為 pLV-shRNA-puroo
[0028] 本發明還提供上述病毒表達載體在製備trims a基因沉默的哺乳動物細胞中的 用途。所述哺乳動物細胞優選為牛細胞。更優選地，所述哺乳動物細胞為MDBK細胞。
[0029] 本發明還提供一種trims a基因沉默的哺乳動物細胞。
[0030] 優選地，所述trims a基因沉默的細胞是牛細胞，更優選地MD服。
[0031] 進一步地，本發明的trim5a基因沉默的細胞優選是Nl、N2、N3和N14。更優選 為N14,該細胞株命名為牛trimSa基因沉默細胞株BTL2013,已於2014年7月8日保藏 於中國典型培養物保藏中也，地址：中國武漢武漢大學，郵編430072,保藏編號為CCTCC No. C2014116。
[003引更進一步地，本發明的trims a基因沉默的哺乳動物細胞是用 SiRNA幹擾，SiRNA優選自牛trims a基因（L0C505265)的特異SiRNA序列 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5'-CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'、5'-CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'，特別優選地 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'。
[0033] 本發明的trims a基因沉默的哺乳動物細胞是用本發明的SiRNA人慢 病毒載體製備的複製缺陷性慢病毒感染獲得。所述SiRNA人慢病毒表達載體 為 pLV-shRNA-trim5 a-337、pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、 pLV-shRNA trims a -1037。優選地，所述trims a基因沉默的哺乳動物細胞是用 pLV-shRNA-trim5 a -337製備的複製缺陷性人慢病毒感染獲得。
[0034] 本發明還提供一種獲得trims a基因沉默的哺乳動物細胞的方法，其包括用本發 明的載體轉染哺乳動物細胞，優選是牛細胞，更優選是MDBK細胞。
[00巧]本發明獲得trims a基因沉默的哺乳動物細胞的方法包括W下步驟：
[0036] (1)本發明的SiRNA人慢病毒表達載體、P化載體和抑2載體H質粒與化Iyfect-V 轉染試劑（購買於北京英茂盛業生物科技有限公司）用脂質體轉染法共轉染人胚腎細胞 肥K293T，獲得SiRNA複製缺陷型人慢病毒。
[0037] (2)MD服細胞接種到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（購買 於美國Hyclone公司）的培養液培養MD服至細胞匯合度60%。取SiRNA複製缺陷型人 慢病毒（濃度約為1?5Xl〇7 TU/ml)100y 1，在室溫下融化，加入培養液400y 1，，加入 polybrene(聚凝胺，購買於美國Sigma公司）至終濃度6]i g/ml，混勻製成SiRNA人慢病毒 感染液，用感染液替換MDBK細胞培養液。24小時後棄感染液，換新的含有終濃度7. 5 y g/ ml嘿嶺黴素的DMEM進行連續培養。
[003引 （3)維持所述嘿嶺黴素濃度2周直至每孔出現1-2個細胞克隆。
[0039] (4)將嘿嶺黴素濃度減到3. 75 y g/ml，繼續培養2周後將細胞克隆挑選到24孔板 繼續培養。
[0040] (5)待細胞擴增後凍存並檢測trims a基因表達。
[0041] 本發明的目的在於提供一種提高外源基因在MD服細胞中的表達水平的方法，其 包括在MD服細胞中導入本發明的人慢病毒載體。
[0042] 本發明還提供trims a基因沉默的哺乳動物細胞作為外源基因表達宿主的用途， 所述MDBK細胞中導入本發明的人慢病毒病毒載體。所述哺乳動物細胞優選為牛細胞。更 優選地，所述哺乳動物細胞為MD服細胞。更優選地，所述哺乳動物細胞為MD服細胞Nl、N2、 N3 和 N14,特別優選為 N14(CCTCC No. C2014116)。
[0043] 本發明的優點在於通過SiRNA沉默牛trims a基因表達，有效地提高人病毒載體 在牛腎傳代細胞MDBK中的基因表達。導入本發明SiRNA序列的細胞克隆中trims a基因抑 制效果明顯，mRNA相對表達水平顯著下降，N14細胞中trims a的mRNA表達被下調了 60%。 用本發明N14細胞感染GFP人慢病毒載體的感染效率提高了 4倍（P<0. 05)，表達效率提高 80倍（(P<0. 01)。本發明為牛病毒病相關基因功能和轉基因牛培育的研究提供新的技術支 持。
[0044] 本發明涉及的牛trims a基因沉默細胞株BTL2013已於2014年7月8日保藏 於中國典型培養物保藏中也，地址：中國武漢武漢大學，郵編430072,保藏編號為CCTCC No. C2014116。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1為本發明的trims a基因沉默表達慢病毒載體的示意圖。SiRNA ds oligo 插入到載體中BamHl和EcoRl之間，由III類RNA聚合酶啟動子U6啟動子轉錄產生ShRNA, 經剪切後產生成熟SiRNA,產生幹擾效果。嘿嶺黴素（Puromycin)抗性基因可W用於篩選 trims a基因沉默穩定細胞株。
[0046] 圖2實時定量PCR方法檢測不同SiRNA序列的細胞克隆中trims a mRNA相對表達 水平。
[0047] 圖3實時定量PCR方法檢測第45代的N14細胞中trims a的表達水平。
[004引圖4英光顯微鏡檢測MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細胞後GFP英光表 達水平。
[004引圖5英光顯微鏡檢測MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細胞後GFP基因轉 移效率。
[0050] 圖6-1流式細胞儀檢測MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細胞後GFP表達 呈陽性的細胞百分比；
[0051] 圖6-2流式細胞儀檢測基因MOI 100的CMV-GFP-L V慢病毒感染N14細胞後的 GFP基因轉移效率和表達強度。

【具體實施方式】
[0052] 實施例1.構建帶有編碼特異性沉默trims a基因的SiRNA的DNA的人慢病毒載 體
[0053] 1、篩選編碼trims a基因的SiRNA的DNA序列
[0054] 利用生物信息學檢索NCBI GeneBank得到牛trims a基因（L0C505265) mRNA 全序列作為siRNA設計的碑!序列。在相應的siRNA設計網站化ttp: //rnaidesigner. Iifetechnologies. com/rnaiexpress/)上進行初步設計與篩選，找出具有SiRNA功能的可 能祀序列與其對應編碼SiRNA的DNA序列。然後將所選定的正義鏈序列和反義鏈序列與 GeneBank(ht1:p://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物種的基因序列進行比較，優 選出具有SiRNA功能的可能祀序列，分別命名為SiRNA-I至SiRNA-4.包括：
[00巧] (1) trims a -siRNA-1 :
[0056] 5, -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3，
[0057] 3' -TTGTCTTGACTTCTGCCAG-5'
[0058] 似；trims a-siRNA-2
[0059] 5, -CTGTCAAGCCTGTATCACT-3'
[0060] 3' -AGTGATACAGGCTTGACAG-5'
[0061] 做 trims a -siRNA-3 :
[0062] 5, -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3'
[0063] 3' -TCTGCAGACATGATTGGAG-5'
[0064] (4) trims a -siRNA-4 :
[00巧]5, -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'
[0066] 3' -TCTTGGACCAGATCATTCT-5'
[0067] 根據祀序列設計編碼SiRNA的DNA序列和隨機對照序列，該些序列為
[0068] (1) trims a -337 ;(對應祀序列 SiRNA-I) 5, -3，
[0069] 沈Q ID NO. 5: S
[0070] gatcGCTGGCAGAAGTCAAGACAATTCAAGAGATTGTCTTGACTTCTGCCAGTTTTTTg
[0071] 沈 QIDN0.6:R
[0072] aattcAAAAAACTGGCAGAAGTCAAGACAATCTCTTGAATTGTCTTGACTTCTGCCAGC
[0073] (2) trim5 a -480 ;(對應祀序列 SiRNA-2) 5，-3，
[0074] 沈Q ID NO. 7: S
[00巧]gatcGCTGTCAAGCCTGTATCACTTTCAAGAGAAGTGATACAGGCTTGACAGTTTTTTg
[0076] 沈Q ID NO. 8: R
[0077] aattcAAAAAACTGTCAAGCCTGTATCACTTCTCTTGAAAGTGATACAGGCTTGACAGC
[0078] (3) trims a -808 ;(對應祀序列 siRNA-3) 5, -3，
[0079] SEQ ID NO. 9: S
[0080] gatcGCTCCAATCATGTCTGCAGATTCAAGAGATCTGCAGACATGATTGGAGTTTTTTg
[0081] 沈Q ID NO. 10: R
[0082] aattcAAAAAACTCCAATCATGTCTGCAGATCTCTTGAATCTGCAGACATGATTGGAGC
[0083] (4) trims a -1037 ;(對應祀序列 siRNA-4) 5, -3，
[0084] 沈Q ID NO. 11: S
[0085] gatccAGAATGATCTGGTCCAAGATTCAAGAGATCTTGGACCAGATCATTCTTTTTTTg
[0086] 沈Q ID NO. 12: R
[0087] aattcAAAAAAAGAATGATCTGGTCCAAGATCTCTTGAATCTTGGACCAGATCATTCTg
[0088] (5)隨機對照序列 Control ;5, -3'
[0089] 沈Q ID NO. 13: S
[0090] gatccATCGACTAGCCACTTAGACTTCAAGAGAGTCTAAGTGGCTAGTCGATTTTTTTg
[0091] 沈Q ID NO. 14: R
[0092] aattcAAAAAAATCGACTAGCCACTTAGACTCTCTTGAAGTCTAAGTGGCTAGTCGATg
[0093] 2、將上述siRNA的DNA序列和隨機對照序列送Invitrogen公司合成，並退火生成 雙鏈寡核巧酸ds OligOo
[0094] 在0. 2ml的PCR擴增管中建立下列10 U 1反應體系：
[0095] 1 U g/ U 1 的正義鏈；0. 4 y 1
[0096] 1 U g/ U 1 的反義鏈；0. 4 y 1
[0097] 退火緩衝液；9. 2yl
[0098] 95°C賠育上述反應體系4min，然後放置室溫下退火5-lOmin。短暫離也後，移出 Iyl反應液稀釋至適當濃度備用。剩餘的SOyM ds oligo儲存於-20°C。
[0099] 3、EcoRl、BamHl雙酶切線性化人慢病毒載體pLV-shRNA-puro (內切酶購買於肥B 公司，pLV-shRNA-puro載體購於北京英茂盛業生物科技有限公司）。將ds oligo片段與線 性化的pLV-shRNA-puro載體連接，構建重組pLV-shRNA-puro。在室溫下，0. 2ml的PCR擴 增管中依次加入下列試劑建立10 U 1連接反應體系：
[0100] 上述2稀釋好的ds oligo ;1 y 1
[0101] 經酶切純化後的載體：1 U 1
[0102] IOX連接緩衝液：1 Ul
[0103] T4 DNA 連接酶（Promega) : 1 y 1
[0104] 雙蒸水；6 Ul
[0105] 16 C過夜連接，反應終止後-2(TC保存。
[0106] 4、連接產物轉染大腸桿菌感受態地5 a。37C培養過夜，挑取克隆用引物U6F、U6R 進行PCR鑑定。引物序列如下：
[0107] U6F ：GACTATCATATGCTTACCGTAACT
[0108] U6R ：GGTGGATGTGGAATGTGTG
[0109] 5、PCR鑑定正確的克隆用引物U6F測序（引物合成和測序由北京中美泰和 生物技術有限公司完成），將測序正確的質粒分別命名為pLV-shRNA-trim5 a -337、 pLV-shRNA-trim5 a-480、pLV-shRNA-trim5 a-808、pLV-shRNA trims a-1037 和 pLV-shRNA-control。pLV-shRNA-trim5a-337 測序結果見 SEQ ID No. 17。測序正確的克 隆用Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit質粒提取試劑盒提取質粒，定量後保存備用。
[0110] 實施例2. MD服細胞trims a基因沉默穩定細胞株篩選
[0111] 1、MD服細胞嘿嶺黴素使用濃度測試
[011引 （I)MD服細胞W 5X IO^孔接種到24孔板。24小時後加入嘿嶺黴素（購買於美 國sigma公司）至下列濃度：
[0113] (2)0. 1 U g/ml ；2. 5 u g/ml ；5 u g/ml ；7. 5 u g/ml ；10 u g/ml〇
[0114] (3)每2天換液一次，並重新添加嘿嶺黴素。
[0115] (4)選擇3-4天全部細胞死亡的濃度為篩選用藥濃度。
[0116] 2、複製缺陷型人慢病毒的獲得
[0117] 取實施例1中製備的5個重組人慢病毒載體中任一個、P化載體和P肥載體H質粒 與化Iyfect-V轉染試劑（購買於北京英茂盛業生物科技有限公司）用脂質體轉染法共轉 染人胚腎細胞肥K293T(購買於北京英茂盛業生物科技有限公司），4她收穫無複製能力的 人慢病毒上清液。4C條件下500g離也5min W去除細胞碎片，收集含慢病毒的上清-7(TC 保存備用。PEG6000沉澱法純化病毒。採用嘿嶺黴素最小致死量篩選病毒感染細胞的方法， 進行慢病毒滴度測定。按上述方法製備4個含SiRNA序列和1個隨機對照序列的複製缺陷 型人慢病毒。
[0118] 3、複製缺陷型人慢病毒轉染MD服細胞及嘿嶺黴素篩選
[0119] (I)MD服細胞接種到24孔板，用高糖DMEM和重量百分比10%胎牛血清（購買於 美國Hyclone公司）的培養液按500 y 1/孔培養MD服至細胞匯合度60%。任取1個上述 製備的複製缺陷型人慢病毒（濃度約為1?5 X l〇7TU/ml) 100 y 1，在室溫下融化，加入培養 液400]i 1，加入polybrene(聚凝胺，購買於美國Sigma公司）至終濃度6]i g/ml,混勻製成 SiRNA人慢病毒感染液500 。4個含SiRNA序列和1個隨機對照序列的複製缺陷型人慢 病毒的感染液均按此種方法配製。將每種感染液替換MDBK細胞培養液進行感染。24小時 後棄感染液，換新的含有終濃度7. 5 y g/ml嘿嶺黴素DMEM進行連續培養。每種感染液做2 個24孔板。
[0120] (2)維持所述嘿嶺黴素濃度2周直至每孔出現細胞克隆。
[0121] (3)將嘿嶺黴素濃度減到3. 75 y g/ml，繼續培養2周後將細胞克隆挑選到24孔板 繼續培養。
[0122] (4)待細胞擴增後凍存並檢測trims a基因表達，將獲得的MD服trims a基因沉 默細胞克隆分別命名為 N14 (對應 trims a -337)、N1 (對應 trims a -480)、N2 (trims a -808) 和N3 (trims a -1037)。隨機對照序列的細胞克隆命名為NC。細胞克隆N14命名為牛trims a 基因沉默細胞株BTL2013,已於2014年7月8日保藏於中國典型培養物保藏中也，保藏號為 CCTCC No. C2014116。
[0123] 4、不同SiRNA序列的細胞克隆檢測
[0124] 用實時定量PCR檢測不同SiRNA序列的細胞克隆中trims a mRNA相對表達水平。
[0125] 4.1、提取細胞總RNA
[0126] (1)將上述不同細胞克隆接入6孔板中，待細胞生長至90%密度，去除培養基，力口 入Iml Trizol/孔。反覆吹吸使細胞脫落。將細胞裂解物轉移至1. 5ml離也管中。
[0127] (2)室溫賠育5分鐘，加入0. 2ml氯仿，震蕩混勻，室溫賠育3分鐘。
[012引（3)41：，12000巧111 離也 15 分鐘。
[0129] (4)將上層無色水相轉移到新的離也管，加入0. 5ml異丙醇。充分混勻。室溫賠育 10分鐘。
[0130] 巧）4°C 12000巧m 離也 10 分鐘。
[0131] (6)去除上清。
[0132] (7)加入Iml 75%己醇，漂洗RNA沉澱，4°C 7000巧m離也5分鐘。
[0133] (8)去除上清，室溫揮發乾淨殘餘液體，加入20 y 1無RNA酶的水溶解RNA沉澱。 用紫外分光光度計定量後備用。
[0134] 4. 2反轉錄
[0135] (1)在冰上配製如下反應物：
[013引 總 RNA Iug
[0137] oligodT primer Iul
[013引加水補足 12 Ul
[013引 似將配好的反應物混勻，短暫離也，65C賠育5分鐘，立刻冰浴。
[0140] 0)加入如下試劑：
[0141]

【權利要求】
1. 一種使牛trim5a基因沉默的RNA幹擾方法，其特徵在於通過幹擾牛trim5a基因， 下調牛trim5 a表達從而提高外源基因在MDBK細胞中的表達水平。
2. 根據權利要求1的的方法，其特徵在於通過siRNA序列實現幹擾，所述 siRNA 序列選自 5' -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3'、5' -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3' 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
3. -種使牛trim5 a基因沉默的siRNA，其特徵在於所述siRNA幹擾牛trim5 a基因， 下調牛的trim5 a表達從而提高外源基因在MDBK細胞中的表達水平。
4. 根據權利要求3所述的siRNA，其特徵在於所述siRNA選 白 5> -CTGGCAGAAGTCAAGACAA-3>、5> -CTCCAATCATGTCTGCAGA-3> 或 5' -AGAATGATCTGGTCCAAGA-3'。
5. -種包含權利要求3或4所述的siRNA的病毒表達載體，所述病毒表達載體為 pLV-shRNA-trim5 a -337> pLV-shRNA-trim5 a -808> pLV-shRNA-trim5 a -1037〇
6. 構建權利要求5所述的siRNA病毒表達載體的方法，包括以下步驟： (1) 根據牛trim5 a基因 mRNA全序列篩選RNA幹擾靶點，設計siRNA序列和對照隨機 序列， (2) 酶切病毒載體， (3) 合成接頭引物，退火後連接到病毒載體， (4) 連接產物轉染大腸桿菌感受態dH5 a，培養過夜， (5) 挑取克隆進行PCR鑑定，獲得測序正確的克隆，提質粒定量後備用。
7. -種trim5 a基因沉默的哺乳動物細胞，其特徵在於所述哺乳動物細胞導入根據權 利要求5所述的siRNA病毒表達載體。
8. 根據權利要求7所述的細胞，其特徵在於所述細胞是牛腎細胞MDBK，所述細胞是 N14,命名為牛trim5a基因沉默細胞株BTL2013,已於2014年7月8日保藏於中國典型培 養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No. C2014116。
9. 一種提高外源基因在MDBK細胞中的表達水平的方法，其特徵在於所述方法包括在 MDBK細胞中導入根據權利要求5所述的siRNA病毒表達載體。
10. 權利要求3或4所述的siRNA或權利要求5所述的siRNA病毒表達載體在製備 trim5 a基因沉默的哺乳動物細胞的用途。
【文檔編號】C12N15/86GK104357444SQ201410539364
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月13日 優先權日:2014年10月13日
【發明者】劉豔紅, 尚佑軍, 孫德惠, 劉湘濤, 殷宏, 龔真莉, 祁淑芸, 李勇 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所