針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體l5-78的製作方法

2023-05-14 21:47:31

針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體l5-78的製作方法
【專利摘要】一種針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體和多肽，其具有SEQIDNO.:1所示的胺基酸序列的蛋白質或多肽，可用於免疫檢測、抗原富集純化等領域。本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質（親和性、特異性、穩定性等）更好的突變體，用來發展進一步用於醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
【專利說明】針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體L5-78【技術領域】
[0001]本發明涉及單域重鏈抗體技術(又稱納米抗體技術)，以及基因工程抗體技術，特別是針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體或多肽。
技術背景
[0002]單域抗體是指由普通抗體可變區(VH或VL)組成的基因工程抗體。單域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH 抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指僅由重鏈抗體(heavy-chain antibody)可變區(Variable region)組成的基因工程抗體，其中，重鏈抗體(heavy-chain antibody)是一種存在於駱5它、S魚等動物體內天然缺失輕鏈的抗體。單域重鏈抗體具有分子量小、滲透性好等特點，目前已廣泛用於基礎研究、醫學診斷和檢測、抗體藥物開發等領域。
[0003]單核細胞增生性李斯特菌(Zisteria簡稱單增李斯特菌，LM),屬於李斯特菌屬，目前在病源學上已被世界普遍公認為是一種能引起人畜共患病和食源性疾病的病原菌，於1926年最先由Murray等從家兔體內分離得到，能引起人、畜及禽類的李斯特菌病，該病的臨床表現為人和動物腦膜炎、敗血症及孕婦流產等，以妊娠期婦女、新生兒及免疫功能低下者易感染。人主要是通過食用汙染的奶及奶製品、肉類等動物性食品而引起李斯特菌病。雖然由單增李斯特菌引起的李斯特病的發生率並不高，但是由於其致死率高達30%以上，對免疫缺損的病人，致死率甚至高達70%。
[0004]目前，已有針對單增李斯特菌的多克隆抗體、單克隆抗體的公開報導。與單域重鏈抗體相比，這些抗體存在生產成本相對較高，製備過程複雜等缺點。單域重鏈抗體具有分子量小、滲透性好等性質，顯示出廣闊的應用前景。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體(包括含有所述單域重鏈抗體全部或部分功能區域的蛋白質或多肽)及其胺基酸序列，可以被用於製備檢測單增李斯特菌的試劑和工具。
[0006]本發明提供針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體，具有SEQ ID N0.:1所示的胺基酸序列。
[0007]其胺基酸序列的IMGT編號和結構域的劃分如圖1所示。
[0008]本發明所提供的單域重鏈抗體分別包括四個框架區(Framework region, FR)和三個互補決定區(Complementarity-determining region, CDR)。SEQ ID N0.:1 中，框架區(FR1-FR4)分別選自I~25，34~50，59~96，114~124胺基酸序列，互補決定區(CDR1-CDR3)分別選自26~33，5廣58和97~113胺基酸序列(見序列表)。互補決定區主要負責抗原的識另IJ，框架區結構相對穩定，主要起著支撐維持蛋白質結構的作用。
[0009]本發明提供一個核酸分子，編碼SEQ ID N0.:1，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。[0010]所述的核酸分子優選為SEQ ID N0.:2序列。
[0011]本發明所提供的核苷酸序列可以通過合適的表達系統進行表達以得到相應的蛋白質或多肽。這些表達系統包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統。
[0012]本發明還提供一種載體，包含所述核酸序列。
[0013]本發明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質或表達載體。
[0014]本發明還提供一種檢測單增李斯特菌的方法，其特徵是含有上述蛋白質或多肽。基於本發明提供的蛋白質或多肽與單增李斯特菌特異性結合的能力，建立單增李斯特菌的檢測方法。其中，優選的方法包括酶連免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),螢光免疫法(Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫晶片法，親和層析法和免疫層析法。
[0015]本發明還涉及該針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體在單增李斯特菌免疫檢測、菌體或抗原富集純化方法中的應用。
[0016]本發明所提供的胺基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術進行改造，能夠獲得性質(水溶性、穩定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發展進一步用於醫藥、工業、農業的蛋白質或多肽。
[0017]本發明所敘述的一些術語具有如下含義:
同源性:描述兩個或更多胺基酸序列的相似程度，第一個胺基酸序列和第二個胺基酸序列之間同源性的百分比可以通過【第一個胺基酸序列中與第二個胺基酸序列中相應位置處的胺基酸序列相同的胺基酸殘基的數量】除以【第一個胺基酸序列中胺基酸總數】在乘以【100%】來計算，其中第二個胺基酸序列中的某個胺基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一個胺基酸相比)被認為是有差別`。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用於序列匹配的計算機運算程序如NCBI Blast獲得。
[0018]結構域:蛋白質三級結構的基本結構單位，通常具有一定的功能。
[0019]IMGT 編號:IMGT 資料庫(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種已經標準化的抗體胺基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenman，F.，Q.Kaas, et al.(2010).」 IMGT / 3D structure-DB and IMGT / DomainGapAlign:adatabaseand a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC,IgSF and MhcSF.，，Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D301-307.Lefranc,M.P., C.Pommie, et al.(2003).，，IMGT unique numbering for immunoglobulin andT cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-1ike domains 「Dev compImmunol 27(1):55-77.)中的描述。
[0020]密碼子(codon):又稱為三連體密碼子(triplet code),指對應於某種胺基酸的核苷酸三聯體。在轉譯過程中決定該種胺基酸插入生長中多肽鏈的位置。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1胺基酸編號及結構域示意圖。
[0022]圖2間接phage-ELISA法測定噬菌體結合活性及特異性。縱坐標表示ELISA讀數計測定450nm處吸光值,橫坐標表不按照表1加樣，包被的不同菌體，大腸表不大腸桿菌，沙門表示沙門氏菌，蠟樣表示蠟樣芽胞桿菌，單增表示單增李斯特氏菌，格氏表示格氏李斯特氏菌，英諾表示英諾克李斯特氏菌，威爾表示威爾李斯特氏菌，綿羊表示綿羊李斯特氏菌，西爾表示西爾李斯特氏菌。
[0023]圖3噬菌粒pHEN-L5-78結構圖。
[0024]圖4表達質粒PET25-L5-78結構圖。
[0025]圖5為L5-78單域重鏈抗體表達及Western Blot鑑定圖，左邊泳道I為蛋白分子量標準，泳道2為不加IPTG誘導的BL21-PET-25b-L5-78重組菌裂解液，泳道3為經過IPTG誘導的BL21-PET-25b-L5-78重組菌裂解液。右邊為以抗His標籤酶標抗體為探針的Western Blot 鑑定圖。
【具體實施方式】
[0026]下面通過單域重鏈抗體(多肽)的製備、分析及應用，對本發明做進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用範圍。
[0027]實施例1抗單增李斯特菌單域重鏈抗體的淘選與鑑定
採用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫中淘選針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體。單增李斯特菌的培養參照國標GB4789.30-2010進行，培養的單增李斯特菌使用無菌的磷酸緩衝溶液(PBS，pH7.4)稀釋到2 X IO9CFU / mL，將其加入酶標板孔中，100UL /孔，4°C包被過夜，首輪淘選包被3孔，以後的淘選包被I孔，吸出包被液，PBS洗板3次。在幾輪的淘選過程中，以3% BSA或3% OVA交替作為封閉劑，37 °C封閉2 h，PBS洗板3次，加入噬菌體抗體庫100 u L (約含2 X IO11PFU), 37°C孵育1.5h，首輪只使用PBS洗滌，後面各輪使用PBST (含I % Tween-20)洗板3次(逐輪增加I次)，再用PBS洗板4次(逐輪增加2次)。以IOOii L甘氨酸-鹽酸洗脫液(Gly-HCl，pH 2.2)洗脫結合的噬菌體，用20ii L的Tris-HCl (pH 9.1)中和洗`脫物，取10 u L用於滴度測定，其餘洗脫物進行擴增，並將擴增產物用於下一輪淘選。`
[0028]經過五輪淘選後，採用輔助噬菌體KM13對隨機挑選的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA法測定噬菌體顆粒的結合活性(圖2)。
[0029]表1間接phage-ELISA加樣表
【權利要求】
1.針對單增李斯特菌的單域重鏈抗體，具有SEQID N0.:1所示的胺基酸序列。
2.—種核酸分子，其特徵是編碼權利要求1中所述胺基酸序列。
3.如權利要求2所述的核酸分子，其特徵具有如SEQID N0.:2序列。
4.一種包含權利要求2所述的核酸序列的載體。
5.—種包含權利要求4所述的載體的宿主細胞。
6.權利要求1所述的針對單增李斯特菌單域重鏈抗體在免疫檢測、菌體或抗原富集純化方法中的應用。
【文檔編號】C07K16/12GK103497252SQ201310430970
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】塗追, 陳奇, 陶勇, 熊勇華, 許楊 申請人:南昌大學