用酵母表達sTNFR免疫粘附素融合蛋白和多肽的方法及其應用的製作方法

2023-05-14 06:17:16

專利名稱：用酵母表達sTNFR免疫粘附素融合蛋白和多肽的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及採用基因工程方法構建可溶性受體免疫黏附素蛋白及其聚合物，和用巴斯德畢赤酵母表達系統表達生產該蛋白的方法，以及在治療TNF介導的疾病方面的應用。
背景技術：
炎症是機體對諸如機械損傷、感染或抗原刺激引起的傷害而產生的一種防禦反應。當炎症由不適當的刺激如自身抗原引起時，炎症反應可病理性地表達，當有害物去除後，炎症反應仍可以過度地或持久地病理性地表達。人們對炎症的病因學認識較少，但隨著現代生物技術的發展，近年來已經獲得了關於炎症分子方面的相當多的信息，由此鑑定出據信在炎症調節中作用顯著的某些細胞因子。細胞因子是調節細胞、特別是在細胞因子合成和釋放速發區域中的細胞行為的胞外蛋白。許多細胞因子與機體的炎症反應有關，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素-1、-2、-6(IL-1、IL-2、IL-6)，轉移生長因子-β(TGF-β)和巨噬細胞粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)等，其中腫瘤壞死因子-α(TumorNecrosis Factor alpha，TNF-a)和白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-7)是目前已經發現的兩種最有效的炎性細胞因子，分別被認為是被稱為 「TNF-α介導的疾病」和「IL-1介導的疾病」的許多疾病和紊亂中的關鍵介質的細胞因子。
腫瘤壞死因子(TNFs)是一族由數目眾多的細胞類型，包括單核細胞和巨噬細胞產生的細胞因子。如果自發性或實驗性疾病或紊亂與體液或組織中較高水平的TNF相關，或從所述機體中取出的細胞或組織在培養中產生較高水平的TNF，那麼所述疾病或紊亂被認為是「TNF介導的疾病」。在許多情況下，由以下另外兩種狀況也可識別這類TNF介導的疾病(1)可以通過給與TNF在動物中試驗性地模擬與所述疾病或紊亂有關的病理學發現；以及(2)可以通過用抑制TNF作用的藥物，抑制或消除所述疾病或紊亂的實驗行動物模型中誘導的病理。在大多數TNF介導的疾病中，遇到至少三種狀況中的兩個，在許多「TNF介導的疾病」的疾病中，遇到所有三種狀況。非全部的急性和慢性TNF介導的炎症疾病的一覽表包括(但不限於)以下
炎症性腸炎(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；關節的炎症性疾病，包括骨關節炎、牛皮癬性關節炎和類風溼性關節炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癬；膿毒症和膿毒性休克；肝硬化；子宮內膜異位；多發性硬化；肌病(例如肌蛋白代謝，尤其是膿毒症中)；急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；全身炎症反應症候群(SIRS)；缺血性損傷，包括小腦缺血(例如由創傷引起的腦損傷、癲癇、出血或中風，每種都可能導致神經變性)；充血性心力衰竭；再灌注損傷；移植排斥反應；或由勞累、扭傷、軟骨損傷、創傷、整形外科、感染或其他疾病產生的炎症反應。
目前研究報導的腫瘤壞死因子有TNF-α和TNF-β(或淋巴細胞毒素)，每一種作為三聚體分子是有活性的，被認為通過交聯受體而啟動細胞信號。一系列證據表明TNF-α和TNF-β是主要的炎症性細胞因子，在機體的許多炎症反應疾病如類風溼性關節炎、紅斑狼瘡、硬皮病、膿血症的發生和發展中起重要作用。這些已知的TNFs對許多不同的靶細胞具有重要的生理作用，這些靶細胞包含在多種刺激如感染或損傷而引起的炎症反應中。
類風溼性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、反覆發作性、非特異性和多發性關節炎，它是全身結締組織和膠原纖維組織病變的局部表現，特別以手中指、趾等小關節最易受累。RA患者早期或急性期發病，關節紅、腫、熱、痛和運動障礙，晚期則關節強直或畸形，並有骨和骨骼肌萎縮，在整個病程中，可有發熱、無力、貧血、多發病。本病的病因尚不明確，一般認為其發病與自身免疫、遺傳、感染、病毒、內分泌改變等有關，是一種自身免疫性疾病，在局部免疫系統活動性極度活躍時關節襯開始出現發炎症狀。類風溼性關節炎常常造成關節的破壞、疼痛和損害變形，進而限制了患部關節的正常活動範圍。本病雖一般不致影響患者生命，但致殘率高，可造成嚴重殘廢使病人完全喪失勞動能力，如病變嚴重破壞頸椎或累及重要臟器也威脅患者生命。未經治療的患者，兩年致殘率為50％，三年致殘率為70％，與正常人相比，類風溼性關節炎患者的平均壽命縮短10-15年，且嚴重影響生活質量，因此該病要早診斷早治療，以延緩致殘，降低致殘率。在我國該病的發病率約為0.3％～0.5％，平均約0.35％，女性與男性的發病人數之比約為3∶1或女性更多一些，患病人數約達450萬人。
在美國，近4,000萬關節炎患者採用目前有效的NSAIDs，使用這些藥物有可能會導致胃潰瘍和其它嚴重的併發症(如胃腸道出血或穿孔)。事實上，近期的一項研究評估指出，這些併發症每年可造成107,000名美國人住院接受治療和16,500名美國人死亡。
據世界衛生組織WHO報告提供的數字，約有1％的人在其一生中會患有類風溼性關節炎病，這樣僅中國患者就將達1000多萬人，但目前的治療非常有限的，因而這類藥物將具有廣闊的市場前景。
據估計，在醫療保健和勞資損失方面，美國關節炎患者每年要耗費650億美元，用於因嚴重NSAIDs副作用面臨住院治療的年耗資超出的10億美元。類風溼性關節炎的醫療費用支出年增長率為7％。預計類風溼性炎治療劑的銷售額將從1997年的約15億美元上升到2009年的66億美元。主要是由於新的生物製劑和新的細胞分裂素調節劑的近幾年將陸續上市，預計到2009年僅治療RA的生物藥品部分價值就達45億美元。
我國人口眾多，RA患者眾多，特別在高寒、高溼地區尤為突出，目前尚缺乏特別有效的治療藥物，現有藥物或療效差、或毒副作用大，對新型針對性強、有效率高、副作用小的免疫耐受型藥物有著迫切的要求。
關節組織中的TNFs主要由滑膜細胞的軟骨細胞產生。類風溼性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者的血清及關節液中檢測出高水平TNFs已得到公認，提示TNFs與RA的發生和發展關係密切。研究表明TNFs是關節軟骨破壞的最重要的一種細胞因子。它能促進滑膜組織的滑膜細胞和淋巴細胞的增殖和分化；能促進滑膜細胞和軟骨細胞合成並釋放前列腺素E2和膠原酶。PGE2和膠原酶引發滑膜炎症反應、軟骨基質的崩解，而局部免疫複合物、游離的膠原等分解產物刺激TNFs的合成，這樣形成一個惡性循環。另外TNFs能刺激滑膜細胞和軟骨細胞合成過量的金屬蛋白酶包括膠原酶和基質溶素，後者(又稱蛋白多糖酶)能溶解破壞軟骨基質。TNFs還能作用滑膜細胞釋放纖維蛋白酶原激活劑，誘導滑膜細胞和軟骨細胞釋放磷脂酶A2，而磷脂酶A2能抑制蛋白多糖前體物質氨基多糖的合成，抑制軟骨細胞對多種生長因子促有絲分裂作用。此外TNFs還具有誘導IL-2和IL-6產生的詐用，在某些病理狀況下，TNF可與IL-2或IL-1發生協同性生物學效應。
腫瘤壞死因子(TNFs)是炎症和免疫反應的主要介質，對其活性的調節是調節和控制這些反應的主要手段。由兩種截然不同的白細胞介素-1編碼基因IL-1α和IL-1β，分別編碼IL-1α蛋白和IL-1β蛋白。IL-1α和IL-1β兩種蛋白分子均具有約17.5Kda的分子量，並均曾以具有分子量約為31Kda的較大的前體分子在以前合成過，但他們在序列上顯示很少的相似性。兩種蛋白均為多效性的細胞因子，對不同的組織和對人類的許多病理，特別是在組織的免疫應答和炎症的過程中產生種種相似的效用。
TNF產生的生物活性是通過與特異性質膜受體結合而介導的。TNF有兩個受體，分別稱為I型和II型TNF受體(TNF-RL和TNF-RII)，以單分子可溶形式天然存在。腫瘤壞死因子受體I，又稱為TNFR55、P55、P60、TNF-RI，CD編號為CD120a，是55-60kDI型跨膜糖蛋白，前體長455胺基酸殘基，切除29胺基酸的信號肽後，成熟膜蛋白長426胺基酸殘基。胞膜外區(182胺基酸)有4個CRD，其中有3個N-糖基化位點。跨膜區有21胺基酸，胞漿區較長，有223胺基酸，有3個蛋白激酶C(PKC)作用位點，1個蛋白酪氨酸激酶(PTK)的作用位點。腫瘤壞死因子受體II又稱為TNFR75、P75、P80、TNF-RII，CD編號為CD120b，為75-80kD的I型跨膜糖蛋白，前體長461胺基酸殘基，N端為22胺基酸的信號肽，成熟蛋白長439胺基酸殘基，胞膜外區為235胺基酸，也有4個CRD，有2個N-糖基化位點。在靠近跨膜區的連接區還有一個富含絲/蘇/脯氨酸的STP區，是潛在的O-糖基化位點。跨膜區有30胺基酸，胞漿區長174胺基酸，有1個PKC作用位點。TNFRI與TNFRII在胞膜外區有28％的同源性，在胞漿區沒有同源性。TNFRI在胞漿區有一個約80胺基酸的死亡結構域，TNFRII沒有同樣的結構域，但其羧基端的78個胺基酸殘基可以結合TRAF2等胞漿信號蛋白，在信號轉導中發揮重要作用。TNFRI和TNFRII分布十分廣泛，幾乎存在於所有有核細胞表面。通過每個分子的細胞外配體結合(ligand-binding)部分的蛋白酶剪切，它們都可以從細胞表面脫落而被轉化為相應的可溶性TNF受體(sTNFR)，即sTNFRI與sTNFRII。TNF的生物活性依賴於其與細胞表面的TNFR的結合。由於這些可溶性的TNFR可與TNF結合，所以又被稱為TNF結合蛋白(TNF-BPI和TNF-BPII)。一般認為，可溶性TNFR可以結合TNF，從而局限或抵銷TNF活性，因而也可以作為TNF的拮抗劑。金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶都可能參與了可溶性受體的產生。
存在於受累關節滑液中的可溶性TNF受體(sTNFR)是TNF的一種重要的內平衡天然調節劑和天然抑制物，但其量非常低。事實上，TNF-α介導的炎症反應在相當程度上取決於TNF-α和sTNF-R之間是否平衡。健康人血循環中的sTNFR水平為1～2ng/ml，而RA患者滑膜液內的sTNFR可能要比之高4～5倍，可中和過量的TNF。TNF-α與其同源分子TNF-β相等地與TNF細胞表面受體結合而介導它們的生理和病理作用。通過加入sTNFR可競爭性地結合TNF而使TNF不能與細胞表面的TNFR相互結合，從而抑制或減少引起的生物反應。但sTNFR的半衰期特別短，通常為了延長其在體內的穩定時間而將其與免疫球蛋白IgG形成融合蛋白。
臨床上，針對細胞因子受體的治療策略已經得到了廣泛的應用，包括利用單克隆抗體、基因工程抗體或利用重組可溶性受體封閉其配體的作用。與抗體技術相比，重組可溶性受體的主要優點是其屬於人體自身成分，在治療中不易引起免疫應答的發生，因而安全性較好。但由於產生封閉效應所需的重組可溶性受體往往劑量很大，因而規模化生產較為困難，生產成本亦較高。此外，多數情況下，重組可溶性受體在體內的半衰期很短，需要多次給藥，因此目前進入臨床的重組可溶性受體多採用免疫粘附素(immunoadhesin)的策略，即在其C端通過基因融合技術加入免疫球蛋白的Fc段，使其成為融合蛋白，利用免疫球蛋白穩定性好的特點，使其體內半衰期延長。同時，由於免疫球蛋白Fc段可通過鏈間二硫鍵形成雙聚體，因而免疫粘附素融合蛋白亦形成雙聚體，能夠提高與其配體的親和力，更好地發揮療效。
免疫粘附素是指在基因水平將目的蛋白基因同免疫球蛋白的Fc片段基因相連，並在真核或原核細胞中表達出的具有上述兩部分結構域的重組蛋白。由於目的蛋白同免疫球蛋白部分結構域融合，使重組蛋白獲得了多種新的特性(1)引入的重鏈穩定區CH結構域使重組蛋白具有更長的半衰期，更適合於體內的應用。
(2)通過抗Fc段親和層析、葡萄球菌A(G)蛋白可以方便地進行純化及免疫共沉澱實驗。
(3)由於存在大量商品化的與Fc段配套的產品，使融合蛋白的檢測更加方便、特異、敏感。
(4)Fc段具有穿過胎盤、結合補體並介導補體依賴的細胞毒作用，介導ADCC效應等，這一特性被應用於某些疾病的靶向性治療。
(5)不同免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)Fc結構域可以形成多聚體分子，提高重組蛋白結合抗原或配體的能力。
Ashkenazi等構建了TNFR和IgG的融合蛋白，其二聚體分子與TNF的親和力較天然TNFR高6～8倍。體外實驗中，融合蛋白阻斷TNF裂解細胞的能力較可溶性TNFR高24倍，較中和性TNFmAb高4倍。在小鼠接受內毒素半小時前給予融合蛋白能完全預防內毒素誘導的死亡，在接受內毒素後1h給予融合蛋白仍有明顯的保護作用。
TNFR-IgG含有TNFR的全部胞外部分，可與細胞表面的TNFR或可溶性TNF形成複合物。人TNFR-IgG1免疫粘附素可大大增強TNFR的免疫粘附作用，其抑制TNF細胞毒效應為可溶性TNF受體的24倍，為TNF-αMcAb的4倍，對TNF的攻擊具有明顯的保護作用，TNFR-IgG1劑量是TNFMcAb的1/10時，其效應仍高於後者，抗外源性TNF的細胞毒作用比後者強～50倍，比TNFR強100～500倍。(Jin H et al.Protection against rat endotoxic shock by p55 TNFRimmunoadhesincoparision with anti-TNF McAb.J.Infect.Dis.1994，170(5)1323-1326)晶體結構表明，TNF與TNFRI作用的殘基數較多，而抗體與抗原的CDR則較少。因此，TNFR-IgGFc與TNF的結合可能比TNFMcAb與TNF結合更穩定，其中尤以TNFRI-IgGFc-TNF複合物更為明顯，TNFRI-IgGFc中和TNF的能力要比TNFRII-IgGFc更強。TNGR-IgGFc對人體的免疫原性很弱，沒有明顯的毒副作用，在使用上安全可靠，特別適用於治療類風溼性關節炎、敗血症的疾病。
我國在重組可溶性受體的研究與開發方面尚處於落後狀態，雖然有一些相關實驗室的報導，但均未達到進入開發的階段，其主要原因是此類藥物的臨床用量較大，並且多數需要用CHO真核表達系統來表達生產，因而對開發生產的技術和設備條件要求高，生產成本高，投資強度高，我國目前的生物技術產業的培養表達技術水平不能滿足這些條件。隨著我國生物技術總體水平的提高，應該重視重組可溶性受體藥物的開發研究問題，使我國在這一領域有所突破。
體外表達重組蛋白質的方式有許多種，包括於大腸桿菌，杆狀病毒，酵母，哺乳動物細胞或其他表達系統。本發明採用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統來表達生產所設計的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素嵌合蛋白。這類蛋白和多肽以前一直用CHO系統來表達，近年來也有用大腸桿菌表達系統表達的研究。然而，原核大腸桿菌表達系統雖然表達量較高，但溶胞產物中純化重組蛋白質十分困難，由大腸桿菌表達的外來蛋白質常會聚集且形成不溶的包涵體，因此常需要包涵體的溶解作用及接下來的再摺疊(Schein，C.H.andNoteborn，H.M.，Biotechnology，6291-294，1988；Wilkinson，D.L.and Hamson，R.G.，Biotechnology，9443-448，1991)，且大腸桿菌無法進行轉譯後修飾作用，如糖基化作用。而CHO表達系統除由於前述原因外，其表達量太低、不能滿足臨床需要也嚴重製約了其應用。
酵母是一類種類繁多的生物資源，已知有80個屬約600多種，數千個分離株，具備安全無毒，不致病；遺傳背景較為清楚，容易進行遺傳操作；容易進行載體DNA的導入；培養條件簡單，容易進行高密度發酵；良好的蛋白分泌能力；類似高等真核生物的蛋白質翻譯後的修飾功能等作為基因表達系統宿主條件。酵母表達系統通常可克服利用細菌系統時所遇到的某些問題，表大量較高，且有能力進行各種轉譯後處理修飾作用。所表達的外來蛋白質可分泌至培養物上清液中，其中並無其他許多蛋白質存留，而使得蛋白質的純化作用及過程的擴大更為容易。甲醇酵母基因表達系統是一種最近發展迅速的外源蛋白質生產系統。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達系統使用得最多、最廣泛(李黃金等.《生物工程學報》，1998，14(4)337)。自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為宿主表達外源蛋白以來，作為一種新的高效的表達系統，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報導的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，與以往的基因表達系統相比，它具有無可匹敵的高表達特性，已被認為是最具有發展前景的生產蛋白質的工具之一。這是由於與其它表達系統相比，巴斯德畢赤酵母表達系統具有以下特點和優勢1)含有特有的強有力的AOX(醇氧化酶基因)啟動子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達；2)表達水平高，即可在胞內表達，又可分泌型表達。畢赤酵母中，報導的最高表達量為破傷風毒素C為12g/l，一般大於1g/l。絕大多數外源基因比在細菌、釀酒酵母、動物細胞中表達水平高。一般畢赤酵母中外源基因都帶有指導分泌的信號肽序列，使表達的外源目的蛋白分泌到發酵液中，有利於分離純化；3)發酵工藝成熟，易放大。已經有大規模工業化高密度生產的發酵工藝，且細胞乾重達100g/l以上，表達重組蛋白時，已成功放大到10000升；4)培養成本低，產物易分離。畢赤酵母所用發酵培養基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其餘為無機鹽，培養基中不含蛋白，有利於下遊產品分離純化；而釀酒酵母所用誘導物一般為價格較高的半乳糖；5)外源蛋白基因遺傳穩定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體複製而複製，不易丟失；6)作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪醯化、蛋白磷酸化等翻譯後修飾加工功能。
蛋白質的糖基化鏈參與細胞識別、激素受體結合、蛋白質定位及宿主-微生物間相互作用，糖基化具組織和細胞特異性。蛋白糖鏈的剪切在高爾基體中進行。釀酒酵母缺乏甘露糖酶，對表達的外源蛋白不進行剪切，相反還會加上高達75個之多的甘露糖殘基，並含有許多側鏈，這就產生了過糖基化作用。過分糖基化作用阻遏蛋白與抗體的反應活性，而且，出現在外鏈的大量α-1，3-甘露糖使蛋白呈免疫原性，因而該表達糖蛋白不能用於治療。巴斯德畢赤酵母中修飾糖鏈的平均長度為8-14個甘露糖，而釀酒酵母多達50-150個甘露糖，使得它表達的外源蛋白分子量大，且變異範圍廣。而巴斯德畢赤酵母的外鏈不含α-1，3-甘露糖，避免了免疫原性的問題。
巴斯德畢赤酵母屬於甲醇營養型酵母，其重要特徵是能利用甲醇作為唯一的碳源和能源來源，甲醇可誘導其表達甲醇代謝所需的酶，如醇氧化酶(AlcoholOxidase AOX)、二羥丙酮合成酶(Dihydroxy-acetone synthase DHAS)和過氧化氫酶(catalase)，表達的AOX可達細胞蛋白的30％，而在葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源時，AOX幾乎不表達，進一步研究表達，AOX的表達是在轉錄水平調控的，其基因啟動子具有明顯的調控功能，可用於外源基因的表達。外源基因在甲醇以外的碳源中處於非表達狀態，而在培養液加入甲醇後，外源基因即被誘導表達。
已經在畢赤酵母染色體鑑定了二個AOX基因(AOX1和AOX2)，兩者編碼的蛋白有97％的同源性和幾乎相同的特異催化活性，但AOX1基因啟動子受甲醇強烈誘導，而AOX2啟動子則很弱，使得AOX1比AOX2表達量高得多。
巴斯德畢赤酵母演常見的表達載體有pPIC3、pPIC9、pPSC3k、pHIL-D1、pAO815等，表達載體結構一般為AOX1基因的5`AOX1啟動子、3`AOX1終止序列，3`AOX1序列，多克隆位點、組氨酸脫氫酶篩選標誌基因(His4)，大腸桿菌pBR322質粒片斷，外源目的基因一般插入5`AOX啟動子和轉錄終止信號之間的單克隆位點。
表達載體一般有兩種方式整合到畢赤酵母染色體上，一種是在His4或5`AOX1啟動子DNA片段的單酶切位點將質粒載體切成線性，通過單交換整合到染色體上，這樣整合的菌株表型為Mut+，畢赤酵母染色體上AOX1基因保持完整；另一種是雙位點互換，含5`AOX1啟動子、外源基因和轉錄終止區的表達單元置換染色體上的有完整功能的AOX1基因，產生的菌株表型為Mut-，由於AOX1基因被置換，只能靠弱轉錄的AOX2基因，因此該菌利用甲醇速度慢，但這兩個表達菌的表達水平均較高。
目前已有多種蛋白質的基因在該表達系統中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等。儘管各種外源蛋白質產生的水平不一，但各種蛋白質在甲醇酵母中的產生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統中產量的10～100倍(戴秀玉.《微生物學報》，1997，37(6)483--485)。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為450mg/L，提高了60倍(彭毅等.《生物技術通報》，2000，(1)38)。椐報導，外源蛋白質在甲醇酵母中的產量最高可達12g/L(Clare JJ et al.Bio/Technology，1991，9455--460)。
表達載體 首先，甲醇酵母中沒有穩定的質粒，所以其表達載體採用整合型質粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉錄終止子(3`AOX1)構建成整合型表達載體。PAOX1是一個極強的啟動子，醇氧化酶的產量最高可佔甲醇酵母中可溶性蛋白質的30％，所以能使外源蛋白質在它的控制下高效產生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導肽序列(α因子)構建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細胞的代謝負荷，另一方面可以減少宿主細胞蛋白水解酶對外源蛋白質的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個表達單元，產生高產的菌株，此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養基上生長時，甲醇酵母中AOX1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，誘導基因表達，使外源蛋白質的產量更高。甲醇酵母適合高密度連續培養的條件，細胞乾重達100g/L以上，蛋白質產量極高(柴清等.《(生命的化學》，1997，17(4)36)。受體菌採用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
經過近幾年的發展完善，甲醇酵母表達系統已日趨成熟，應用也日趨廣泛。國內已有多篇在甲醇酵母中生產外源蛋白質成功的報導。美國Invitrogen公司也已開發出多種新型的甲醇酵母表達系統試劑盒，如Multi-copy PichiaExpression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia ExpressionSystem等，利用甲醇酵母表達系統克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進一步深入，它在生產外源蛋白質方面將日益展示出誘人的前景。
發明詳述本發明的目的在於提供一個高級的酵母表達系統以生產具有生物活性的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素，該產品可作為一種生物製品藥物應用於人類「TNF介導的疾病」的治療。
IgG類免疫球蛋白當用於形成重組免疫粘附素嵌合體時，發現IgG可增加許多配體結合蛋白質(受體)的半衰期。然而，此種嵌合體有一個問題，即在活性部份肽與Fc部分肽融合處會生成新的肽序列，其對於人體是一種新抗原，具免疫原性。
本發明採用T細胞免疫學上惰性的連接肽來連接活性肽與Fc，如圖4所示的連接序列Sequence No.4-12，如GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。這些連接肽本身是免疫學上無活性的，在融合點處將這些連接肽插入，可將由於二個肽部分連接所產生的新抗原性消除。連接肽也可增加這些部分的撓性，且可保留生物活性。相對較長的連接肽有助於克服由嵌合體Fc部分帶來的可能的立體位阻，後者可幹擾嵌合體的活性。
嵌合體有較天然sTNFR長得多的半衰期。由於接頭，也可設計以將產生新的免疫原性表位(新抗原)的可能性減低，此點是sTNFR及免疫球蛋白Fc片段的融合點。細胞因子通常是有相當短半衰期的小蛋白質，其可在各種組織中，包括不希望位置，快速消失。本發明所述的特異嵌合體也可充作設計及構建其他細胞因子一Fc嵌合體的模型。可使用相同或類似的接頭以減少產生新的免疫原性表位的可能性，同時保留生物活性。
本發明的特徵在於在TNF可溶性受體與免疫球蛋白Fc之間引入了獨特的連接肽。經特殊設計的連接肽可增加二部分的撓性，且因此維持其生物活性。雖然TNF可溶性受體及免疫球蛋白均源自人體，但在二分子融合點處始終有產生新的免疫原性表位的可能性。因此，本發明連接肽(其主要由T細胞惰性序列所組成)的其他優點在於可在融合點減低免疫原性。若沒有連接肽存在，則TNF可溶性受體與免疫球蛋白Fc連接後所組成的新序列對人體而言將是一個新抗原。
本發明的特徵還在於使用巴斯德畢赤酵母表達系統表達生產，既可克服大腸桿菌表達系統和CHO表達系統的一些缺陷，又可綜合這兩個表達系統的一些優勢。
具體地說，本發明的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體為下式所代表的物質(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n其中Xa和Xb可以相同也可以不同；m和n分別獨立地為0或1，至少有一個為1.
其中Xa和Xb為腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRI(

圖1，Sequence No.1)、腫瘤壞死因子結合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFR II(圖2，Sequence No.2)、腫瘤壞死因子結合蛋白TNF-BPII或其多肽；其中Fc為免疫球蛋白IgG的Fc區，優選為免疫球蛋白IgG1的Fc區(圖3，Sequence No.3)；其中L為零或免疫學上無活性的接頭肽，選自圖4所示的序列(Sequence No.4-12)，優選為序列11(SequenceNo.11)。
本發明提供了一種用酵母表達系統生產具有生物活性的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體的方法，所述方法包括(a)在酵母表達載體中插入含有免疫學上無活性的接頭肽序列的編碼新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽的聚核苷酸序列，其中載體含有多個克隆位點；和(b)利用步驟(a)的載體轉化適當的酵母菌株，並且在適當的條件下培養酵母菌株生成新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽。
及(c)用適當的純化方法處理步驟(b)的上清，提純新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白。優選用PBS平衡的蛋白質A瓊脂糖柱純化，結合於蛋白質A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質以檸檬酸鹽溶液洗脫。
上述的方法中表達載體包括整合型質粒pPIC9K、pPIC3.5、pPIC9、pPICZαA、pMETαA、B、C等載體，優選為pPICZαA。其中酵母菌株是巴斯德畢赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等，優選為GS115。
應用本發明的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體或其組合，採用醫藥上可接受的載體，用於治療「TNF介導的疾病」，這類炎症性疾病包括但不限於炎症性腸炎(inflammatory bowel disease，IBD)包潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克隆氏病(Crohn′s disease，CD)；關節的炎症性疾病，包括骨關節炎、牛皮癬性關節炎和類風溼性關節炎；分泌性中耳炎；急性胰腺炎；病毒性心肌炎；牛皮癬；膿毒症和膿毒性休克；肝硬化；子宮內膜異位；多發性硬化；肌病(例如肌蛋白代謝，尤其是膿毒症中)；急性肺損傷、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；全身炎症反應症候群(SIRS)；缺血性損傷，包括小腦缺血(例如由創傷引起的腦損傷、癲癇、出血或中風，每種都可能導致神經變性)；充血性心力衰竭；再灌注損傷；移植排斥反應；或由勞累、扭傷、軟骨損傷、創傷、整形外科、感染或其他疾病產生的炎症反應。尤其適合治療「TNF介導的疾病」中的自身免疫性疾病，包括類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎、多發性硬化、牛皮癬、移植排斥反應、全身炎症反應症候群等炎症性疾病。
本發明的目的是通過以下措施來達到的1、克隆編碼人腫瘤壞死因子可溶性受體I和II(sTNF RI和sTNF RII)的基因本發明的人腫瘤壞死因子可溶性受體I和II(sTNFRI和sTNFRII)的編碼序列是用PCR法從人心肌細胞cDNA文庫中克隆得到的。人腫瘤壞死因子受體I基因全長4016鹼基對；蛋白編碼序列為第316至3451核苷酸片斷，全長3136鹼基對；可溶性受體sTNFRI的序列為第524至2063核苷酸片斷(Genomics 1992，13(1)，219-224)，全長1540鹼基對，其DNA序列及其編碼的胺基酸序列見序列1(SequenceNo.1)。人腫瘤壞死因子受體II基因全長4323鹼基對；蛋白編碼序列為90至2115核苷酸片斷，全長2026鹼基對；可溶性受體sTNF RII的序列為第156至1178核苷酸片斷(Genomics 1996，35(1)，94-100)，全長1023鹼基對，其DNA序列及其編碼的胺基酸序列見序列2(Sequence No.2)。
2、克隆編碼人免疫球蛋白IgG1Fc的基因本發明的人免疫球蛋白IgG1Fc基因的編碼序列是用PCR法從人心肌細胞cDNA文庫中克隆得到的。得到的全長696鹼基對的基因片斷包括了全部IgG1Fc區(第28至696核苷酸片斷)和部分鉸鏈區(第1至27核苷酸片斷)的編碼序列(Sequence No.3A)。中國人的IgG1Fc基因是將上述克隆到的IgG1Fc的基因的535位鹼基T點突變為C，這樣由密碼子TCC編碼的絲氨酸(Ser)就突變為密碼子CCC編碼的脯氨酸(Pro)(Sequence No.3B)(王海濤國家八六三計劃項目驗收自評估報告《人源抗-HBs全基因克隆及其表達研究》http//www.886688.com/863jt.htm)。
3、構建含有人腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因的酵母表達質粒。
按常規分子克隆方法，將PCR擴增的人腫瘤壞死因子可溶性受體編碼基因片斷和人免疫球蛋白IgG1Fc基因片斷用連接酶按設計要求經連接肽基因連接。再經一定的酶切之後，插入酵母表達載體pPICZαA(購自INVITROGEN)，使其與α-因子信號短肽表達成融合蛋白，所得表達質粒稱為pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n，其構建過程見圖5。
4、用pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n表達質粒轉化畢赤酵母GS115並篩選高效表達株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n。
5、高效表達株CS115/pPICZαA/(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n的培養與甲醇誘導表達。
將單菌落接種於BMGH培養液，加℃振搖培養過夜。次日轉接種於較大體積的同種培養液，30℃繼續培養至O.D600＝16-20。離心收集細胞，將細胞懸浮於BMMH誘導培養液，30℃，振蕩培養，每小時加入甲醇，使其最終濃度為1％。4天後離心收集上清。
6、人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的純化上述收集的上清經超濾濃縮至一定體積後，使其通過用PBS平衡的蛋白質A瓊脂糖柱，結合於蛋白質A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質以檸檬酸鹽溶液洗脫。用SDS-PAGE檢測其分子量大小及相對純度，凍幹，-70℃保存。
7、用鼠L929細胞檢測本發明所生產的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素對hTNF的中和活性作用，測活方法按徐春曉等的文獻(中華微生物學和免疫學雜誌，2000，20(3)132)方法進行，MMT顯色，測量A570。
附圖簡述圖1是編碼人TNFRI的DNA序列及胺基酸序列圖2是編碼人TNFRII的DNA序列及胺基酸序列圖3A是人FcDNA序列及胺基酸序列圖3B是中國人FcDNA序列及胺基酸序列圖4是連接肽序列。
圖5是巴斯德畢赤氏酵母表達載體的圖解說明。
圖6是利用本發明的巴斯德畢赤氏酵母表達載體系統複製人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素方案的圖解說明。
圖7是本發明的巴斯德畢赤氏酵母表達載體pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc的圖解說明。
圖8是本發明表達純化的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的聚丙烯醯胺電泳圖。
圖9是本發明生產的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素對人腫瘤壞死因子的抑制作用。
以下通過實施例對本發明作進一步說明實施例一編碼人腫瘤壞死因子可溶性受體sTNF RII基因的克隆根據已知的人腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRII的cDNA序列，設計併合成下列上下遊引物，其序列如下N15'-GAA TTC CAT ATG CTG CCG GCG CAG GTG GCA TTT AC-3』C15』-AC GGA TCC ACC GCC ACC GGG TAA GTG TAC TG-3，
上遊引物N1中引入EcoR 1酶切位點，下遊引物C1中分別引入BamHI酶切位點和胺基酸序列GlyGlyGlyGlySer的接頭。PCR擴增出sTNFRII，同時去掉信號肽，並在其羧基端引入短肽。PCR擴增反應體系為1μl人心肌細胞cDNA文庫，10×PCR緩衝液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下遊引物各1μl，加水至50μl。經95℃預變性5min後，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循環為94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 60s，共30個循環，最後72℃延伸10min。按標準操作程序純化PCR產物。所得純化PCR產物用EcoR1和BamHI雙酶切，經1％瓊脂糖凝膠電泳純化後得到的基因1038bp基因片段。
實施例二 編碼人免疫球蛋白IgG1Fc基因的克隆根據已知的人免疫球蛋白IgG1Fc的cDNA序列，設計併合成下列上下遊引物，其序列如下N25』-TA GGA TCC GGA GGT GGA GGT AGC GTT GAG CCC AAA TCT-3』C25』-AT CTC GAG TTA CTA CTG CGT GTA GTG GTTG-3』上遊引物N2中分別引入BamHI酶切位點和胺基酸序列GlySerGlyGlyGlyGlySer的接頭，下遊引物C2中引入XholI酶切位點。PCR擴增出IgG1Fc，並在其氨基端引入短肽GlySerGlyGlyGly GlySer，羧基端引入翻譯中止信號TAGTAA。PCR擴增反應體系為1μl人心肌細胞cDNA文庫，10×PCR緩衝液5μl，10mmol/LdNTP1μl，50μmol/L上、下遊引物各1μl，加水至50μl。經95℃預變性5min後，加入pfuDNA聚合酶2U。PCR循環為94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 90s，共30個循環，最後72℃延伸10min。按標準操作程序純化PCR產物。所得純化PCR產物用BamHI和XholI雙酶切，經1％瓊脂糖凝膠電泳純化後得到的基因711bp基因片段。
實施例三人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素酵母表達載體的構建將克隆得到的兩個基因片段用T4連接酶連接後得到人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因sTNFRII-IgG1Fc。用EcoR1和Not1雙酶切酵母表達載體pPICZαA質粒，將sTNFRII-IgG1Fc基因克隆入這兩種內切酶位點中，轉化大腸桿菌DH5α，篩選具有Zeocin耐藥性的轉化株，從這些耐藥株中提取質粒，用酶切和測序分析篩選得到含有人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素基因正確序列並與α-因子在同一閱讀框內的質粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。
實施例四高效表達人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達菌株的構建與篩選用限制性核酸內切酶SaC1切開環形表達質粒pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc使之線型化。將線型化了的pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc表達質粒轉化畢赤酵母株GS115，經同源重組得到表達人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達菌株GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc。篩選具有Zeoein耐藥性的轉化體。將所有的耐Zeoein轉化體分別接種於少量培養液並用甲醇誘導表達(具體方法詳見實施例五)。離心收集上清，用SDS-PAGE電泳檢測上清中所表達的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的量，從中篩選高表達株。
實施例五高效表達人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的巴斯德畢赤酵母表達菌株的培養與甲醇誘導將單個新鮮的畢赤酵母工程菌GS115/pPICZαA/sTNFRII-IgG1Fc接種於BMMH培養液，36℃，繼續培養至O.D.60016-20。離心收集細胞，將細胞懸浮於1/5原體體積的BMMH誘導液中，30～C，振蕩培養，每24小時加入甲醇使甲醇最終濃度為1％，四天後離心收集上清。取少量上清用15％SDS-PAGE電泳分析。如圖8中的「粗品」即未經純化的上清中有明顯的分子量為60KDa左右的蛋白帶，此為酵母表達後分泌至上清中的人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素。
實施例六 重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的純化將離心收集的上清經centracon plus 80(Millpore)超濾濃縮至一定體積後，使其通過用PBS平衡的蛋白質A瓊脂糖柱，結合於蛋白質A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質以檸檬酸鹽溶液洗脫。先後用含10mM、20mM和50mM的檸檬酸鹽溶液(pH3.0)洗脫，分別收集洗脫樣品，從各收集管中取出少許樣品進行電泳分析，結果見圖7。絕大部分重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素可被50mM的檸檬酸鹽溶液(pH3.0)洗脫。由此法所得到的重組人血管內皮細胞抑制素在SDS-PAGE上呈單一的分子量為60kd的蛋白帶(圖8)。將從蛋白質A瓊脂糖柱上所收集的含人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的蛋白溶液經PBS透析脫鹽後，凍幹，乾燥，-70℃保存，此為純化的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素。
實施例七 重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素活性檢測重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性表現為對TNF-α生物學活性的中和活性，TNF-α的活性測定採用最常應用的結晶紫染色法(FlickDA，Gifford GE.Comparison ofin vitro cell cytotoxic assay for tumor necrosisfactor.J Immunol Methods，1984，68167-175)，以鼠L929細胞株為測定細胞。常規製備96孔L929細胞單層，37℃5％二氧化碳培養8小時。純化後的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素用PBS稀釋，與0.2ng的人TNF-α37℃保溫2小時，用含放線菌素D的1640培養基二倍序列稀釋，每孔0.1ml，繼續培養20小時，MTT法測定每孔的光吸收值，計數得到的一組殺傷率與對應的稀釋倍數的對數值作圖，得出殘存TNF的活性，從而反映出本發明產品的生物活性(圖9)。從圖9所示結果可以看出，大腸桿菌表達的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較單純的可溶性受體高約一個數量級，本發明巴斯德畢赤酵母表達的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較大腸桿菌表達的高約一個數量級，CHO系統表達的腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素的活性較本發明巴斯德畢赤酵母表達的高約2～3倍。
權利要求
1.下式物質所代表的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體(Xa)m-L-Fc-L-(Xb)n其中m和n分別獨立地為0或1，至少有一個為1；其中Xa和Xb可以相同也可以不同，Xa和Xb為腫瘤壞死因子可溶性受體sTNFRI、腫瘤壞死因子結合蛋白TNF-BPI或其多肽，和/或sTNFRII、腫瘤壞死因子結合蛋白TNF-BPII或其多肽；其中Fc為免疫球蛋白IgG的Fc區；其中L為免疫學上無活性的接頭肽，選自的序列4-12(Sequence No.4-12)。
2.編碼權利要求1中任一物質的核酸序列。
3.編碼權利要求1中任一物質的胺基酸序列
4.一種生產具有生物活性的權利要求1中的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體的方法，其特徵在於採用酵母表達系統，所述方法包括以下步驟(a)在酵母表達載體中插入含有免疫學上無活性的接頭肽序列的編碼新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽的核苷酸序列，其中載體含有多個克隆位點；和(b)利用步驟(a)的載體轉化適當的酵母菌株，並且在適當的條件下培養酵母菌株生成新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白或多肽。及(c)用適當的純化方法處理步驟(b)的上清，提純新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其中步驟(c)純化方法為用PBS平衡的蛋白質A瓊脂糖柱純化，結合於蛋白質A瓊脂糖柱上的重組人新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素蛋白質以檸檬酸鹽溶液洗脫。
6.根據權利要求4所述的方法，其中表達載體包括質粒pPIC9K，pPIC3.5，pPIC9，pPICZαA，pMETαA、B、C等。
7.權利要求6所述表達載體為pPICZαA。
8.根據權利要求4所述的方法，其中酵母菌株是巴斯德畢赤氏(Pichiapastoris)酵母，包括GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。
9.權利要求8所述的巴斯德畢赤氏(Pichia pastoris)酵母為GS115。
10.根據權利要求1或權利要求4--9中所述的方法生產的新型腫瘤壞死因子可溶性受體免疫粘附素融合蛋白及其多聚體與藥學上可接受的載體構成的組合物，用於製備治療TNF介導的疾病的藥物。
11.根據權利要求10中所述的組合物，用於製備治療「TNF介導的疾病」中的自身免疫性疾病的藥物，包括類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎、多發性硬化、牛皮癬、移植排斥反應、全身炎症反應症候群等炎症性疾病。
全文摘要
本發明涉及重組人腫瘤壞死因子可溶性受體和/或多肽免疫粘附素及用巴斯德畢赤酵母表達系統表達生產的方法，本發明還包括利用本發明所生產的融合蛋白或其組合物用於治療需要中和TNF－α的有害作用的疾病即「TNF介導的疾病」方面的應用。
文檔編號A61P37/00GK1490335SQ0213086
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月14日 優先權日2002年10月14日
發明者張慶勇 申請人:張慶勇